Dieses Protokoll bietet Schritt-für-Schritt-Richtlinien für einen reproduzierbaren Zugangsweg zu Regionen von Interesse im kaudalen Hirnstamm und im oberen Halsstrang. Diese Technik erhöht die Präzision bei der Abgabe kleiner Injektionsvolumina an begrenzte Bereiche von Interesse im kaudalen Hirnstamm und im oberen Gebärmutterhalsstrang. Diese Technik wurde und kann auf andere Tiermodelle angewendet werden.
Dr. Veronique VanderHorst, außerordentliche Professorin für Neurologie und leitende Prüfärztin des VanderHorst-Labors, wird dieses Verfahren demonstrieren. Stellen Sie sicher, dass der Sauerstofffluss zum Nasenkegel geleitet wird. Bewegen Sie die Maus zum stereotaktischen Rahmen und legen Sie die Nase in einen flexiblen Nasenkonus.
Platzieren Sie die Maus nur mit Ohrstangen im stereotaktischen Rahmen. Legen Sie Gleitmittel auf die Augen. Anteroflex den Kopf der Maus in einen Winkel von 90 Grad, indem Sie die Nase manuell führen.
Um diese Position zu sichern, platzieren Sie eine Kunststoffbarriere zwischen den Ohrstangensäulen des Mausadapters parallel zu den Säulen, wobei der flache Teil des Schädels als Referenz dient. Legen Sie das Heizkissen unter die Maus und stellen Sie sicher, dass der Hals und der Rest des Körpers parallel zum Tisch positioniert sind, indem Sie den Körper mit einer kleinen Box anheben. Legen Sie ein Tuch unter den Körper.
Injizieren Sie eine Einzeldosis von vier Milligramm pro Kilogramm Meloxicam langsam subkutan bei einem Volumen von zwei Mikrolitern pro Gramm Körpergewicht. Reinigen Sie die chirurgische Inzisionsstelle zuerst mit einem 70% Alkohol-Prep-Pad, dann mit einem Betain-Prep-Pad und dann wieder mit einem Alkohol-Prep-Pad und lassen Sie es trocknen. Desinfizieren Sie die Hände und ziehen Sie sterile Handschuhe an, dann legen Sie ein Tuch an die Operationsstelle.
Stellen Sie sicher, dass die Maus angemessen betäubt wird, indem Sie die Zehen kneifen oder den Hornhautreflex überprüfen. Reduzieren Sie Isofluran, um die Werte bei 2,0 zu halten. Machen Sie einen ein bis 1,2 Zentimeter großen Schnitt mit einer chirurgischen 10-Klinge vom Rand des Hinterhauptbeins bis zu den Schultern in einer sanften Bewegung.
Machen Sie vorsichtig einen Schnitt in der Mittellinie Raphe des Trapezmuskels und legen Sie die paarigen Longus capitis-Muskeln frei. Platzieren Sie beide Retraktorhaken zwischen den gepaarten Longus capitis-Muskeln, von denen einer nach links und der andere nach rechts ausgerichtet ist. Verwenden Sie die stumpfe Laminektomiezange, um die linke und rechte Säuche des gepaarten Musculus longus capitis zu trennen, beginnend mit dem Hinterkopf, wo die Mittellinie gut sichtbar ist.
Führen Sie die stumpfe Pinzette über den Knochen des Hinterkopfes in der Mittellinie bis zu der Stelle, an der sie auf die zisternale Dura mater trifft, und fahren Sie dann weiter über die Dura mater zum Atlas. Positionieren Sie die Retraktoren neu und passen Sie die Spannung an, indem Sie die Hämostaten neu positionieren. Verwenden Sie die stumpfe Laminektomiezange, um die Muskeln weiter in der Mittellinie zu trennen, um eine gute Sicht auf den Hirnstamm und das Kleinhirn zu erhalten.
