Diese Arbeit wurde von den Zuschüssen K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) und P01GM107012 (KWM) von den National Institutes of Health, und aus Mitteln des Roy J. Carver Lehrstuhl für Biochemie, Biophysik und Molekularbiologie an der Iowa State University unterstützt . Der Inhalt dieser Arbeit ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des NIH.

Dieses Protokoll ist ausreichend für die Expression entweder HEK293F oder HEK293s Zellen. 1. Zell Establishment <ol><li> Kultur Inokulation Hinweis: Alle Kultur Manipulation Vorgänge in einer Anlage BSL-2 durchgeführt werden und jedes Einzelteil, die in das Biosicherheitswerkbank muss durch Besprühen mit einer 70% Ethanol in Wasser-Lösung sterilisiert werden. <ol><li> Betrieb des Inkubationsschüttler bei 135 UpM, 80% Feuchte und 8,0% CO 2 und 37 ° C. Schalten &quot;auf&quot; der UV-Lampe der Biosicherheitswerkbank mindestens 1 h vor dem Training. Vorwärmen die versiegelten Medium A und Medium B Flaschen im Wasserbad bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Sterilisieren 125 ml Erlenmeyerkolben mit einer Wachstums belüftete Kappe, Pipetten, Pipetten und vorgewärmten Medien Flaschen durch Spritzen mit der 70% Ethanol in Wasser-Lösung. Legen Sie diese Dokumente in der Biosicherheitswerkbank. Hinweis: Sterilisieren Sie nur die äußere Kunststoffabdeckung des 125 ml-Erlenmeyer-Kulturflasche und entfernen Sie dann nur, wenn sie is in der Biosicherheitswerkbank. </li><li> Für einen 30-ml-Kultur, zurückzutreten 26 ml Medium A und 3 ml Medium B (10% der Gesamtkultur) und Überführung in den 125 ml-Erlenmeyer-Kulturflasche und vorsichtig schütteln (im Folgenden als frisches Kulturmedium bezeichnet). </li><li> Transfer eine Ampulle von Zellen, die HEK293F Zellen, bei -80 ° C eingefroren, auf Eis und bewegen sich im Kulturraum. Anmerkung: HEK293F Zellen werden in einer Dichte von 1 x 10 7 Zellen / ml geliefert. </li><li> Erwärmen Sie die Durchstechflasche vorsichtig im Wasserbad bei 37 ° C, um die Zellen teilweise auftauen (es dauert etwa eine Minute, und die Zellen nicht vollständig aufgetaut werden). Sterilisieren Sie die außerhalb des Fläschchens mit der 70% Ethanol in Wasser-Lösung und verschieben Sie sie in die Biosicherheitswerkbank. </li><li> Unter Verwendung von 1 ml-Pipette, ziehen Sie die Zellsuspension (etwa 0,7 ml) und Transfer in das 125 ml Erlenmeyerkolben mit 29 ml frischem Kulturmedium. Schließen Sie die Abdeckung der Kulturflasche und verschieben Sie sie in die inkubiert Shaker. </li></ol&gt; </li><li> Zell Wartung: Überprüfen Zelldichte, Lebensfähigkeit und Zellpassagen <ol><li> Überprüfen Sie die Zellen Dichte nach 24 Stunden nach dem Auftauen der Kultur mit Hilfe der nachstehenden Protokoll. Anmerkung: Die Zellen werden für 24 h nach dem Auftauen zu wesentlichen Zellen Wachstum und die Lebensfähigkeit von&gt; 80% zu gewährleisten gezüchtet. </li><li> Sterilisieren Sie die Kulturflasche mit 70% Ethanol in Wasser-Lösung und verschieben Sie sie in die Biosicherheitswerkbank. </li><li> Unter Verwendung einer 1 ml Pipette und Pipetten langsam zurückziehen 100 ul der Suspensionskultur und Transfer in ein steriles 0,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Schließen und sobald die Kulturflasche in den Shaker Transfer zurück wie möglich. </li><li> Mischen Sie 7,5 ul einer Trypanblau-Lösung mit 7,5 ul der Zellen. Mischen kräftig mit 7,5 ul der Zell / Trypanblau Gemischs und überträgt es auf das Zählen Rutsche. </li><li> Aktivieren Sie die automatische Zellzähler und legen Sie das Zählen Rutsche in den Laderaum. Die Auto-Leser wird aktiviert und die Zellen werden automatisch in den Einheiten gezähltder Anzahl der Zellen pro ml und prozentuale Lebensfähigkeit </li><li> Bestimmen das Volumen des für die Übertragung in ein frisches Kulturmedium in den Zellen Dichte von 0,3 × 10 6 lebende Zellen / ml benötigt Spenderkultur. Hinweis: Sehen Sie eine Beispielrechnung im ergänzenden Materialien. