Name: controllable ion channel expression through inducible transient transfection
Uploaded: 2017-02-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
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Diese Arbeit wurde von der Israel Science Foundation [Grants 1721/12, 1368/12 und 1444/16] (AP). AP ist mit Brettler Center und David R. Bloom Center, School of Pharmacy, The Hebrew University of Jerusalem angeschlossen.

1. Ligieren des Gens von Interesse in die Reprimierbare Site of Vector <ol><li> Erhalten Sie induzierbaren Vektors wie pcDNA5 / FRT / TO oder pcDNA4 / TO. </li><li> Analyse das Gen von Interesse für alle potentiell anfällig Restriktionsstellen in der Mitte des Gens, der auch in der multiplen Klonierungsstelle des ausgewählten Vektor 4 durch in silico DNA - Analyse - Software gezeigt werden. </li><li> Unter Verwendung von Standard Überlappungs - PCR - Techniken 4, flankieren das Gen von Interesse mit zwei ausgewählten Restriktionsenzym - Erkennungsstellen (die in dem Gen von Interesse zu finden sind), die erste vor dem Startcodon eingeführt ist , und das zweite nach dem Stopp - Codon. </li><li> Digest sowohl den Vektor und Insert mit Restriktionsenzymen (ausgewählt in Schritt 1.2) bei Arbeitstemperatur &quot;Enzyme für eine Stunde, gefolgt von der Zugabe einer Einheit Kalbsdarm-Phosphatase (CIP), um den Vektor Reaktion nur 30 Minuten, um sich selbst zu vermeiden, Ligation. </li><li>Laden die verdaute DNA auf ein 1% iges Agarosegel und trennen die abgespaltenen Segmente durch Elektrophorese 9. </li><li> Mit UV-Licht, Schnitt mit einem Messer die Stücke des Gels die gewünschten Segmente des Vektors enthält, und fügen Sie ligiert werden. </li><li> Extrahieren, um die DNA-Segmente aus dem Agarosegel Stücke (kommerziell erhältliche DNA-Extraktion Kits) und messen ihre Endkonzentration von Spektrophotometer bei 260 nm. </li><li> Ligieren des Gens von Interesse in den ausgewählten induzierbaren Vektors bei Raumtemperatur für 20 Minuten unter Verwendung von T4-Ligase-Enzym. Um die Wahrscheinlichkeit des Einsatzes Ligieren mit dem Vektor zu erhöhen, verwenden Sie einen 3: 1-Molverhältnis des Einsatzes: Vektor. Zur Kontrolle bereiten eine Ligatur Reaktion, die nur den Vektor umfasst. </li><li> Bei bakteriellen Transformation, mit 10 ng Vektor allein und Vektor + Gen in 50 &amp; mgr; l kompetente E. coli. Inkubieren der Röhrchen auf Eis für 30 Minuten, gefolgt von 45 Sekunden Inkubation bei 42 ° C. Ab sofort setzen zurückauf Eis für zwei Minuten und die transformierten Bakterien auf 500 &amp; mgr; l LB-Medium übertragen. bei 220 rpm bei 37 ° C unter Rühren eine Stunde lang inkubieren. </li><li> Zur Selektion erfolgreich transformierter Bakterien, Platte 100 ul jeder Reaktion auf einem vorbereiteten LB Agarplatte (wie in 1.9 beschrieben) , um das geeignete Antibiotikum (beispielsweise 100 &amp; mgr; g / ml Ampicillin bei Verwendung pcDNA4 / TR). </li><li> Erlauben über Nacht bei 37 ° C wachsen. Platten können sie in Kunststoffparaffinfilm durch dicht für bis zu zwei Wochen bei 4 ° C gelagert werden Umhüllen. </li><li> Heben einzelne Kolonien eine 10 ul Spitze verwenden, und ermöglichen über Nacht in 3 ml LB + Antibiotika-Medium bei 37 ° C unter Rühren bei 220 Upm wachsen. Bakterien, die mit DNA von Interesse eingefroren werden können (-20 ° C) für die kurzfristige Lagerung durch den LB und Bakterien bei 11.000 xg zentrifugiert und der Überstand abgesaugt werden. Langzeitlagerung erfordert bei -80 ° C die Bakterien als Glycerinstamm einfriert. </li><li> Extrakt DNA through mini-prep und die Endkonzentration von Spektrophotometer bei 260 nm 5 messen. </li><li> Bestätigen des erfolgreichen Einsetzen des Gens von Interesse durch Sequenzierung des gereinigten Konstrukt 4. Alternativ diagnostischer Verdau des Konstrukts durch Restriktionsenzyme Elektrophorese der Schnittsegmente und bewerten ihre Präsenz und Länge können auch zu diesem Zweck verwendet werden , 4 zu trennen , verwenden. </li></ol> 2. Anzucht Zelllinien TetR Ausdruck <ol><li> Besorgen Sie sich eine Zellkulturlinie ein Tet-Repressor-Plasmid in ihre genomische DNA eingebaut beherbergen. Hierin wird das Protokoll unter Verwendung von humanen embryonalen Nierenzellen 293T (HEK-293T) beherberge pcDNA6 / TR Plasmid