Das Protokoll wurde für die Herstellung von Jagdvarianten in voller Länge im niedrigen Milligrammbereich entwickelt. Es ermöglicht konsistent hochwertiges Protein, das für Huntington-Forscher unerlässlich ist. Demonstrieren wird das Verfahren von Michael Harris, einem Forscher des Curia-Labors.
Beginnen Sie mit der Zugabe von einem Gramm Polyethylenimin 25 K zu einem Liter endotoxinfreiem Wasser und rühren Sie gut um. Stellen Sie den pH-Wert mit 100-Millimolar-Salzsäure auf 2,0 ein und rühren Sie, bis sich das gesamte Polyethylenimin aufgelöst hat. Stellen Sie dann den pH-Wert mit einer 100-Millimolar-Natronlauge auf 7,0 ein und leiten Sie die Lösung durch einen 0,2-Mikrometer-Filter.
Machen Sie Aliquots der gefilterten Lösung und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius. Vermehrung von HEK293-Zellen im Wachstumsmedium, ergänzt mit Penicillin-Streptomycin, in einem befeuchteten Shaker-Inkubator bei 37 Grad Celsius, 90 U/min, 5% Kohlendioxid für 18 bis 24 Stunden. Einen Tag vor der Transfektion die Zellen bei einer Dichte von etwa 1,2 x 10 zu den sechsten Powerzellen pro Milliliter in zwei Litern Wachstumsmedium in einem Fünf-Liter-Erlenmeyerkolben verdünnen und 18 bis 24 Stunden inkubieren.
Messen Sie am Ende der Inkubation die Zelldichte und Lebensfähigkeit mit einem automatischen Zellzähler gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nach der Berechnung der Menge an Polyethylenimin und Plasmid, die für die Transfektion erforderlich ist, Polyethylenimin und Plasmid einzeln in 100 Milliliter PBS verdünnen und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann mischen Sie das verdünnte Plasmid und Polyethylenimin durch vorsichtiges Schwenken und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
Die Mischung in die Zellkultur geben und durch Schwenken vorsichtig mischen. Lassen Sie nun die Zellen 24 Stunden lang wachsen. Am nächsten Tag Natriumbutyratlösung zu einer Endkonzentration von zwei Millimolar Antiklumpen und Antischaummittel im Verhältnis 1: 1, 000 in die Kultur geben und die Zellen im befeuchteten Shaker-Inkubator für 48 Stunden inkubieren.
Nach der Messung der Zelllebensfähigkeit und -dichte ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 2.000 G für 30 Minuten und lagern Sie das Zellpellet vor der Reinigung bei minus 80 Grad Celsius. Für die Anti-FLAG-Reinigung mit FPLC packen Sie 12 bis 25 Milliliter Anti-FLAG-Harz mit einer Durchflussrate von vier Milliliter pro Minute unter Verwendung von Puffer A auf eine leere Säule und passen Sie die Höhe des Kolbens an, um den Spalt zwischen dem Ende des Kolbens und dem Harzbett zu entfernen. Als nächstes suspendieren Sie das aufgetaute Zellpellet in kaltem Lysepuffer und leiten die Zellsuspension einmal durch einen High-Shear-Homogenisator bei 1.000 Pfund pro Quadratzoll Druck.
Mit einer Zentrifuge, die mit einem kompatiblen Festwinkelrotor ausgestattet ist, klären Sie das Lysat bei 20.000 G für eine Stunde. Programmieren Sie FPLC unter dem Methodenfenster, laden Sie das geklärte Lysat über die Probenpumpe und waschen Sie die Säule mit den gewünschten Säulenvolumina von Puffer A, B, C, D und Elutionspuffer, wie im Textmanuskript beschrieben. Sobald der Lauf beendet ist, analysieren Sie 10 Mikroliter der Spitzenfraktionen mit SDS-PAGE.
Kombinieren Sie die Peakfraktionen mit der gewünschten Reinheit und sparen Sie ca. 50 Mikroliter der kombinierten Eluate für die weitere SDS-PAGE-Analyse ein. Beginnen Sie mit der Äquilibrierung der SEC-Säule mit dem FPLC und laden Sie das Anti-FLAG-Eluat über einen 50-Milliliter-Superloop. Lassen Sie nach dem Ausführen des SEC-Puffers die SEC-Trennung über Nacht bei vier Grad Celsius erfolgen.
Vergleichen Sie das Elutionsprofil mit dem Standard-HTT-Elutionsprofil, um die Monomer-, Dimer- und höhergeordneten oligomeren Peaks zu unterscheiden. Poolen Sie die monomeren HTT-Fraktionen basierend auf dem Elutionprofil der SEC-Säule und, falls gewünscht, bündeln Sie die höhergeordneten oligomeren und dimeren HTT-Fraktionen getrennt. Das gepoolte HTT-Protein wird mit einem 100-Kilodaltonnen-Zentrifugalkonzentrator bei vier Grad Celsius konzentriert.