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.1.2 und 1.1.3 der &quot;1.1 Kultur Impfung&quot; Protokoll über den Materialien für frisches Kulturmedium erforderlich vorzubereiten. </li><li> Übertragungsmedium A (23 ml) und Medium B (3 ml) zu einer frischen 125 ml Kulturflasche. Entfernen Sie die Vorratsflaschen von Medium A und Medium B von der Biosicherheitswerkbank. Hinweis: Die Bestände an Medienflaschen dürfen nicht in der Biosicherheitswerkbank zur gleichen Zeit wie die HEK 293F-Zellen gehalten werden. Dies schränkt die Möglichkeit der Verunreinigung der Lager Medium Flaschen. </li><li> Entfernen Sie die HEK293 Zellkultur aus dem Inkubator und Spray mit der 70% Ethanol in Wasser-Lösung. Mit Hilfe einer neuen Pipette herausziehen Aliquot von Zellen (4 ml, dieses Volumen bestimmt wurde, nach to Schritt 1.2.6) aus der Kultur und übertragen sie in den Kolben mit frischem Kulturmedium. </li><li> Bringen Sie beide Kulturen aus der Biosicherheitswerkbank in den Inkubator Schüttler Satz nach 1.1.1. Wachsen Zellen auf eine ungefähre Dichte von 2-3 x 10 6 lebende Zellen / ml. Anmerkung: Die ungefähre Verdopplungszeit der Zellen 32 h. Es dauert 3-4 Tage, um diese Dichte zu erreichen. Inkubieren der Zellen für 3-4 Durchgänge mit einem stabilen Wachstum Muster von Zellen vor der ersten Transfektion haben. </li></ol></li></ol> 2. Bereiten Sie Materialien für die Transfektion <ol><li> Vorbereiten HEK293-Zellen (Tag 1) <ol><li> Subkultur-Zellen bis zu einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml in frisches Medium B 24 h vor der Transfektion gemäß Schritt 1.2. Hinweis: das Volumen der Transfektion Kultur hängt von der Anzahl von Zellen sein. Transfektion größeren Mengen (&gt; 20 ml) wird ein größeres Volumen der Kultur in dieser Phase erforderlich. </li></ol></li><li> Vorbereiten Stocks of Materials <ol><li> Vorbereitung Stammlösung Lineares Polyethylenimin (PEI) mit einer Konzentration von 1 mg / ml in einem Puffer, der 25 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) und 150 mM NaCl (pH 7,5). Löse PEI vollständig; Dies kann 30-60 min bei RT zu nehmen. Sterilisieren durch 0,22 um Spritzenfilter und bei -20 ° C für die langfristige Nutzung. </li><li> Bereiten Sie sterile Plasmid-DNA (entsprechend den Schritten 2.2.2.1-2.2.2.4). Die Plasmid-Konstruktionsverfahren wird an anderer Stelle 42 beschrieben. Eine kurze Verfahren zur DNA-Präparation wird hier erklärt: <ol><li> Wachsen, eine Kultur von chemisch kompetente Escherichia coli-Zellen mit dem Vektor pGEn2 in 1 l LB-Medium (Tryptone- 10 g / l, Hefe Ausschnitt- 5 g / l und Natriumchlorid-10 g / l), ergänzt mit 100 ug / transformierten ml Ampicillin. E. coli bei 37 ° C in einer nicht befeuchteten, Schüttelinkubator gezüchtet. </li><li> Reinige den pGEn2 kodierenden Vektor Zielplasmid DNA gemäß der manulers DNA Reinigungsprotokoll. </li><li> Um eine vollständige Sterilität der Plasmid-DNA zu gewährleisten, führen Sie die endgültigen Isopropanolfällung und Resuspension Schritte der DNA-Extraktionsverfahren in der Biosicherheitswerkbank. </li><li> Fügen Sie das Volumen Isopropanol (im Plasmid Vorbereitung Kit angegeben) auf die eluierte DNA und Zentrifuge bei 10.000 x g für 10 min. Sterilisieren Sie die Außenseite des DNA-Behälter mit 70% Ethanol in Wasser-Lösung und überträgt es in der Biosicherheitswerkbank. Entsorgen Sie die Isopropanol Überstand mit einer Pipette und der Luft trocknen die DNA-Pellet. Einmal trocken, das Pellet in sterilem 10 mM Tris-Puffer, pH 8,0. </li></ol></li><li> Vorbereitung Stammlösung von 220 mM