als Beispiel geschrieben werden. </li><li> Seed Zellen in 100 mm Gewebekulturplatte mit Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM), ergänzt mit 10% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 25 mM HEPES, pH 7,3 (hierin: Voll DMEM) und inkubiere O / N bei 37 &amp;# 176; C und 5% CO 2. Alle Arbeiten mit Zellen sollten in einer biologischen Haube unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. </li><li> Um die Expression von Tet-Repressor-Gen absaugen Medium und ersetzen Sie es mit Voll DMEM, ergänzt mit 5 ug / ml Blasticidin zu halten. Inkubiere Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Sobald Zellen 80 erreichen - 90% Konfluenz, aspirieren das Medium und die Zellen vorsichtig zweimal mit DPBS waschen (ohne Calcium und Magnesium) erwärmt auf 37 ° C. </li><li> Um ohne dass eine mechanische Beschädigung die Zellen vorsichtig heben, brüten die Kultur in DMEM mit Trypsin 0,05% erwärmt auf 37 ° C für 1,5 min. </li><li> Blockieren Sie die Trypsin Aktion mit einem gleichen Volumen von Voll DMEM. Pipette vorsichtig nach oben und unten, um die Zellen zu heben und sie in ein steriles Röhrchen übertragen. </li><li> Zentrifugieren der Zellen bei 200 xg für 5 min. </li><li> Den Überstand aspirieren und ersetzen Sie es mit 1 ml Voll DMEM. Pipette, um die Lösung mit den Zellen auf und ab, bis keinZellklumpen zu sehen. Zählen und Berechnen der Anzahl der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers. </li><li> Samen von 1 bis 2 x 10 6 Zellen in 100 mm Gewebekulturschale mit 12 ml Voll DMEM mit 5 ug / ml Blasticidin. Teilen Sie die Zellen zweimal in der Woche, da sie 90% Konfluenz erreichen. </li></ol> 3. Transfektion der Plasmid von Interesse in Zellen <ol><li> Unter Verwendung des gleichen Verfahrens von Teilen von Zellen , wie oben beschrieben, Übertragungszellen in die Vertiefungen in einer 12-Well - Platte , hergestellt mit 0,9 ml Voll DMEM, ausreichend 50% konfluent zu machen (~ 200.000 Zellen) und Inkubation über Nacht bei 37 ° C in einem CO 2 Inkubator. </li><li> Bereiten Sie eine Transfektionsgemischs mit pcDNA4 / an das Gen von Interesse enthält, ein inertes Plasmid, das die Gesamt-DNA-Menge auf 1 &amp; mgr; g zu bringen (falls nötig), 3 ul Lipid Transfektionsreagenz und DMEM auf das endgültige Volumen von 100 &amp; mgr; l zu machen. Die optimale Menge an Plasmid-DNA verwendet werden, variiert stark, wie unterschiedliche Proteine ​​in unterschiedlichen Effizienz exprimieren. Für electphysiologische Experimente, umfassen EGFP in Säugetier - Expressions Plasmid in der Cocktail - Transfektion , um Zellen sichtbar zu machen , die erfolgreich Transfektion 4 unterziehen. </li><li> Inkubiere das Transfektionsgemisch bei RT für 30 min. </li><li> Transfektion von Zellen durch Pipettieren der Transfektionsgemisch tropfenweise auf den plattierten Zellen in 12-Well-Platte und Rock die Platte kräftig eine homogene Dispersion von DNA und Transfektionsreagenz zu gewährleisten. Zellen sollten zum Zeitpunkt der Transfektion ~ 80% konfluent sein. </li><li> Inkubieren der transfizierten Zellen O / N bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Bestätigen Sie, dass die Zellen durch die Beobachtung des Fluoreszenzsignals von EGFP unter UV-Lampe am nächsten Morgen erfolgreich transfiziert wurden, wenn die Elektrodurchführen. </li></ol> 4. Überzug Zellen auf Poly-D-Lysine (PDL) Deckgläser / Wells <ol><li> Sterilisieren 12 mm Deckgläser durch mit 70% Isopropyl Ethanollösung Begießen. Trockene und legen Sie eine einzelne coverslip in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte für elektrophysiologische Aufzeichnung. </li><li> Pipette eine Lösung von 0.1 - 0.2 mg / ml PDL-Lösung auf jedes Deckglas oder auch eines Kalzium-Imaging-Kammer. </li><li> Man lässt 30 min bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator zu sitzen. </li><li> Waschen Sie mit Zellkultur doppelt destilliertem Wasser (DDW) dreimal, zwischen jedem Wasch Absaugen. Nach dem letzten Waschen gründlich trocknen und lassen bei RT zu sitzen. </li><li> Für die Elektro füllen jede Vertiefung mit einem PDL beschichtet Deckglas mit 500 &amp; mgr; l Voll DMEM auf 37 ° C erwärmt. </li><li> Führen Sie die gleiche Methode, um die transfizierten Zellen spalten, wie oben beschrieben. Nach