Wir danken Herrn Douglas Benson für erste Gespräche über die Sekundärgaumenabbildung. Wir bestätigen auch David Castaneda-Castellanos (Leica) und Chris Rieken (Zeiss) für ihre Hilfe, um die bildgebenden Bedingungen in der konfokalen Mikroskopie anzupassen. Wir schätzen Lynsey Hamilton (Bitplane) für hilfreiche Vorschläge für die quantitative Bildanalyse mit Imaris Software. Diese Arbeit wurde von NIH / NIDCR R01 DE025887 finanziert.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Protokollen der University of California in San Francisco Institutional Animal Care und Use Committee durchgeführt. 1. Vorbereitung von Live Imaging Media <ol><li> Herstellung von flüssigen Kulturmedien <ol><li> Fügen Sie 20% fötales Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 U / mL Penicillin, 100 μg / ml Streptomycin, 200 μg / ml L-Ascorbinsäure, 15 mM HEPES zu Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 hinzu Medien. HINWEIS: Live-Imaging-Medien wurden direkt vor der Bildgebung frisch gemacht. Dieses Medium enthält Phenol-Rot, das zu Phototoxizität über lange Zeit Kurse der Live-Bildgebung führen kann. Die Substitution von Medien ohne Phenol-Rot kann die Langzeit-Bildgebung verbessern. </li></ol></li><li> Herstellung von niedrigschmelzender Agarose-Lösung <ol><li> 350 mg niedrigschmelzende Agarose in 10 ml autoklaviertem destilliertem Wasser auflösen, um eine 3,5% ige Stammlösung zu bilden. </li><li> Die Agaroselösung gut vermischen und bei 70 ° C in einem Wasserbad inkubieren, um die Agarose vollständig aufzulösen. </li><li> Die Agarose-Lösung in einem 37 ° C-Wasserbad abkühlen lassen, bevor man sie dem lebenden Bildmedium zuführt. </li><li> Füge 1 ml der Agarose-Stammlösung zu 5 ml des flüssigen lebenden Bildgebungsmediums hinzu, um eine Endkonzentration (0,6%) zu erreichen. </li><li> Halten Sie das Medium mit Agarose in einem 37 ° C Wasserbad, um eine vorzeitige Erstarrung zu verhindern. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung der Palate Explant Culture für Live Imaging <ol><li> Dissektion von kürzlich eingeleiteten E14.5 sekundären palatinalen Regalen ANMERKUNG: In unserer Erfahrung erfordert die Bildgebung die Fusion mit einem leicht angeklebten Paar von Gaumenböden; Diese Adhärenz verhindert explantische Bewegungen, die eine Verschmelzung während der Bildgebung verhindern. <ol><li> E14.5 Bühnenembryonen in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zerlegen und grünes fluoreszierendes Protein (GFP) exprimieren (ausK14-cre; ROSA26-mTmG- Flox ) oder (Red Fluorescent Protein) RFP-exprimierende (von Lifeact-mRFPruby ) positive Embryos unter Verwendung eines Sektionsmikroskops, das mit Leuchtstofflampen ausgestattet ist. Übertragen von Gewebe auf vorgewärmte lebende Bildkulturmedien ohne Agarose. </li><li> Schneiden Sie den Embryokopf und entfernen Sie den oberen Gehirnbereich, indem Sie zwei feine Zapfen Nr. 5 verwenden ( Abbildung 1 A-C ). Verwenden Sie eine Nr. 5 Pinzette, um den Embryo zu halten, während die andere Nr. 5 Pinzette, um zusätzliches Gewebe außerhalb der palatinalen Regale wegzuschneiden. HINWEIS: Feine Scheren können verwendet werden, um den Embryokopf (den ersten Schritt) anstelle einer Nr. 5 Pinzette zu schneiden. Allerdings wird zwei Nr. 5 feine Zangen eine bessere Kontrolle geben, um präzise Schnitte zu machen. </li><li> Entfernen Sie den Unterkiefer sorgfältig, ohne die Gaumenablagen zu beschädigen, wie in Abbildung 1 D und 1E