Valproinsäure (VPA) Säure in Wasser und Sterilisieren mittels Durchleiten durch einen sterilen 0,22 um Filter. Bewahren Sie die Lösung bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li></ol></li></ol> 3. Aufbau einer Transiente Transfektion <ol><li> Transfektion (Tag 0) <ol><li> Überprüfen Sie die Zelldichte durch folgende Schritte 1.2.2 bis 1.2.5 &quot;1.2. Cell Wartung&quot; weiter oben. Bestimmung der Anzahl der Zellen für die Transfektion (2,5-3,0 × 10 6 lebende Zellen / ml mit der Lebensfähigkeit&gt; 95%). Hier finden Sie eine Beispielrechnung im ergänzenden Materialien. </li><li> Übertragung des Volumens der Suspensionskulturzellen in dem vorherigen Schritt (hier 67 ml) in einen 250 ml-Zentrifugenröhrchen unter Verwendung eines sterilen serologischen Pipette. Sammeln Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 100 x g. </li><li> In der Zwischenzeit eine frische Transfektion Kulturmedium nach Schritt 1.1.3 nach &quot;1.1. Kulturinokulation&quot; oben. Siehe die Zusatzmaterialien für ein Rechenbeispiel. Auch Transfer 5 ml frisches Kulturmedium in ein steriles 15 ml-Tube und beiseite stellen. </li><li> Übertragungsrohren, die die pelletierten Zellen in die Biosicherheitswerkbank nach Sterilisieren des Außenseite der Rohre mit der 70% Ethanol in Wasser-Lösung und mit einer sterilen Pipette Dekantier-the Stand aus verbrauchten Kulturmedium. </li><li> Kräftig Resuspendieren der pelletierten Zellen durch Auf- und Abpipettieren mit 10 ml frischem Kulturmedium und Transfer in den Kolben mit frischem Transfektion Kulturmedium (in Schritt 3.1.3 oben hergestellt). Schrauben Sie die Kappe auf der Zellkulturflasche entlüftet und der Kolben zu bewegen, um den Brutschrank (wie in 1.1.1 festgelegt) für 15 min-1 h mit Schütteln. </li><li> Während dieser Zeit verdünnt das Plasmid-DNA und PEI Bestände mit frischem Kulturmedium (mit der 5 ml Volumen aus Schritt 3.1.3 oben zurückgezogen) zu einer Endkonzentration von 0,5 ug / ul. Siehe Beispielrechnungen in ergänzende Materialien, die Menge an DNA und PEI bestimmen. Übertragen Sie die Kulturflasche mit den dispergierten Zellen in der Biosicherheitswerkbank. </li><li> In Plasmid-DNA (300 &amp; mgr; l von 0,5 ug / ul) zu der Kultur unter Verwendung von Mikropipette und mischen durch vorsichtiges manuelles Schütteln. In PEI (900 ul 0,5 ug / ul) zu der Kultur, mischen durch vorsichtiges Schütteln. In 3,8 ml frischem culture Medium aus Schritt 3.1.3 vor und Übertragungskolben in den Inkubator Schüttler für 24 Stunden. </li><li> Reinigen Sie die Biosicherheitswerkbank gemäß Schritt 1.1. </li></ol></li><li> Verdünnung (Tag 1) (für eine 50 ml Transfektion Volumen) <ol><li> Inkubieren Sie die transfizierten Kultur für 24 Stunden. </li><li> Zurückzuziehen 1 ml vorgewärmten 220 mM Valproinsäure (VPA; gemäß Schritt 2.2.3 vorbereitet.) Mit einer sterilen 1 ml serologische Pipette und übertragen sie in eine sterile 50-ml-Tube. </li><li> Zurückzuziehen 5,0 ml vorgewärmtem Medium B und 44 ml vorgewärmtem Medium A und addieren sie zum VPA Lösung mit einer sterilen Pipette in serologischen 50 ml frisches Kulturmedium mit einer Endkonzentration von 4,4 mM VPA vorzubereiten. </li><li> Bewegen Sie den transfizierten Kultur in die Biosicherheitswerkbank nach Sterilisieren des Äußeren der Kolben mit 70% Ethanol in Wasser-Lösung, fügen Sie die vorbereiteten Verdünnungsmedium und der Kolben Transfer zurück zum inkubiert Shaker. </li></ol></li><li> Expression und Harvest (Tage 2-6) <ol><li> Inkubieren Sie die Zellen für weitere 4-5 Tage (5-6 Tage insgesamt seit Transfektion). </li><li> Zurückzuziehen Aliquots des Kulturmediums nach Schritt 1.2.2. zu 1.2.5. oben mit einer sterilen 1 ml serologische Pipette, um Zellen Lebensfähigkeit zu überwachen und speichern Aliquots zur Proteinexpression an jedem Tag durch SDS-PAGE analysiert beschriebenen &quot;1.2. Cell Wartung&quot; (siehe Abschnitt 5, unten). </li><li> Ernten der Zellen nach 5-6 Tagen durch Zentrifugieren der Zellen plus Medium bei 1000 g für 5 min. Zusätzlich zu ernten den Überstand, wenn die Lebensfähigkeit der Zellen unter 50% (siehe Schritte 1.2.2-1.2.5). </li><li> Gießen Sie den Überstand, die sekretiertes Protein enthält. 