Resuspendieren der Zellen nach der Trypsin-Behandlung und Blockierung, die Übertragung 80 &amp; mgr; l Zellen (oder ca. 30.000 Zellen) zu der Mitte jedes PDL beschichteten Deckglas für die Elektro Aufnahme. Lassen Sie Zellen für mindestens 1,5 Stunden absetzen oder über Nacht in einem 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C inkubiert. </li><li> Für Calcium Imaging Transfer und Stelle 20 &amp; mgr; l Zellen (etwa 20.000 Zellen) in die Mitte jedes Kalzium PDL beschichtet Bildgebung gut. Lassen Sie Zellen für mindestens 30 Minuten absetzen und fügen 180 ul Voll DMEM in jede Vertiefung. </li></ol> 5. Induzierende Genexpression <ol><li> Bereiten Sie eine Doxycyclin Stammlösung von 1 mg / ml in DDW gemäß den Anweisungen des Herstellers. Halten Sie Stammlösung vor Licht geschützt bei 4 ° C für bis zu 3 Wochen. Für die langfristige Lagerung halten Doxycyclin Stammlösung bei -20 ° C. </li><li> Bereiten Sie eine frische 2 ug / ml (Elektrophysiologie) oder 3 ug / ml (Kalzium-Imaging) Doxycyclin-Lösung in Full DMEM und warm es auf 37 ° C. </li><li> Für elektrophysiologischen Ableitungen, Pipette 500 ul von 2 pg / ml Doxycyclin-Lösung in jede Vertiefung eine endgültige Konzentration von 1 ug / ml Doxycyclin zu machen. Für Calcium Imaging, 100 &amp; mgr; l von 3 ug / ml Doxycyclin-Lösung in jede Vertiefung eine endgültige Konzen zu machention von 1 &amp; mgr; g / ml Doxycyclin. Schreiben Sie die Stunde der Induktion nach unten. </li><li> Inkubieren Sie für die gewünschte Zeitdauer für die Induktion bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> 6. Kalibrieren Chronologie der Proteinexpression <ol><li> Kalibrieren Proteinexpression durch Calcium Imaging 5, 10 <ol><li> Bereiten Ringerlösung (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 2 mM MgSO 4, 20 mM HEPES, pH eingestellt auf 7,4 mit NaOH) und erwärmen auf 37 ° C. </li><li> Bereiten Konzentrationen von Kanal-Agonisten in Ringer-Lösung zu sättigen. Da die Menge des Agonisten verdünnt wird, wenn sie den Calcium-Bildgebungskammern mit den Zellen und der extrazellulären Lösung, die doppelte Menge der gewünschten Endkonzentration des Agonisten zugegeben. Dies macht auch die Menge an Badlösung in jeder Vertiefung kritisch zu steuern. </li><li> Eine Lösung aus nichtionischen F-127 20% W / V in DMSO. Die Lösung wird auf 40 ° C bis nichtionogene F-127 gelöst ist. Bewahren Sie die nicht-ionischen F-127-Lösung bei RT und erwärmen auf 40 ° C vor dem Gebrauch. Nichtionogene F-127 wird verwendet dispergieren acetoxymethyl (AM) Ester von fluoreszierenden Ionenindikatoren wie Fura-2 in wässrigen Lösungen zu helfen. </li><li> Absaugen Medium und ersetzen Sie es mit Fura-02.00 Ladelösung (Ringer-Lösung, ergänzt mit 2 - 3 uM Fura-02.00, 0,02 mg / ml nicht-ionisches F-127 und 10 mM D-Glucose). </li><li> Inkubieren für 60 min bei RT im Dunkeln. </li><li> Absaugen Fura-02.00 Lösung und waschen Sie die Zellen mit Ringer + 10 mM D-Glucose-Lösung extrazelluläre Farbstoff zu entfernen. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. </li><li> Lassen Sie 200 ul Ringer + 10 mM D-Glucose-Lösung in jede Vertiefung und Inkubation für 30 min bei RT im Dunkeln. </li><li> Legen Kammer auf der Bühne über dem Mikroskop Nasenstück und befestigen Sie es mit Halter. </li><li> Schalten Sie die Lampe, Kamera und Mikroskop und wählen Sie Fura-2-Filter-Emission bei 510 nm wav zu erkennenelength. </li><li> Stellen Sie für die gewünschte Vergrößerung und Fokussierung Zellen im ausgewählten Bereich. </li><li> Im Dunkeln, Hintergrundlicht subtrahieren und Belichtungszeit einstellen. </li><li> Festlegen der Bild Sampling mit der gewünschten Geschwindigkeit und Rekordfluoreszenzantwort von Fura-2 beladenen Zellen durch Anregen sie bei 340 und 380 nm Wellenlänge. Das Verhältnis von 340/380 Signale ist ein Indikator für die intrazelluläre Ca 2+ -Konzentration und damit auch für TRPV1 Aktivität. </li><li> In 2 uM Capsaicin in 200 &amp; mgr; l Ringer-Lösung durch Pipettieren eine endgültige sättigenden Konzentration von 1 &amp; mgr; M Capsaicin zu schaffen, um die Expression von TRPV1 zu bewerten. </li><li> Analysieren TRPV1 Reaktion gemäß Induktionszeit und bestimmen Protokoll für das Protein von Interesse. </li></ol></li><li> Einstellen Protein