gezeigt . Um die Chance zu beschädigen, Gaumen zu beschädigen, halte die Zunge durch die Sektion des Unterkiefers, fDurch sorgfältiges Entfernen der Zunge. </li><li> Nach dem Entfernen des Unterkiefers und der Zunge untersuchen Sie die orale Seite des Sekundärgaumens mit einem Stereomikroskop mit Fluoreszenz, um ein starkes Reportersignal im MES zu bestätigen ( Abbildung 1 M ). </li><li> Nach dem Entfernen von Unterkiefer und Zunge ( siehe Abb. 1 F ) die hinteren Teile einschließlich Hirnhirn und Hirnstamm herausziehen. </li><li> Entfernen Sie beide Oberkiefer mit angeklebten palatinalen Regalen ( Abbildung 1 G ). </li><li> Schneide das vordere Oberkiefergewebe, das sowohl den primären als auch den sekundären Gaumen intakt hält ( Abbildung 1 H und I ). </li><li> Nasenseptum auf nasale Seite des Explantats entfernen, das die MES aussetzt. HINWEIS: Diese späteren Schritte der Sektionen müssen sorgfältig darauf achten, die Kontakte zwischen zwei sekundären Gaumenböden nicht zu stören. Die Entfernung des Nasenseptums hilftReduzieren das Hintergrundsignal aus anderen Bereichen und reduzieren auch die vertikale Gewebebewegung, was eine stabile Bildgebung ermöglicht ( Abbildung 1 J-L ). </li><li> Nach dem Sezieren der Gaumenböden, untersuchen Sie die Mittellinie Reporter Signal wieder, um sicherzustellen, dass es keine Schäden an der Epithelschicht zwischen den Geweben. </li></ol></li><li> Einrichten von Gaumenforschern in Kulturschalen mit Live-Imaging-Medien <ol><li> Setzen Sie Live-Imaging-Medien in 35-mm-Glasbodenschale. </li><li> Setzen Sie sezierte palatale Regale mündliche Seite nach unten so nah an den Glasboden wie möglich für die Bildgebung mit einem umgekehrten konfokalen Mikroskop ( Abbildung 1 N ). </li><li> Legen Sie Trockeneis-Pellets auf eine leitfähige Oberfläche in der Nähe der Kulturschale, um die Agaroseverfestigung zu beschleunigen, indem Sie die Temperatur schnell verringern oder die Kulturschale auf 4 ° C stellen. Eine kalte Platte, wie sie beispielsweise für die Paraffineinbettung verwendet wurde, könnte auch an dieser Stelle verwendet werdenTage HINWEIS: Wenn Trockeneis verwendet wird, muss der Agarose-Medienwechsel sorgfältig überwacht werden, um das Einfrieren von Medien zu verhindern. </li></ol></li></ol> 3. Konfokale Zeitraffer-Bildgebung von Gaumenforschung <ol><li> Bildgebung und Datenerfassung <ol><li> Nachdem die Agarose halbverfestigt war, die Kulturschale in ein invertiertes konfokales Mikroskop mit 37 ° C Inkubationskammer auftragen. Verwenden Sie ein weißes Licht konfokales Mikroskop und Zelle Beobachter Spinnerei konfokale Mikroskop. HINWEIS: Wir verwendeten ein modifiziertes Medium mit 15 mM HEPES ohne CO 2 -Gas. </li><li> Setzen Sie Petroleumgelee zwischen die Kulturschale und bedecken Sie mit einer Spritze, um das Verdampfen von Medien zu verhindern ( Abbildung 1 N ). HINWEIS: Manche Kondensation auf der Oberseite des Kulturschalendeckels nach Übernachtung (O / N) Kultur tritt auf, aber das Volumen der Medien ändert sich nicht, was darauf hindeutet, dass das Vaselinegelee das Verdampfen von Medien verhindert. </li><li> Finden Sie die Region von Interesse mit niedrigen Vergrößerungszielen (10x) und verwenden Sie höhere Vergrößerungsziele (20x Objektiv mit 3x Digitalzoom oder ein 40x Objektiv mit Immersol W) für Zeitraffer Live Imaging. ANMERKUNG: Sektierte Sekundärpalastregale sind nicht flach. Der sekundäre Gaumen ist eine gekrümmte Struktur und das