5 ml einer 10% Bleichmittel auf die HEK Zellpellet und entsorgen Sie als Biohazard. </li></ol></li></ol> 4. Protein Purification <ol><li> Vorbereitung einer Säule mit 5 ml Protein-A-Sepharose. Äquilibrieren der Säule mit 5 Säulenvolumina Puffer A (20 mM 3- (N-Morpholino) propansulfonsäure (MOPS), pH 7,4, 100 mM NaCll). </li><li> Zentrifugieren des gesammelten Überstandes mit exprimierten Proteins bei hoher Geschwindigkeit (14.000 g für 10 min), um alle verbleibenden Zelltrümmer zu entfernen. Sammeln Sie mit dem Umfüllen in ein frisches Röhrchen. Entsorgen Sie das Pellet als Biohazard. </li><li> Sammeln ein 10 ul Aliquot des Überstandes und zusätzlich zu sammeln eine kleine Probe an jedem Proteinreinigungsschritt, um die Probe durch SDS-PAGE analysiert (in Abschnitt 5 beschrieben). Laden Sie das geklärte Überstand und sammeln die Strömung durch. </li><li> Die Säule wird mit 3 Säulenvolumina Puffer A und Eluieren des Proteins mit 5 Säulenvolumina von 100 mM Glycin, pH 3,0. Das Eluat wird gesammelt in Röhrchen, die ein halbes Volumen von 1 M Tris-Puffer, pH 8,0, um den pH-Wert rasch zu neutralisieren. </li><li> Mit 10 Säulenvolumina Puffer A und Speicher für eine zukünftige Verwendung Die Säule. </li><li> Buffer tauschen die eluierte Protein mit mindestens einem 10-fachen Überschuss an Puffer A mit 10 kDa Molekulargewicht cut-off zentrifugalen Filter. Hinweis: die eluierten Probe zu konzentrieren Sie sich nichtein sehr geringes Volumen (&lt;2 ml) in der eluierten Puffers. Verwenden Sie die Schleuderfilter, um den Puffer mit Puffer A austauschen </li><li> Speicher gereinigte Protein bei 4 ° C bis zum nächsten Einsatz. Achtung: Die Protein im Überstand ausgedrückt können durch Affinitätssäulen auf der Basis der Eigenschaften des Proteins oder die Verwendung von Affinitätsmarkierungen ausgewählt gereinigt werden. Für einen typischen Reinigungsverfahren, Protein-A-Säule kann für IgG oder Fc-Fragmente oder Nickelsäule verwendet werden kann, die für Proteine ​​mit einem Poly-Histidin-Tag exprimiert werden. Hier ist eine Beschreibung der Reinigungsschritte zur IgG1-Fc Verwendung einer Protein A-Säule. </li></ol> 5. Analyse von Protein durch SDS-PAGE <ol><li> Verdünnt den Aliquoten (7,5 &amp; mgr; l) jeder Probe mit einem gleichen Volumen 2 × Ladepuffer (0,125 M Tris, pH 8,0, 4% SDS, 10% β-Mercaptoethanol, 20% Glycerin und 0,01% Bromphenolblau). </li><li> Man kocht die Mischung bei 90 ° C für 5 min mit einem Heizblock oder Wasserbad. Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 g for 1 min. Laden der vorbereiteten Gels mit 5 ul der Markerprotein und 14 &amp; mgr; l der Proben für die Analyse unter Verwendung einer 20 &amp; mgr; l-Pipette mit einer Einwegspitze. </li><li> Führen Sie einen Gel bei 25 Milliampere für 60 min. Sobald die Elektrophorese Schritt abgeschlossen ist, Übertragen des Gels zu einem Behälter mit 1 l Wasser und Mikrowelle für 5 min. </li><li> Stain das Gel mit Färbelösung (40% Ethanol, 10% Essigsäure und 0,1% Coomassie Brilliant Blue) für 2 Stunden und destain in Wasser. </li></ol> 6. Glykane massenspektrometrische Analyse <ol><li> Analysieren Glykane wie zuvor 44 beschrieben. Kurz gesagt, 75 &amp; mgr; g von IgG1-Fc wurde mit Trypsin behandelt, dann mit PNGaseF zur Freisetzung von Glycanen 45 behandelt. Freigabe Glycane wurden permethyliert und durch