Expression in heterologen Systemen die gesamte Zellkonfiguration der Patch - Clamp - Technik unter Verwendung von 4, 11. <ol><li> bereiten ter Badlösung aus (mM) 140 NaCl, 2,3 KCl, 2 MgSO 4, 5 HEPES und 5 2- (N-Morpholino) ethansulfonsäure (MES), eingestellt auf pH 7,4 mit NaOH. </li><li> Bereiten Konzentrationen von Kanal-Agonisten in der extrazellulären Lösung zu sättigen. </li><li> Ziehen Glaselektroden mit einem Innendurchmesser (ID) von 1,10 mm und Feuerpolitur auf einen Widerstand von 2 bis 4 MOhm. </li><li> Bereiten einer Pipettenlösung (mM) 130 KCl, 4 NaCl, 2 MgSO 4, 0,5 CaCl 2, 1 EGTA und 10 HEPES , eingestellt auf pH 7,2 mit KOH. Filtern Sie die Pipettenlösung vor der Verwendung. Vor jedem Versuch, eine einzelne, feuerpolierte Glaspipette durch Eintauchen der Spitze in der Pipettenlösung für mindestens eine Minute lang gefüllt ist zurück, und dann geschmolzen und gedehnt Spitze mit einer Spritze mit der gleichen Pipettenlösung gefüllt werden. </li><li> Heben Sie vorsichtig mit einem einzigen PDL beschichtet Deck mit den plattierten Zellen aus dem Bohrloch zu einer 35 mm Petrischale aus Kunststoff mit etwa 2 ml Badlösung bei RT gefüllt. Beachten Sie unter epi-Fluoreszenzmikroskop. </li><li> Suchen Sie ein EGFP positive Zelle, wie mit dem epifluoreszenten Mikroskop sichtbar gemacht, auf dem vorbereiteten Deckglas und dem Zentrum der visualisierten Bereich bewegen. </li><li> Bringen Sie die gefüllte Pipette auf die Pipettenhalter des Mikromanipulators und Injizieren einer kleinen Menge von Überdruck in das System Kontamination der intrazellulären Pipettenlösung zu vermeiden. Senken sie knapp über dem GFP - positive Zelle, für die richtige Widerstand zu prüfen. </li><li> Da die Pipette in die Zelle berührt, eine kleine Menge von Unterdruck, um eine GOhm Dichtung zwischen der Glaspipette und Zellmembran zu schaffen anzuwenden. </li><li> Mit einer kurzen, scharfen Impuls der Saug-, brechen die Zellmembran, so dass die Pipette in Kontakt mit den intrazellulären Inhalt der Zelle zu kommen. </li><li> Schalten Sie den Verstärker-Modus ganze Zelle, und senken Sie die Bessel-Filter und Ausgangsverstärkung auf 1 - 5 kHz und 0.5α sind. </li><li> Notieren Sie sich die aktuelle Antwort auf die sättigendenKonzentrationen von Kanal-Agonisten durch Spannungsrampen oder spaltfreie Protokoll. </li><li> Da die Expression Effizienz zwischen verschiedenen Proteinen verändern, wiederholen Sie die Aufnahmen unterschiedliche Induktions Länge Zeiten. </li></ol></li><li> Die Bestimmung ideale Induktionszeit für einzelne Kanalaufnahmen 4. <ol><li> Eine Lösung aus (mM) 150 Na-Gluconat, 15 NaCl, 5 EGTA, und 10 HEPES, eingestellt auf pH 7,4 mit NaOH, als Pipettenlösung. Für die Bad-Lösung, verwenden Sie die Lösung aus Schritt 6.2.1. </li><li> Wiederholen ganze Zelle Verfahren unter Verwendung von ID 0,86 mm Glaspipetten feuerpoliert auf einen Widerstand von 10 bis 12 M &amp; Omega; und legen Potential halten mV bis -40. </li><li> Erstellen Sie eine Dichtung auf der Membran wie zuvor beschrieben, und die Membran bersten. </li><li> Mit dem Mikromanipulator, heben Sie die Pipette mit der Membranfleck weg von der Zelle. </li><li> Positionieren Sie das Perfusionssystem direkt neben der Pipette mit dem Membran-Patch. </li><li> Lower tBessel er Filter und Ausgangsverstärkung auf 2 - 5 kHz und 10α sind. </li><li> Perfundieren Konzentrationen von Agonisten auf die Membranscheibe sättigt, Auswerten, ob der Patch einen oder mehrere Kanäle enthält gemäß der Antwort. </li><li> Analysieren Sie die Anzahl der Einzelkanal-Patches erfolgreich gegen die Induktionszeit auf Zellen angewendet aufgezeichnet. Stellen Sie die Induktionszeit entsprechend den gewünschten Ergebnissen. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Transfection ist ein weit verbreitetes Protokoll für die Proteinexpression und Forschung, mit vielen verschiedenen Variationen Ausdruck Konsistenz und Stabilität zu verbessern. Transient Transfektionsreagentien bieten eine einfache, leicht zu verwendende Protokoll, wo die Zelle und Protein von Interesse innerhalb weniger Stunden analysiert werden können, um über Nacht aus der Zeit der Transfektion. Leider kann dieser Ansatz unberechenbar sein , wenn die Art der Analyse 2 ein einheitliches Niv...