macht es schwierig, die gesamte MES in der gleichen Ebene abzubilden. Niedrige Vergrößerung (10x) Imaging kann eine ganze Gaumenabbildung ermöglichen, aber 40x Ziele werden eine bessere Bildauflösung bieten, um detaillierte zelluläre Bewegungen in tieferen Z-Positionen zu untersuchen. Die Krümmung ist im mittleren Gaumenbereich hoch. Der vordere und hintere Gaumen sind im Vergleich zum mittleren Gaumen relativ flach. Wir schauen oft auf die Mitte der Vorderseite des Sekundärgaumens, um Regionen der größten Krümmung zu vermeiden. </li><li> Mehrere Z-Stacks mit 5 μm pro Schritt für 16-24 h unter Verwendung einer geeigneten Laseranregung (488 nm für GFP und 532/561 nm für RFP) scannen ( Abbildung 2 ). HINWEIS: Um die potentielle Phototoxizität zu reduzieren, verwenden Sie die minimale Laserleistung und die Belichtungszeit. Dies ist vor allem bei Mehrfarb-Bildgebung wichtig. Verwenden Sie 22% der 552 nm Laserleistung für MembranTomato (mT), 30% der 495 nm Laserleistung für MembranGFP (mG) und 25% der 561 nm Laserleistung für MembranRFP. Die durchschnittliche Expositionszeit betrug 550 ms. </li><li> Verwenden Sie Bildanalyse-Software, um Zellverfolgung und quantitative Analyse durchzuführen. </li></ol></li></ol> 4. Datenbildanalyse HINWEIS: Hier wurde Imaris benutzt. Ähnliche Datenanalysen können auch mit ImageJ- oder Volocity-Softwarepaketen durchgeführt werden. <ol><li> Rendering von dreidimensionalen (3D) Oberflächen aus Bildsequenzen. HINWEIS: Dieser Abschnitt ermöglicht die Erzeugung einer Oberfläche aus einem Film, der mit einem Membran-GFP-Signal erzeugt wird. <ol><li> Klicken Sie auf Bearbeiten | Zeigen Sie die Display-Einstellung an und verwenden Sie den Histogramm-Schieberegler, um die Signalintensität so einzustellen, dass das Membransignal klar istAus der Länge des Films heraus ( Abbildung 3 A ). </li><li> Korrigieren Sie das Bleichsignal mit Hilfe von Image Verarbeitung | Dämpfungskorrektur . Passen Sie die Intensity Front- und Intensity Back-Werte an, so dass das Membransignal über die gesamte Länge des Films klar ist. Bei der Einstellung dieser Werte ist möglicherweise ein Versuch und ein Fehler erforderlich. HINWEIS: Der Wert &quot;Intensity Back&quot; (Deerper Z position) ist kleiner als der Intensity Front (Surface Z Position) Wert aufgrund der begrenzten Laserdurchdringung. Diese Werte können daher auch geändert werden, um die Signalintensität in der Z-Serie zu normalisieren. Beide Werte können angepasst werden, um eine Bleichkorrektur zu erreichen. Die Dämpfungskorrektur wird auch als Emissionsdämpfungskorrektur 19 bezeichnet . </li><li> Um eine Oberfläche aus dem Membransignal zu erzeugen, wählen Sie Surpass | Oberflächen , wählen Sie einen Quellkanal und Threshold-Typ (Absolute Intensity) und unter den Algorithmen Einstellungen seLect Segment nur eine Region von Interesse Und Prozess des gesamten Bildes schließlich , gefolgt von einem Klick auf den Vorwärtspfeil; Fahren Sie fort, den Vorwärtspfeil zu betätigen (Standardeinstellungen vornehmen oder Bereichsdetailsebenen und Schwellenmethode durch Versuch und Irrtum angeben), prüfen, ob die erzeugte Fläche das Fluoreszenzsignal reflektiert. Um eine Region von Interesse anzugeben, wählen Sie Region und Zeit (en), die gerendert werden sollen, indem Sie X-, Y-, Z-Positionen ausrichten. HINWEIS: Auswählen Prozess des gesamten Bildes endlich so, dass Anpassungen und Schwellenwerte über den gesamten Film angewendet