Verwendung von Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-Ionisations-Flugzeit-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) analysiert. </li></ol> 7. Protokoll Anpassungen für spezielle Szenarien <ol><li> Markierung von Proteinen mit 15 N-markierte Aminosäuren (für ein 50 ml Volumen Transfektion) <ol><li> Verzichtet 5 mg jeder Aminosäure in einer einzigen sterilen Glasphiole. Resuspendieren mit 4 ml autoklaviertem Wasser (beachten Tyr nicht vollständig löslich zu machen, im Gegensatz zu Lys und Phe). Sterilisieren der Lösung durch Autoklavieren bei 121 ° C für 15 min. Die Lösung wird in etwa 50-60 ° C abkühlen. </li><li> Für einen 50-ml-Transfektion Volumen, führen Sie Schritt 3.1.3 nach &quot;3.1 Aufbau einer transienten Transfektion&quot;. Finden Sie in der ergänzenden Materialien Abschnitt für ein Beispiel mit entsprechenden Volumen. </li><li> Für die Transfektion wurden die Schritte von &quot;3. Aufbau einer transienten Transfektion&quot; mit frischem Kulturmedium ersetzt mit markierten Aminosäurereste wie oben hergestellt. </li><li> Nach 24 Stunden der Transfektion, am Tag der Kultur Verdünnung zurückzuziehen 5,0 ml vorgewärmtem Medium B, 40 ml vorgewärmtem Medium A und ein frisch autoklaviert 4 ml Aliquot der Aminosäuremischung (wie in Schritt 7.1.1 hergestellt. Oben) und fügen Sie 1ml vorgewärmtem Stammlösung von VPA-Lösung zu 50 ml frischem Verdünnungskulturmediums mit einer Endkonzentration von 4,4 mM VPA vorzubereiten. Fügen Sie dieses Medium zu der Transfektion Kultur mit einer sterilen serologischen Pipette. </li><li> Übertragen Sie die transfizierten Kultur in die Biosicherheitswerkbank nach Sterilisieren des Äußeren der Kolben mit 70% Ethanol in Wasser-Lösung, fügen Sie die vorbereiteten Verdünnungsmedium und der Kolben Transfer zurück zum inkubiert Shaker. Anmerkung: Medium A ist ein chemisch definierten, serumfreien Medium. Somit ist es möglich, eine andere Formulierung herzustellen. Kontaktieren Sie die Anbieter, um ein eigenes Medium A Vorbereitung, dass bestimmte Aminosäuren fehlt erhalten. Es ist möglich, dass alle Aminosäuren weggelassen, jedoch bevorzugen wir, Medium, das nur wenige ausgewählte Reste fehlt verwenden, da eine vollständige Ausfallmedium würde Verstellung Osmolarität nach Ergänzung erfordern. Wir haben uns für ein Lys-Tyr-Phe-Dropout Medium, ergänzt werden kann und nicht Osmolarität Einstellung. Furthermore das Medium A Lieferant nicht frei zu teilen die Konzentrationen von Mediumkomponenten; verwendeten wir 100 mg / L jeweils für Lys, Tyr und Phe mit Erfolg. Volumina der Transfektion und Expression Medium muss eingestellt werden, um die hinzugefügten Aminosäuren ausmachen. Hier sind die Anpassungen an den Protokoll oben für Isotopenmarkierung </li></ol></li><li> Ergänzen die Transfektion mit ein kleines Molekül <ol><li> Vorzubereiten 100 mM Stammlösung von 2-Deoxy-2-fluor-L-Fucose unter Verwendung von autoklaviertem Wasser und Sterilisieren dieser Lösung unter Verwendung eines 0,22 um-Filter. </li><li> Für einen 50-ml-Kultur, fügen 125 ul (bei 250 &amp; mgr; M) der Fucose analoge Lösung für die Transfektion und Verdünnungsmittel. Hinweis: Es wird unterlassen, eine weitere Volumeneinstellung durchzuführen, da die Zugabe des Substituenten bei dieser Konzentration beträgt nur 0,25% des gesamten Kulturvolumens .Es ist möglich, die Expression unter Verwendung von Kleinmolekül-Inhibitoren der Glycan Verarbeitung modifizieren. Hier werden wir die Bedingungen beschreiben, für die Aufnahme von 2-Desoxy-2-Fluor-L-Fucose, ein Inhibitor der Glycan Fucosylierung. Ergab&gt; 90% ige Reduktion der Fucosylierung durch Addieren des analogen Fucose in einer Konzentration von 250 uM in der Transfektion und Verdünnungsmittel. </li></ol></li></ol>