Heterolog Systeme exprimierenden ist eines der am häufigsten verwendeten Techniken 1 eine Vielzahl von Zellfunktionen zu untersuchen. Ihre geringe endogene Proteinprofil, minimale Wartungsanforderungen, zuverlässige Wachstum und die Fähigkeit zur Aufnahme und zum Ausdruck bringen Fremd - DNA haben Zelllinien wie menschliche embryonale Nieren (HEK293) und chinesischen Hamsters (CHO) hergestellt fast wesentlich für die biologische Forschung 2, 3. Forschungsbereiche mit heterologe Systeme umfassen Membranproteine, intrazelluläre Signal und enzymatische Aktivität. Nach der Transfektion von Fremd - DNA in die Zelle, kann viele verschiedene Formen der Analyse durchgeführt werden, einschließlich der Elektrophysiologie, ratiometrisch Calcium Imaging, Western Blot, etc. 4, 5. Aufgrund der Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten für die heterologe Expressionssysteme, viele different Reagenzien und Produkte wurden 6 dieser Zellen und ihre Qualitäten zu verwenden , entwickelt. DNA-Abgabesysteme, die vorübergehend oder dauerhaft von Fremd-DNA in die Zellen integrieren exogene Protein zu untersuchen hat für die biologische Forschung eine der beliebtesten und nützlichsten Werkzeuge geworden. Genauer gesagt transient in einer Zelle Transfizieren DNA wird als einfache, gerade nach vorne Prozess, der erfordert relativ wenig Zeit und Materialien verwendet. Darüber hinaus ist die Erfolgsrate der Zellen , die die Transfektion unterzogen 7 hoch. Diese Technik ist sehr zuverlässig , wenn sie mit einem Markergen , wie grün fluoreszierendes Protein (GFP) kombiniert wird , und kann für viele verschiedene Techniken , wie Calcium Abbildungs- und Elektrophysiologie 5 verwendet werden. Doch leider kommt mit einigen großen Gefahren DNA in Wirtszellen transient exprimieren, nicht im geringsten, dass das Expressionsniveau pro Zelle unzuverlässig ist. Die Anzahl der Kopien von Plasmid-DNA u gemachtp pro Zelle ist unkontrollierbar, so der Ausdruck zwischen den einzelnen Versuchen 2 stark variieren kann. Dieses Problem wird bedeutsam, wenn entweder versuchen, physiologischen Bedingungen zu replizieren, oder präzise Techniken der Datenerhebung durchführen. Als Lösung für die erwähnt haben Komplikationen oben stabile Transfektion Protokolle entwickelt worden, bei dem ein Gen von Interesse in das Genom einer Zelle unter der strengen Kontrolle eines induzierbaren Promotors eingesetzt werden kann, wie beispielsweise einem Tetracyclin-Repressor-Expressionssystem, gewährleistet eine einzige Kopie des Plasmids integriert in das Genom von jeder Zelle und wird erst nach Induktion des Transkriptionsmechanismus, beispielsweise in Gegenwart von Doxycyclin ausgedrückt. Während dies die Hindernisse inkonsistenter Proteinexpressionsniveaus löst, verliert diese Methode, um die Bequemlichkeit der schnellen und relativ einfaches Protokoll von transienten Transfektionen. eine stabile Zelllinie zur Festlegung dauert wenigstens einige Wochen in which muss man eine Tötung Kurve gesetzt durch spezifische Antibiotika kalibrieren die Proteinexpression zu erhalten und die Integration des Vektors sicherzustellen und geschickt wählen und Zellkolonien wachsen. Insgesamt dauert dies deutlich mehr Zeit und Aufwand mit einer niedrigeren Erfolgsquote 8. Hier stellen wir ein Zwischenprotokoll, das auf den Stärken der beiden bekannten Transfektion Optionen zieht eine einfache und effektive Möglichkeit zur Verfügung zu stellen, um die Expressionsniveaus in jeder induzierbaren Zelllinie zu steuern. Während Zellen, die mit einem induzierbaren Tet-System beibehalten wird, transfizieren wir transient unsere Gen von Interesse, Transient Receptor Potential Kationenkanal-Unterfamilie V Element 1 (TRPV1), in einen Vektor ligiert, der homolog mit dem Repressor-System zu kombinieren. Auf diese Weise kann das Gen in die Zellen eingeführt werden, ohne zu exprimieren beginnen. Nur mit der Zugabe von Doxycyclin beginnt das Gen zu exprimieren, uns erlaubt, die Mengen an Protein expr zu kalibrierenITZUNG nach der Technik oder in physiologischen Bedingungen beobachtet Ebenen. Unser Protokoll vermeidet auch langwierige Komplikationen im Zusammenhang mit einer stabil exprimierenden Zelllinie zu erzeugen. Wir beginnen mit den wechselnden Ebenen der TRPV1-Aktivierung in Kalzium-Imaging von nichtinduzierten über vier Stunden Induktion zeigt und wie der Anstieg der intrazellulären Kalziumspiegel korreliert. Wir dupliziert dann das Protokoll in der gesamten Zellkonfiguration der Patch-Clamp-Technik, zeigt die zunehmende Strom mit der Zeit der Induktion erhöht wird. Schließlich präsentieren wir Beispiele für Einkanal Elektro Aufnahmen und zeigen, dass diese Technik für kontrollierte Expression besonders nützlich ist, wenn für eine genaue Datenerfassung auf Basis von einzelnen Einheiten des Proteins suchen. Durch unser Protokoll, bieten wir eine bequeme Möglichkeit, Protein-Expression in heterologen Systemen zu steuern, während lange Zellkultur Komplikationen vermieden werden, so dass ein Weg, um Bedingungen zwischen den Experimenten zu steuern und bieten mowieder reproduzierbare Ergebnisse.

