Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur in vivo und dreidimensionalen Visualisierung und Quantifizierung der markierungserhaltenden Zellen der Schneidezahn-Stammzellnische der Maus. Diese Technik ist zeitsparend und benutzerfreundlich für neue Lernende. Die 3D-Bilder werden aufgenommen, ohne das Gewebe zu beschädigen.
Die 3D-Quantifizierung macht die Daten zuverlässiger und genauer. Sezieren Sie zunächst die Mandibeln. Fixieren Sie die Proben in 4% Paraformaldehyd und halten Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie nach der Inkubation die Muskeln von den Mandibeln. Tauchen Sie sie in eine 0,5-molare Ethylendiamintetraessigsäurelösung, um sie vier Tage lang mit einem täglichen Medienwechsel auf einem 37-Grad-Celsius-Shaker zu entkalken. Entfärben Sie die Mandibeln einen Tag lang in 15 Millilitern 25%iger Quadrol-Lösung auf einem 37-Grad-Celsius-Shaker, um das restliche Bluthäm zu entfernen.
Bereiten Sie für die 5-Ethinyl-2-Prime-Desoxyuridin-Färbung einen frischen 5-Ethinyl-2-Prime-Desoxyuridin-Etikettierungscocktail vor, wie im Text erwähnt. Spülen Sie die Mandibeln mit einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung mit Tween 20 oder PBST 30 Minuten lang auf einem 37-Grad-Celsius-Shaker ab. Wiederholen Sie das Spülen der Mandibeln mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung dreimal für jeweils drei Minuten, gefolgt von einer Inkubation in einem frisch zubereiteten 5-Ethinyl-2-Prime-Desoxyuridin-Markierungscocktail auf einem Shaker über Nacht.
Wiederholen Sie die phosphatgepufferte Kochsalzlösung dreimal und führen Sie eine serielle Delipidierung durch, indem Sie die Mandibeln jeweils sechs Stunden lang in einem 37-Grad-Celsius-Shaker in die im Text genannten Lösungen legen. Dehydrieren Sie die Mandibeln in tert-Butanol-Polyethylenglykol oder tB-PEG-Lösung für zwei Tage bei 37 Grad Celsius mit dem täglichen Medienwechsel. Reinigen Sie den Unterkiefer nach zwei Tagen in Benzylbenzoat-Polyethylenglykol-Clearingmedium, das 75% Benzylbenzoat, 22% Polyethylenglykol-Methylethermethacrylat durchschnittlich 500 oder PEG-MMA500 und 3% Quadrol enthält, um eine Brechungsindexanpassung zu erhalten und bis die Transparenz erreicht ist.
Montieren Sie den gewebegereinigten ganzen Unterkiefer auf Markenhohlraum-Objektträger im Benzylbenzoat-Polyethylenglykol-Reinigungsmedium und decken Sie ihn mit Glasabdeckobjektträgern ab. Stellen Sie in der konfokalen Bildgebungssoftware die gewünschten Bildaufnahmeparameter ein. Aktivieren Sie im Panel für die Fluoreszenzanregung den Laser, der zur optimalen Anregung von Fluorophoren erforderlich ist.
Bewegen Sie im Bereich für die Fluoreszenzdetektion den Schieberegler, um die zu messenden Wellenlängen auszuwählen. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl mit einem Brechungsindex von 1,52 auf das Deckglas, um dem Brechungsindex des Glasdeckglases und des Objektivs zu entsprechen, und legen Sie den montierten Unterkiefer auf den Mikroskoptisch. Schalten Sie die Leuchtstofflampen ein und wählen Sie ein geeignetes Vergrößerungsobjektiv aus, um interessante Bereiche abzubilden.
Identifizieren Sie im Live-Scan-Modus das Sichtfeld, um den gesamten Bereich des Unterkiefers in den X- und Y-Dimensionen zu visualisieren. Stellen Sie die Erfassungsparameter der oberen und unteren Z-Stufe ein, die das Volumen der Stammzellnische im Schneidezahn der Maus genau abdecken. Verwenden Sie eine Z-Schrittweite von zwei Mikrometern oder gemäß Ihrer Anforderung.
Erfassen und speichern Sie Z-Stack-Bilddateien im lif-Format. Verwenden Sie einen Dateikonverter für Imaging-Software, um die Z-Stack-Image-Datei in den Dateityp des nativen Formats zu konvertieren. Klicken Sie in der Bildbearbeitungssoftware auf die Schaltfläche "Arena" und wählen Sie dann "Bild".
Wählen Sie die ursprüngliche lif-Datei aus, und wählen Sie die zusammengeführte Datei aus. Die Bilder werden in die Bildbearbeitungssoftware importiert. Doppelklicken Sie auf die importierte Datei, um den Bilddatensatz zu öffnen.
Rufen Sie in der Bildbearbeitungssoftware das Bedienfeld "Anzeigeanpassung" auf. Klicken Sie im Bereich Anzeigeanpassung auf den Namen des Kanals. Im Standardmodus wird es normalerweise als rot gekennzeichnet.