Wiederholen Sie den obigen Vorgang nach Bedarf, bis das Kleinhirn und der Hirnstamm unterhalb der Dura erscheinen. Reinigen Sie mit stumpfen Laminektomiezangen die Dura der kleinen Bindegewebsstränge, indem Sie die Pinzette von der Mittellinie in eine laterale Richtung bewegen, bis eine klare Sicht auf den Hirnstamm besteht, wodurch mehr seitlicher Raum entsteht. Betrachten Sie die dorsale Oberfläche des Hirnstamms mit detaillierten Orientierungspunkten durch die offene Dura.
Verwenden Sie die abgewinkelte Pinzette, um die Dura zu greifen, die sich vom Hinterhauptbein bis zum Atlas erstreckt, und verwenden Sie dann die Federschere, um eine kleine Öffnung von etwa 0,5 bis 1,5 Millimetern in der Dura zu machen. Sobald die Dura geöffnet ist, drainieren Sie überschüssige Zerebrospinalflüssigkeit mit einem sterilen Q-Tip. Der Obex, der Punkt, an dem sich der zentrale Kanal in den vierten Ventrikel öffnet, ist der standardmäßige anterior-posteriore und mediolaterale Nullpunkt.
Positionieren Sie die Pipette oder Spritze mit dem stereotaktischen Arm zum Ziel. Senken Sie den Arm des Rückens auf die dorsale Oberfläche, die sich aus dem dorsoventralen Nullpunkt bildet. Dann senken Sie die Pipette auf den Hirnstamm und injizieren Sie die Lösung.
Lassen Sie die Nadel nach der Injektion für ein bis fünf Minuten an Ort und Stelle, um eine Nadelspur zu vermeiden, wenn Sie Volumina zwischen drei und 50 Nanolitern verwenden. Heben Sie dann die Pipette oder Spritze mit dem stereotaktischen Arm an und wiederholen Sie dies für mehrere Ziele. Entfernen Sie die Haken vorsichtig aus dem Operationsfeld.
Die gepaarten Musculi longus capitis fallen in eine neutrale Position zurück, die die Cisterna magna vollständig bedeckt. Schließen Sie den Trapezmuskel und die Dura mater in der Mittellinie nicht, da sie zu zerbrechlich sind, um Nähte zu halten. Schließen Sie die Haut mit 3 Nylon- oder Polypropylennähten.
Der Cisterna-Magna-Ansatz ermöglicht es, auf die Strukturen des kaudalen Hirnstamms und der oberen Halsschnur abzuzielen, die sonst über stereotaktische Standardansätze schwer zu erreichen sind oder zu inkonsistentem Targeting neigen. Bei Mäusen wurden Strukturen wie der Nucleus hypoglossus, die ventrale Atmungsgruppe und die angrenzende retikuläre Bildung im kaudalen Hirnstamm routinemäßig mit dem Cisterna magna-Ansatz anvisiert, wie hier für den Hypoglossuskern und die ventromediale Medulla dargestellt. Um die Genauigkeit des Cisterna magna-Ansatzes gegenüber dem Standardansatz zu bestimmen, wurde der Abstand zwischen den beabsichtigten und tatsächlichen Zielstellen in der anteroposterioren, mediolateralen und dorsoventralen Ebene für ventrale und dorsale Regionen gemessen.
Die Ergebnisse zeigen signifikant geringere Fehler in der anteroposterioren, mediolateralen und dorsoventralen Ebene im Vergleich zum Standardansatz, was die verbesserte Genauigkeit des Cisterna magna-Ansatzes für diese Ziele unterstreicht. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig sicherzustellen, dass die Anteroflexion des Kopfes und die Erhöhung des Körpers wie beschrieben durchgeführt werden. Als nächstes ist es wichtig, wichtige Orientierungspunkte zu erkennen, bevor Sie den Muskel oder die Dura mater manipulieren.
Wenn diese Landmarken nicht erkannt werden oder wenn sie verloren gehen, wird es schwierig sein, orientiert zu bleiben und das Verfahren wie beabsichtigt auszuführen. Diese Technik trug dazu bei, konzeptionelle Fragen im Zusammenhang mit der funktionellen anatomischen Organisation innerhalb des kaudalen Hirnstamms und der oberen Halsschnur zu beantworten.