Nach Berechnung der Proteinkonzentration aliquot weniger als 100 Mikroliter des gereinigten HTT-Proteins in einem kryosicheren Mikrozentrifugenröhrchen. Die Aliquots mit flüssigem Stickstoff einfrieren und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Führen Sie alle analytischen SEC-MALS bei vier Grad Celsius auf dem HPLC-System durch, gekoppelt mit einem UV-Detektor, einem Mehrwinkel-Lichtstreudetektor, einem differentiellen Brechungsindexdetektor und verwenden Sie 0,185 als Brechungsindex-Inkrement für HTT.
Reinigen Sie die Pumpe und die Detektoren mit gefiltertem HPLC-Wasser und verbinden Sie die UHPLC-Säule mit dem System. Äquilibrieren Sie die Säule mit gefiltertem Wasser und dann SEC-MALS Puffer, bis alle Detektorsignale die Basislinie erreichen. Injizieren Sie zwei Mikroliter BSA-Lösung mit einer Flussrate von 0,3 Milliliter pro Minute für 15 Minuten pro Injektion.
Überprüfen Sie die Datenqualität, führen Sie Normalisierung, Spitzenausrichtung und Banderweiterungskorrektur basierend auf dem BSA-Profil durch und erstellen Sie eine Vorlage für die folgenden HTT-Beispielläufe. Eine Durchstechflasche der FL Q23-HTT-Probe in einem Wasserbad bei Raumtemperatur mit einem Schwimmer schnell auftauen. Filtern Sie die HTT durch einen 0,1-Mikrometer-Spinfilter.
Injizieren Sie zwei bis vier Mikroliter der HTT-Probe und laufen Sie 15 Minuten bei vier Grad Celsius bei einer Flussrate von 0,3 Milliliter pro Minute. Analysieren Sie die chromatographischen und Lichtstreudaten mit der mitgelieferten Software und erstellen Sie ein Zimm-Diagramm, um die gewichtsgemittelte Molekülmasse für jeden Peak zu bestimmen. In der vorliegenden Studie wurde unter Verwendung eines zweistufigen Säulenverfahrens eine Reinheit von mehr als 95% für HTT erhalten, und die Hauptverunreinigung war Chaperon Hsp70, das durch ausgiebiges Waschen mit Magnesiumchlorid und ATP während des Anti-FLAG-Affinitätsreinigungsschritts eliminiert wurde. Eine Überexpression von FL HTT kann zu einer Fragmentierung des Proteins führen, aber FL Q23-HTT, das nach dem als einzelne Bande aufgelösten Verfahren mit dem korrekten Molekulargewicht von 350 Kilodalton hergestellt wird, zeigt keine Fragmentierung.
Die Western-Blot-Analyse nach der Reaktion von Antikörpern mit FL Q23-HTT zeigte, dass das Protein ohne signifikante nachweisbare Trunkierungen isoliert wurde, da keine zusätzlichen fragmentbezogenen Banden beobachtet wurden. FL HTT Poly-Q Längenvarianz, Q23, Q48 und Q73 reagierten wie erwartet im Western Blot und zeigten ein progressiv stärkeres Signal für den poly-Q-gerichteten monoklonalen Antikörper MW1, der mit zunehmender Q-Länge korreliert. Unter den getesteten HPLC-Säulen zeigte die SEC-Säule eine ausreichende Auflösung zwischen dem HTT-Monomer und dem Dimer, so dass molare Massen unterschieden werden konnten.
Gereinigtes FL HTT von SEC zeigte mehrere Banden, die den Oligomerisierungszuständen entsprechen, was auf das Vorhandensein mehrerer hydrophober Flecken zurückzuführen sein könnte, die zur Bildung von höhergeordneten Oligomeren während der Migration innerhalb des Gels beitragen. Gereinigtes HTT zeigte drei Hauptbanden auf blauem nativem PAGE mit einem geschätzten Molekulargewicht von 643, 927 und 1.070 Kilodalton, die wahrscheinlich die monomeren, dimeren und trimeren Arten von HTT repräsentieren. Der richtige Umgang mit gereinigtem Huntingtin ist unerlässlich, um die Bildung von hochgeordneten Oligomeren in löslichen Aggregaten zu vermeiden.
Es ist unerlässlich, dass der Endbenutzer schnell arbeitet, um die Probe vor dem Schockgefrieren in vorgekühlte Röhrchen zu dosieren. Langzeitstabilitätstests können an Proben durchgeführt werden, die über einen längeren Zeitraum bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Wiederholte HPLC SEC-MALS-Analysen bestätigen, ob sich der monomere Gehalt der Probe verändert hat.