<table><tbody><tr><td>pcDNA&amp;trade;4/TO Mammalian Expression Vector</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V102020</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA&amp;trade;5/TO Mammalian Expression Vector</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V103320</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick PCR Purification Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K310001</td><td></td></tr><tr><td>Swift&amp;trade;&amp;nbsp;MaxPro Thermal Cycler</td><td>Esco&amp;nbsp;</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Restriction Enzymes</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>ER0501</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick Gel Extraction Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>One Shot&amp;reg; TOP10 Chemically Competent &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>C404006&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin (Sodium), USP Grade</td><td>Gold Bio</td><td>A-301-5</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone for microbiology</td><td>Merck</td><td>6.19305E+13</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>BD worldwide</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>SIF6000R Incubated Shaker</td><td>LAB COMPANION</td><td>45H118</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin&amp;reg;plasmid</td><td>Macherey Nagel</td><td>740588.25</td><td></td></tr><tr><td>MS 300V Power Supply</td><td>Major Science</td><td>MP-300V</td><td></td></tr><tr><td>Owl&amp;trade; EasyCast&amp;trade; B1A Mini Gel Electrophoresis System</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>B1A</td><td></td></tr><tr><td>T-REx&amp;trade;-293 cell line</td><td>Invitrogen</td><td>R710-07</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x), liquid (high glucose)</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF&amp;reg;</td><td>NEB</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>ApaI</td><td>NEB</td><td>R0114S</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart&amp;reg; Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA&amp;trade;6/TR&amp;nbsp; Mammalian Expression Vector</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V102520</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, E.U.-approved, South America origin</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td><td>Biological Industries</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM)</td><td>Biological Industries</td><td>03-022-1B</td><td></td></tr><tr><td>Heracell&amp;trade; 150i CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>51026406</td><td></td></tr><tr><td>MSC-Advantage&amp;trade; Class II Biological Safety Cabinet</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>51025411</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidine S hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15205-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate-buffered Saline (DPBS) Modified, without calcium chloride and magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Double Neubauer Ruled Metallized Hemacytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TransIT&amp;reg;-LT1 Transfection Reagent</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>glass coverslips, #1 thickness, 12 mm diameter round</td><td>Knittel Glass</td><td>GG-12</td><td></td></tr><tr><td>BioCoat&amp;trade; Poly-D-Lysine (PDL)</td><td>Corning</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>Water, Cell Culture Grade</td><td>Biological Industries</td><td>03-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2, AM ester</td><td>Biotium</td><td>BTM-50034</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic&amp;reg; F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;-Slide 8 Well</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>(E)-Capsaicin</td><td>Tocris</td><td>462</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX70 Fluorescence Microscope</td><td>Olympus</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DG-4 Wavelength Switcher</td><td>Sutter Instruments</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera</td><td>QImaging</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software</td><td>Molecular Devices</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Thin Walled Borosilicate Tubing</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-110-7.5HP</td><td></td></tr><tr><td>Standard Walled Borosilicate Tubing</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-7.5HP</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>P1000 micropipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>MF-900 Microforge</td><td>NARISHIGE</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>ValveBank perfusion sysytem</td><td>AutoMate Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata&amp;reg; 1440A Low-noise Data Acquisition System</td><td>Molecular Devices</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10.6 Software</td><td>Molecular Devices</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td></td></tr></tbody></table>