All authors declare no competing financial interests in this manuscript.

Dieses Protokoll stellt die Proteinexpression über die transiente Transfektion von HEK293F oder S-Zellen. Die in den Barb und Moremen Labors etabliert optimale Transfektionsbedingungen beschäftigen eine kritische Kombination von Zelldichte und Reagenzienkonzentrationen eine hohe Effizienz der Transfektion zu erreichen. Kritische Überlegungen bei der Durchführung dieses Protokolls sind: die Aufrechterhaltung einer stabilen Kultur vor der Transfektion (mit konsistenten Kultur Verdopplungszeiten); Transfektion von akti...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated. from:
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
to
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam W. Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated.

Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Hohe Ausbeuten an in geeigneter Weise gefaltet und posttranslational modifiziert Humanproteinen für die detaillierte Analyse von Struktur und Funktion wie vor eine große Herausforderung. Eine große Anzahl von Expressionssystemen zur Verfügung, die von rekombinanten Proteinen mit nativ-ähnlichen Funktion und Verhalten zu erzeugen. Bakterielle Expressionssysteme, überwiegend Escherichia coli-Stämme, repräsentieren die am leichtesten zugänglichen und am häufigsten verwendeten Werkzeuge in der Forschung Arena, wegen der Einfachheit dieser Expressionssysteme, obwohl Hefe-, Pflanzen-, Insekten- und Säugersystemen werden ebenfalls beschrieben 1-4. Die meisten dieser Systeme sind jedoch nicht in der Lage geeignete posttranslationale Modifikation der Zielproteine. Ein grundlegendes Interesse der Barb und Moremen Labors produziert eukaryotischen Proteinen mit entsprechenden Glykosylierung. Viele menschliche Proteine ​​erfordern entsprechende Glykosylierung für die richtige Funktion (siehe 5). Der eukaryotischeGlykosylierungsmaschinerie ist umfangreich und der Lage, eine breite Palette von Modifikationen, einschließlich sowohl Asparagin (N) - und Serin / Threonin (O) -verknüpften komplexer Glykane 6. Es wird geschätzt, dass&gt; 50% der menschlichen Proteine ​​sind N-glycosyliert. 7 Glykane sind wesentliche Bestandteile von vielen Proteinen, einschließlich therapeutischer monoklonaler Antikörper, Erythropoietin und Blutgerinnungsfaktoren, wie Faktor IX, um einige zu nennen. Obwohl mehrere Methoden existieren, um in geeigneter Weise N-glycosylierte Proteine ​​vorzubereiten und reichen von rein synthetischen 8-10, um Chemoenzymatische 11-14 oder Erholung von gentechnisch rekombinanten Systemen 15-20, nicht überraschend, menschliche Expressionssysteme sind bisher bewährt die robusteste zu sein Verfahren zur Erzeugung von menschlichen Proteinen. Viele therapeutische Human Glykoproteine ​​in rekombinanten Systemen, die Säugetierzellen produziert. Systeme Bemerkenswert sind die Chinese Hamster Ovary (CHO), Maus-Myelom (NS0), Baby-Hamster Niereny (BHK), menschliche embryonale Nieren (HEK-293) und die menschliche Netzhaut-Zelllinien, die in der Haftung oder Suspensionskultur für die Proteinproduktion 4,21,22 eingesetzt werden. Allerdings haben Säugerproteinexpressionssysteme die Erzeugung von stabilen Zelllinien, teure Nährmedien und Substrat unterstützte Transfektion Verfahren 23 erforderlich. Säugerzelle Transfektion wird mit Hilfe einer Vielzahl von Mitteln, einschließlich Kalziumphosphate 24,25, kationische Polymere (DEAE-Dextran, Polybren, Polylysin, Polyethylimin (PEI)) oder positiv geladene kationische Liposomen 26-29 erreicht. PEI ist ein polykationisches, geladene, lineares oder verzweigtes Polymer (25 kDa) 26, die einen stabilen Komplex bildet mit DNA und wird durch Endozytose. Beim Ansäuern des Endosoms wird PEI gedacht zu quellen, was zu dem Bruch der Endosomen und Freisetzung der DNA ins Zytoplasma 26,30. Bis vor kurzem war die transiente Transfektion in Sperre wiederauf Kultur wurde durch vorherigen DNA / PEI-Komplexbildung, gefolgt von der Zugabe zu der Zellkultur 29 durchgeführt. Allerdings Würm und Mitarbeiter berichteten über eine hocheffiziente Protokoll für die Produktion rekombinanter Proteine ​​in HEK293-Zellen, die eine DNA / PEI-Komplex in situ gebildet 31,32 optimiert. Dies vermieden Herstellung, Sterilisation der Anlage und Pufferaustausch in einem Kulturmedium. Weitere Optimierung, indem die Expression steigernde Plasmiden führte zu deutlichen Ertragssteigerungen 33. Hierin ist eine Methode, die auf diesen Fortschritten baut und ist breit anwendbar. Expressionsbedingungen können ebenfalls verändert werden, um das N-Glycan-Zusammensetzung auswirken. Die HEK293s Zelllinie mit einem Gen-Deletion, das N-Glycan Verarbeitung stoppt in einer Zwischenstufe, zur Expression von Proteinen mit einheitlichen N-Glycanen, die aus 2-N-Acetylglucosamin-Reste plus fünf Mannosereste (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Diese Zellenfehlt das N-Acetylglucosaminyl Transferase I (GntI) Gen, das für nachfolgende N-Glycan Verarbeitungs 36,37 erforderlich. Die Verwendung von Glycosyltransferase-Inhibitoren, einschließlich kifunensine Sialinsäure-Analogen und dem Fucose analogen und 2-Deoxy-2-fluor-Fucose hat ähnliche Wirkungen und Grenzen N-Glycan Verarbeitungs 38-41. Das Protokoll verwendet die hier berichteten pGEn2 Vektors wie in Figur 1 gezeigt, 42,43, PEI stützten transiente Transfektion in Säugetierzelllinien (HEK293F oder HEK293s Zellen) und die Rückgewinnung von hohen Ausbeuten von geeignet glykosylierte Protein. Das System ist robust und kann von verschiedenen Faktoren, einschließlich Isotopenmarkierung und Glycan Technik für die Herstellung von großen Titern an rekombinante Proteine ​​unterzubringen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet&#160;</td>
			<td>NuAire, Inc.</td>
			<td>CellGard ES NU-S475-400</td>
			<td>Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation shaker</td>
			<td>INFORS HT</td>
			<td></td>
			<td>Multitron Cell&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium A: FreeStyle Expression Medium&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12338-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium&#160;</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>14571C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>431143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>431144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeStyle HEK 293F Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R790-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (Pipet-Aid XP)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>161263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting slides&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>145-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>23966</td>
			<td>Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 &#956;M syringe filter and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>EMD Chemicals Inc.</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Syringe Filter, 0.22 &#956;M</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>09-719A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisaminomethane (Tris base)</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Blue</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>222249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP1421-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fluka Analytical&#160;</td>
			<td>92144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH chemicals</td>
			<td>BDH8014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic (VPA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4543</td>
			<td>Prepare stock solution of 220 mM&#160; in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#63720; 250 mL Centrifuge Tube&#160;</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>EW-17707-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A-Sepharose column</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA superflow</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 kDa molecular weight cut-off Amicon&#174; Ultra centrifugal filters&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial&#160;</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coomassie brilliant blue&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>161-0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N labeled L-Tyrosine</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>332151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N labeled L-Lysine</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>592900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlabeled L-Phenylalanine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-Glucose</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>389374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-deoxy-2-fluoro-l-fucose&#160;</td>
			<td>SANTA CRUZ Biotechnology</td>
			<td>sc-283123</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of hek293 cells in suspension