Klicken Sie im Fenster Bildeigenschaften auf die Registerkarte Zugeordnete Farbe. Wählen Sie in der Option Color Tab File (Farbregisterkartendatei) die Option Fire Flow und klicken Sie dann auf OK. Wählen Sie die Anzeigefarbe aus, um die Hintergrundfluoreszenz und die positive Fluoreszenz von der Probe zu unterscheiden. Klicken Sie oben links auf dem Bildschirm im Bereich Szeneneigenschaften auf das blaue Symbol mit der Bezeichnung Neue Oberfläche hinzufügen.
Deaktivieren Sie das Symbol "Lautstärke", um den größten Teil der Hintergrundfluoreszenz zu entfernen, was dazu führt, dass die positive Fluoreszenz bei der manuellen Segmentierung deutlich sichtbar ist. Starten Sie als Nächstes die manuelle Segmentierung der Region von Interesse oder ROI, indem Sie auf die Registerkarte Erstellen klicken und die Registerkarte Automatische Erstellung überspringen, manuell bearbeiten auswählen. Klicken Sie im manuellen Assistenten zur Flächenerstellung auf die Registerkarte Kontur, um die Ausrichtung basierend auf den Proben auszuwählen und den ROI einfach zu konturieren.
Stellen Sie als Nächstes sicher, dass sich das Zeigermenü in der rechten Ecke im Auswahlmodus befindet. Passen Sie die Schnittposition an, um den ROI im Gewebe zu lokalisieren. Wie bereits erwähnt, ist der größte Teil der Hintergrundfluoreszenz bereits entfernt.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Zeichnen und zeichnen Sie einen vorläufigen Bereich von Interesse. Wählen Sie die Option Sichtbarkeit auf Keine, um Interferenzen aus anderen Bereichen als dem ROI zu vermeiden, gefolgt von der segmentweisen Segmentierung des interessierenden Bereichs. Nachdem die ROI-Zeichnung fertig ist, klicken Sie auf Oberfläche erstellen, um eine 3D-Geometrie des ROI zu erhalten.
Klicken Sie im manuellen Assistenten zur Flächenerstellung auf die Schaltfläche Bearbeiten, und wählen Sie Alle maskieren aus. Wählen Sie im ausgeklappten Fenster "Kanal maskieren" in den Optionen für die Kanalauswahl Kanal 1 aus. Wählen Sie anschließend Kanal duplizieren, bevor Sie die Maske anwenden.
Wählen Sie in den Maskeneinstellungen Konstante innen/außen aus, und setzen Sie die Voxel-Außenfläche auf Null. Heben Sie im Bereich Szeneneigenschaften die Auswahl des Surface-Objekts auf, und wählen Sie das Volume-Objekt aus. Deaktivieren Sie in der Anzeigeanpassung den ursprünglichen roten Kanal, und wählen Sie den maskierten roten Kanal aus.
Und passen Sie die Farbintensitäten an, um den gewünschten 3D-gerenderten und positiv markierten Fluoreszenz-ROI zu erzielen. Erstellen Sie ein neues Punktobjekt, indem Sie auf das Symbol "Flecken" klicken, um die 3D-gerenderten Zellen mit Beschriftung zu quantifizieren, indem Sie 3D-Punkte erstellen, die sich vergleichbar mit 3D-gerenderten Zellen mit Beschriftung überlappen. Verwenden Sie die unteren Pfeile, um zwischen den Schritten im Spot-Erstellungsassistenten zu wechseln.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Fertig stellen und wählen Sie die Schaltfläche Statistik aus. Wählen Sie als Nächstes die Registerkarte Gesamt aus, um den Wert für die Gesamtzahl der Punkte im Bild zu ermitteln. Nach der Markierung von 5-Ethinyl-2-prime-desoxyuridin und dem Polyethylenglykol-assoziierten Lösungsmittelsystem wurde der transparente Unterkiefer erhalten.
Die modifizierte Probe wurde mit einem normalen Unterkiefer ohne Gewebereinigungsprozess verglichen, und ein transparenter Unterkiefer mit 5-Ethinyl-2-prime-desoxyuridin-Markierung wurde einer konfokalen Bildgebung unterzogen. Der optische Schnitt des Schneidezahns zeigte markierungshaltende Zellen in der Stammzellnische der Schneidezahnspitze in der XY-Ebene. Die 3D-Bildkonstruktion einer Schneidezahnspitze zeigte 5-Ethinyl-2-prime-Desoxyuridin-positive Markierungs-haltende ruhende Stammzellen sowohl in der epithelialen als auch in der mesenchymalen Stammzellnische.
Die 5-Ethinyl-2-prime-Desoxyuridin-positiven Zellen wurden zur Quantifizierung an Stellen übertragen, die sich vergleichbar mit den mesenchymalen Markierungszellen überlappten. Die Flecken, die nur für mesenchymale markierungserhaltende Zellen und nur für epitheliale markierungserhaltende Zellen erzeugt wurden, sind im Bild sichtbar. Die Quantifizierung von epithelialen und mesenchymalen Markierungszellen wurde ebenfalls durchgeführt.
Die Verarbeitungs- und Reinigungseigenschaften sind die wichtigsten Schritte und sollten entsprechend der Verwendung des Gewebes optimiert werden, um zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen. Diese Methode kann auch modifiziert werden, um LRCs auf S2VGFP-Ebene zu visualisieren und in der Zelllinienverfolgung Details über den Standort der Nachkommen und ihre Quantifizierung oder Beiträge zu erhalten.