controllable ion channel expression through inducible transient transfection

Transfektion die Abgabe fremder Nukleinsäuren in eine Zelle, ist ein leistungsfähiges Werkzeug in der Proteinforschung. Durch dieses Verfahren können Ionenkanäle durch elektrophysiologische Analyse biochemische Charakterisierung, Mutationsstudien untersucht werden, und ihre Auswirkungen auf zelluläre Prozesse. Transienten Transfektionen bieten ein einfaches Protokoll, in dem das Protein für die Analyse innerhalb von wenigen Stunden bis Tagen verfügbar wird. Obwohl dieses Verfahren eine relativ einfache und zeitspar Protokoll stellt eine der kritischen Komponenten kalibriert wird, die Expression des Gens von Interesse zu physiologisch relevanten Niveaus oder Ebenen, die für die Analyse geeignet sind. viele verschiedene Ansätze zu diesem Zweck, die die Fähigkeit bieten, die Expression des Gens von Interesse zu steuern entstanden. Mehrere stabile Zelltransfektion Protokolle bieten eine Möglichkeit, um dauerhaft ein Gen von Interesse in das zelluläre Genom unter der Regulierung eines Tetracyclin-kontrollierten TRANSCRIP einführentionalen Aktivierung. Während diese Technik zuverlässig Expressionsniveaus erzeugt, erfordert jedes Gen von Interesse ein paar Wochen der Facharbeit einschließlich Kalibrierung eines Tötungskurve, die Auswahl der Zellkolonien und mehr Ressourcen insgesamt. Hier stellen wir ein Protokoll, das die transiente Transfektion des Transient Receptor Potential Kationenkanal-Unterfamilie V Element 1 (TRPV1) -Gens in einem induzierbaren System als eine effiziente Weise verwendet ein Protein, das in einer kontrollierten Weise zu exprimieren, die in Ionenkanalanalyse wesentlich ist. Wir zeigen, dass mit Hilfe dieser Technik können wir Kalzium-Imaging, ganze Zelle, und Einkanal-Analyse mit gesteuerten Kanalpegel für jede Art der Datensammlung mit einem einzigen Transfektion erforderlich sind. Insgesamt stellt dies eine replizierbare Technik, die verwendet werden können Ionenkanäle Struktur und Funktion zu untersuchen.

Um schnell eine induzierbare Expression Modell zu erstellen, haben wir den Einsatz von HEK293 - Zellen , die Tetracyclin - Repressor - Protein (TR) exprimieren (zB T-Rex-293) und Vektoren , die Tetracyclin - Operatorsequenzen (TetO) zwischen dem CMV - Promotor und die multiple Klonierungsstelle enthalten (beispielsweise pcDNA4 / TO). Wenn transfizierte in TReX-293-Zellen wird die Expression des Gens von Interesse in pcDNA4 / TO drückt, als TR an tetO bindet. Hinzufüge...

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Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Studieren Ionenkanäle durch ein heterolog exprimierenden System hat eine Kerntechnik in der biomedizinischen Forschung. In diesem Manuskript stellen wir eine zeiteffiziente Methode streng kontrollierten Ionenkanal-Expression durch Durchführung transienter Transfektion unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors zu erzielen.

Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

9.3K Aufrufe.  The Hebrew University of Jerusalem (HUJI).  Studieren Ionenkanäle durch ein heterolog exprimierenden System hat eine Kerntechnik in der biomedizinischen Forschung. In diesem Manuskript stellen wir eine zeiteffiziente Methode streng kontrollierten Ionenkanal-Expression durch Durchführung transienter Transfektion unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors zu erzielen. 

Serie: Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene switches requires the transfer of two therapeutic expression units concurrently into a single cell, the practical application of the system for gene therapy is limited. To simplify the transgene expression system, we generated a gene switch designated as pEUI(+) encompassing a complete set of transgene expression modules in a single vector. Comprising of the GAL4 DNA-binding domain and modified EcR (GvEcR), a minimal VP16 activation domain fused with a GAL4 DNA-binding domain, as well as a modified Drosophila ecdysone receptor (EcR), the newly developed singular gene switch is highly responsive to the administration of a chemical inducer in a time- and dosage-dependent manner. The pEUI(+) vector is a potentially powerful tool for improving the control of transgene expression in both biological research and pre-clinical studies. Here, we present a detailed protocol for modulation of a transient and stable transgene expression using pEUI(+) vector by the treatment of tebufenozide (Teb). Additionally, we share important guidelines for the use of Teb as a chemical inducer.

Here, we present a protocol for the modulation of transgene expression using pEUI(+) singular gene switch by tebufenozide treatment.