Die Kunst der Herstellung von rekombinanten Proteinen mit komplexen post-translationale Modifikationen stellt eine große Herausforderung für die Untersuchung der Struktur und Funktion. Die rasche Einrichtung und hohe Rückgewinnung aus transient transfizierten Säugerzelllinien adressiert diese Barriere und ist ein wirksames Mittel zur Expression von Proteinen, die natürlicherweise durch das ER und Golgi-vermittelte sekretorischen Weg geleitet werden. Hier ist ein Protokoll für die Proteinexpression mit Hilfe der menschlichen HEK293F und HEK293s Zelllinien mit einem Säugetier-Expressionsvektor für hohe Proteinausbeuten entwickelt transfiziert. Die Anwendbarkeit dieses Systems wird gezeigt, unter Verwendung von drei repräsentativen Glycoproteine, die mit Ausbeuten zwischen 95 bis 120 mg gereinigtes Protein gewonnen pro Liter Kultur ausgedrückt. Diese Proteine ​​sind die menschlichen FcγRIIIa und die Ratte α2-6 Sialyltransferase, ST6GalI, beide mit einem N-terminalen GFP-Fusions zum Ausdruck, ebenso wie das unmodifizierte humanen Immunglobulins G1 Fc. Das robuste System utilizes ein serumfreies Medium, das für die Expression von isotopisch angereicherten Proteine ​​und Kohlenhydrate für Strukturuntersuchungen unter Verwendung von Massenspektrometrie und Kernspinresonanzspektroskopie anpassungsfähig ist. Weiterhin kann die Zusammensetzung des N-Glycan durch Zugabe einer kleinen Moleküls an bestimmten Glycans Modifikationen in einer Weise, die Ausbeute nicht verringert verhindern abgestimmt werden.

