Die Mechanismen der Proteinaggregation wurden bisher meist in vitro untersucht. Mit unserem Protokoll können wir ähnliche quantitative Studien im Modellorganismus C.elegans durchführen. Der Hauptvorteil unserer Methode ist die unvoreingenommene Quantifizierung von Einschlusszahlen.
Und indem wir diese qualitativ hochwertigen Daten an mathematische Modelle anpassen, können wir Einblicke in den Aggregationsmechanismus erhalten. Proteinaggregation tritt bei vielen Krankheiten auf, einschließlich Alzheimer und Huntington. Das Verständnis des molekularen Mechanismus der Proteinaggregation in vivo ist entscheidend für die Entwicklung neuer Therapien.
Beginnen Sie damit, 10 erwachsene Nematoden mit einem Platinwurm-Pick auf eine 6 cm große gesäte NGM-Platte zu legen, um eine synchronisierte Eiablage durchzuführen. Lassen Sie die Erwachsenen etwa zwei Stunden bei 20 ° C Eier legen, bevor Sie sie vom Teller nehmen. Legen Sie die Teller mit Eiern bei 20 ° C in den Inkubator.Überwachen Sie die Entwicklung der Tiere, bis sie am dritten Tag nach der Eiablage das Erwachsenenalter erreichen.
Bereiten Sie die 384-Well-Platte vor, indem Sie die erforderliche Anzahl von Wells mit 100 L M9-Puffer füllen, ergänzt durch 25 mM Natriumazid als Anästhetikum. Füllen Sie eine Vertiefung pro Sorte, die abgebildet werden soll. Übertragen Sie für jeden Stamm 20 Tiere mit einem Platin-Wurmpickel in einen Brunnen.
Decken Sie die Platte mit dem Deckel ab, um eine vorbeugende Verdunstung zu verhindern, und stellen Sie die Platte innerhalb einer Stunde nach der Zubereitung ab. Schalten Sie das Instrument ein und öffnen Sie die Software. Klicken Sie auf die Schaltfläche Play neben Unload Well Plates und legen Sie die 384-Well-Platte in das Mikroskop.
Klicken Sie unter Aktionsliste und 3D-Fluoreszenzerfassung auf Testen, und wählen Sie den Brunnen aus, der Würmer enthält. Legen Sie die Bildverarbeitung auf Keine fest. Und klicken Sie auf die Play-Taste, um den optimalen Schaltabstand zu bestimmen, in dem die Würmer richtig zentriert sind.
Stellen Sie den aufsteigenden Abstand auf 50 m, den absteigenden Abstand auf 50 m und das Schnittintervall auf 2 m ein, um die gesamte Dicke der Tiere im Z-Stapel zu erfassen. Setzen Sie die Bildverarbeitung auf das Maximum zurück. Wählen Sie unter Well Plate Scan Setting (Bohrlochplatten-Scaneinstellung) die zu bebildernden Vertiefungen aus.
Wählen Sie dann Kachel und Ganzes gut erwerben aus. Speichern Sie die Messeinstellung. Klicken Sie auf Messung starten, um das Experiment zu starten.
Öffnen Sie CellProfiler, und ziehen Sie die Pipeline in das Fenster Pipeline-Datei hier ablegen. Klicken Sie auf Ja, um das Projekt zu laden. Ziehen Sie als Nächstes die zusammengefügten Bilder in das Fenster Dateien und Ordner hier ablegen.
Klicken Sie auf das Metadaten-Eingabemodul. Passen Sie den regulären Ausdruck an, um aus dem Dateinamen entsprechend den Namen der zusammengefügten Bilder zu extrahieren. Klicken Sie auf das Eingabemodul NamesAndTypes und passen Sie Wählen Sie die Regelkriterien aus, um sie an die Kanäle in den Dateinamen anzupassen.