Ein Ecdyson Rezeptor-basierte singuläre Genschalter für bewusste Expression des Transgens mit Robustheit, Reversibilität und vernachlässigbar Undichtigkeit

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

Forschung

Genetik

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based approaches. For example, although chimeric and Cre-LoxP targeting strategies have been widely used, the intrinsic limitations of these strategies (i.e., leaky promoter activity, mosaic Cre expression, etc.) have significantly restricted their application. Moreover, a complete deletion of many endogenous genes is embryonically lethal, making it impossible to study gene function in postnatal life. To address these challenges, we have made significant changes to an early genetic engineering protocol and combined a short (transgenic) version of the Rb1 gene with a lysosomal protease procathepsin B (CB), to generate a DN mouse model of Rb1 (CBRb). Due to the presence of a lysosomal protease, the entire CB-RB1 fusion protein and its interacting complex are routed for proteasome-mediated degradation. Moreover, the presence of a tetracycline inducer (rtTA) element in the transgenic construct enables an inducible and reversible regulation of the RB1 protein. The presence of a ubiquitous ROSA-CAG promoter in the CBRb mouse model makes it a useful tool to carry out transient and reversible Rb1 gene ablation and provide researchers a resource for understanding its activity in virtually any cell type where RB1 is expressed.

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Here we present a protocol to develop a dominant-negative inducible system, in which any protein can be conditionally inactivated by reversibly overexpressing a dominant-negative mutant version of it.

Induzierbaren und Reversible Dominant-Negative (DN) Protein Hemmung

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Anlegen eines induzierbaren Expression System zu Störungen der bakteriellen Virulenzfaktoren mit Intrazelluläre Signal Studieren

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Immunologie und Infektion

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Biologie

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Optimierte Transfektion Strategie für Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinantem Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T-Zellen

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

Bestimmung der relativen Zelloberfläche und Total Expression rekombinanter Ionenkanäle Mit Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and the determination of the biochemical function of proteins at the sub-organismal level. Although baculovirus expression systems are increasingly used for protein production in numerous biotechnological, pharmaceutical, and industrial applications, nonlytic systems that do not involve viral infection have clear benefits but are often overlooked and underutilized. Here, we describe a method for generating nonlytic expression vectors and transient recombinant protein expression. This protocol allows for the efficient cellular localization of recombinant proteins and can be used to rapidly discern protein trafficking within the cell. We show the expression of four&#160;recombinant proteins in a commercially available insect cell line, including two aquaporin proteins from the insect Bemisia tabaci, as well as subcellular marker proteins specific for the cell plasma membrane and for intracellular lysosomes. All recombinant proteins were produced as chimeras with fluorescent protein markers at their carboxyl termini, which allows for the direct detection of the recombinant proteins. The double transfection of cells with plasmids harboring constructs for the genes of interest and a known subcellular marker allows for live cell imaging and improved validation of cellular protein localization.

Nonlytic insect cell expression systems are underutilized for production, cellular trafficking/localization, and recombinant protein functional analysis. Here, we describe methods to generate expression vectors and subsequent transient protein expression in commercially available lepidopteran cell lines. The co-localization of Bemisia tabaci aquaporins with subcellular fluorescent marker proteins is also presented.

Vorübergehende Expression und zelluläre Lokalisation von rekombinanten Proteinen in gezüchteten Insektenzellen

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

An Introduction to Transfection

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell enables the expression, or production, of proteins using the cells own machinery, whereas insertion of RNA into a cell is used to down-regulate the production of a specific protein by stopping translation. While the site of action for transfected RNA is the cytoplasm, DNA must be transported to the nucleus for effective transfection. There, the DNA can be transiently expressed for a short period of time, or become incorporated into the genomic DNA, where the change is passed on from cell to cell as it divides.
This video describes the basics behind chemical mediated transfections and introduces some of the most commonly-used reagents, including charged lipids, polymers, and calcium phosphate. Each step is described from the preparation of cells for transfection through analysis of transfection efficiency. Additionally, the applications section of this video-article describes the use of electroporation and a biolistic transfection as alternative methods for introducing nucleic acid into mammalian cells. It also describes an advanced use of transfection where co-transfection of interfering RNA and DNA are introduced as a way to down-regulate a naturally occurring protein while at the same time producing a mutant variant of it within the same cell.

Transfection: Inserting Genetic Materials into Mammalian Cells

Eine Einführung in die Transfektion

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell ...

Lehre

JoVE Science Education

Grundlegende Biologie

Grundlegende Methoden in der Zell und Molekularbiologie

Inducible Tet-Off Regulatable System: An In Vitro Method to Modulate Gene Expression in Cultured Cells Using Tetracycline-Off System

Source: Migneault, F. et al, <a href="https://www.jove.com/v/60654">Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video describes the method of regulating gene expression in cultured cells by transfection with a plasmid containing a gene of interest and a regulatory plasmid. The expression of this plasmid can be controlled by tetracycline or its synthetic analogs, making this system a useful model to study regulatable gene expression.

Induzierbares Tet-Off-regulierbares System: Eine In-vitro-Methode zur Modulation der Genexpression in kultivierten Zellen mit dem Tetracyclin-Off-System

Source: Migneault, F. et al, Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in ...