High-Level-Proteinexpression und Reinheit Diese optimierte Expressionssystem erzeugt eine hohe Ausbeute an glycosylierten Proteinen. Ein typisches Muster der Expression von IgG1-Fc (Figur 1) dargestellt. In diesem Fall, Tag 0 ist der Tag der Transfektion gefolgt von Tag 1 (Verdünnung), und die anschließende Kultivierung Tage bis Tag 5. Die Protein-Expression wird unter Verwendung des löslichen Expressionsfr...

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High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield Expression von rekombinanten humanen Proteinen mit der transiente Transfektion von HEK293 Zellen in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

29.5K Aufrufe.  Iowa State University. Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

Serie: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR&#945;, etc.). We are able to model and study a human-like disease in our mouse model, by transplanting bone marrow cells previously infected with a retrovirus expressing the oncogene of interest. Replication-defective retrovirus encoding a human oncogene and a marker (GFP, RFP, antibiotic resistance gene, etc.) is produced by a transient transfection protocol using 293T cells, a human renal epithelial cell line transformed by the adenovirus E1A gene product. 293 cells have the unusual property of being highly transfectable by calcium phosphate (CaPO4), with up to 50-80% transfection efficiency readily attainable. Here, we co-transfect 293 cells with a retroviral vector expressing the oncogene of interest and a plasmid that expresses the gag-pol-env packaging functions, such as the single-genome packaging constructs kat or pCL, in this case the EcoPak plasmid. The initial transfection is further improved by use of chloroquine. Stocks of ecotropic virus, collected as culture supernatant 48 hrs. post-transfection, can be stored at -80&deg;C and used for infection of cell-lines in view of transformation and in vitro studies, or primary cells such as mouse bone marrow cells, that can then be used for transplant in our mouse model.

This technique demonstrates an efficient way to prepare replication-defective retroviral stocks encoding a human oncogene, and subsequently used for induction of myeloproliferative disease in the mouse model.

Produktion von replikationsdefekte Retrovirus durch transiente Transfektion von 293T-Zellen

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Forschung

Biologie

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Expression von rekombinanten Proteinen in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Optimierte Transfektion Strategie für Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinantem Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T-Zellen

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

Absolute Quantenausbeute Messung von Pulverproben

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

Eine bequeme und allgemein Expression Plattform für die Produktion von sekretierten Proteinen aus menschlichen Zellen

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Reinigung von Affinity-markierter rekombinanter Proteine

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Effiziente Agroinfiltration von Pflanzen für High-Level-Transient Expression von rekombinanten Proteinen

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine ​​Venom Produziert in Applied<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...