Klicken Sie dann auf Ausgabeeinstellungen, um einen Ordner auszuwählen, in dem die Ausgabe von CellProfiler gespeichert werden soll. Klicken Sie auf Testmodus starten, um die Einstellungen der Pipeline anhand des ersten Imaging-Datasets zu überprüfen. Klicken Sie auf Schritt, um die Pipeline zu durchlaufen, ein Modul nach dem anderen.
Um die Wurmumrisse anzupassen, klicken Sie im Modul EditObjectsManually auf Hilfe anzeigen, um die Anweisungen anzuzeigen. Korrigieren Sie die Gliederungen. Klicken Sie dann auf Fertig, um die Pipeline weiter auszuführen.
Klicken Sie auf Testmodus beenden und analysieren Sie Bilder. Öffnen Sie den Ausgabeordner, um die Ausgabedateien anzuzeigen. Und öffnen Sie die Bilder mit dem ursprünglichen Dateinamen, gefolgt von Umrissen, um zu überprüfen, ob die Würmer und Einschlüsse korrekt überlagert wurden.
Um AmyloFit zu verwenden, benennen Sie das Projekt und klicken Sie auf Projekt erstellen. Klicken Sie auf Öffnen, um es zu öffnen. Erstellen Sie eine Sitzung, indem Sie ihr einen Namen geben und auf Sitzung erstellen und laden klicken.
Klicken Sie auf Daten hinzufügen und laden Sie die Datei mit der durchschnittlichen Anzahl von Einschlüssen pro Tier hoch, wobei Sie den im linken Bereich angezeigten Datenformatanforderungen entsprechen. Klicken Sie dann auf Neue Daten laden. Legen Sie die Anzahl der Punkte fest, die für den Nullpunkt-Offset auf 0 gemittelt werden sollen, und legen Sie die Anzahl der Punkte fest, die für das Plateau auf 0 gemittelt werden sollen, um die Vorverarbeitungsschritte zu überspringen, die für die Einschlusszählungsdaten nicht erforderlich sind.
Klicken Sie dann auf Senden. Wiederholen Sie diesen Schritt für jede Proteinkonzentration. Wählen Sie im Modellfenster die Option "Benutzerdefiniert".
Geben Sie die Gleichung für die unabhängige Keimbildung in das Feld Gleichung ein. Klicken Sie auf Modell laden. Setzen Sie für Ncells den Parametertyp auf Global Constant und Value auf 95, entsprechend der Anzahl der Körperwandmuskelzellen.
Legen Sie die Parametertypen für Kcell und n auf Global fit fest. und zu konstant für m. Geben Sie die Werte von m für die verschiedenen Dehnungen im linken Bereich ein.
Lassen Sie die Anzahl der Beckenhüpfungen unverändert, und klicken Sie im Bedienfeld "Formstück" auf "Anpassen". Extrahieren Sie abschließend die Passform, indem Sie auf Daten herunterladen und anpassen klicken. Die Einschlusszahlen wurden in vier C.elegans-Stämmen überwacht, die unterschiedliche Q40-Konzentrationen exprimierten.
Das unabhängige Keimbildungsmodell beschreibt die Aggregationskinetik gut. Die Anpassung ergab eine Reaktionsordnung von 2,1 und eine Keimbildungsrate von 0,38 Molekülen pro Tag und Zelle bei einer intrazellulären Proteinkonzentration von 1 mM. Zwei unabhängige biologische Replikate in einer früheren Studie zeigten eng verwandte Werte für die Reaktionsordnung und Keimbildungsrate.
Eine Sache, die beachtet werden sollte, ist, dass Sie qualitativ hochwertige Datensätze für mehrere Proteinkonzentrationen benötigen, um zuverlässige Passungen zu erhalten. Diese Methode kann verwendet werden, um Wege zu finden, die Proteinaggregation in einem lebenden Organismus zu stören, wie genetische Knockdowns oder Behandlungen mit kleinen Molekülen.