werden. </li><li> Erstellen Sie eine Fläche, indem Sie erneut auf die Vorwärtspfeiltaste klicken. Stellen Sie dann die Schwelle ein, indem Sie das Histogramm in den Filtern ändern, um dem Membransignal zu entsprechen. </li><li> Nachdem die Oberfläche erzeugt wurde, wählen Sie die Oberfläche in den Oberflächen / Einstellungen, um das Oberflächensignal zu visualisieren und den Oberflächenerzeugungsprozess zu beenden, indem Sie die Doppelwalze drückenArd Pfeiltaste ( Abbildung 3 B ). </li><li> Gehe auf Oberfläche | Bearbeiten Sie und klicken Sie auf Maske alle in den Maskeneigenschaften , um ein maskiertes Kanalbild zu erzeugen. </li><li> Nach dem Klicken auf OK wird das Mask Channel-Fenster automatisch geöffnet; Wählen Sie den GFP-Kanal, setzen Sie die Voxel außerhalb der Oberfläche auf den maximalen Signalintensitätswert (gefunden in Bearbeiten | Display-Einstellung ) und Voxel innerhalb der Oberfläche auf den minimalen GFP-Intensitätswert (auch gefunden in Bearbeiten | Display-Einstellung ), in Maskeneinstellungen , um eine Maske des Membransignals zu erzeugen. </li><li> Wenn die Maske des Membransignals in der Volumenansicht angezeigt wird, erzeugen Sie invertierte Bilder mit der Bildverarbeitung | Kontraständerung | Invertieren ( Abbildung 3 C ). </li></ol></li><li> Erkennung von Flecken aus invertierten Oberflächenbildern. HINWEIS: In diesem Abschnitt kann das Zentrum jeder Zelle seinMarkiert mit einem einzigartigen punkt und verfolgt über Raum und Zeit. <ol><li> Wählen Sie Surpass Scene aus Flecken | Erstellen ; In Algorithmen Einstellungen wählen nur Segment nur eine Region von Interesse , Prozess des gesamten Bildes schließlich und Track Spots (im Laufe der Zeit) . </li><li> Klicken Sie auf den Vorwärtspfeil und geben Sie einen Bereich von Interesse an. Wähle die Region und die Zeit (e), um Spots zu verfolgen; Fahren Sie fort, den Vorwärtspfeil zu drücken, wählen Sie den maskierten Kanal als Quellkanal und bestimmen Sie den geschätzten XY-Durchmesser der Punkte. </li><li> Wenn Sie auf die Vorwärtspfeiltaste klicken, wird automatisch ein Filterfenster geöffnet. Anpassung der Spot-Erkennungsschwelle durch Ändern von Werten im Histogramm, um einzelne Punkte in der Mitte jeder Zelle zu erzeugen ( Abbildung 3 D ). </li><li> Wenn Sie auf die Vorwärts-Pfeiltaste klicken, wird das Algorithmus- Fenster geöffnet. Wählen Sie Autoregressives Bewegungs-Tracking-Modell 20 und geben Sie die maximale Tracking-Di anHaltung und maximale Lückengröße, um Spuren zu verbinden, die für einen kurzen Zeitraum diskontinuierlich werden. </li><li> Wenn Sie erneut auf die Vorwärtspfeiltaste klicken, wird das Fenster &quot;Filter&quot; geöffnet, indem Sie das Histogramm so einstellen, dass jede Zelle verfolgt wird. Wenn Sie auf die doppelte Vorwärtspfeiltaste klicken, wird die Spoterkennung finalisiert. </li><li> Um die Gewebetrift zu korrigieren, klicken Sie auf Spots | Track Editor und wählen Sie Correct Drift . Ein Algorithmus- Fenster wird automatisch geöffnet. Wählen Sie die Option Translational Drift aus, geben Sie das gesamte Ergebnis ein und korrigieren Sie Objektepositionen . </li></ol></li><li> Erstellung von Aufträgen für die quantitative Analyse HINWEIS: Das Scatterplot des Programms ist ein Werkzeug, um mehrdimensionale (X, Y, Z, Color und Scale) Graphen mit mehreren Objekten zu erzeugen. Diese Handlungen sind nützlich für die Betrachtung von Trends vieler Zellbewegungen im Laufe der Zeit. <ol><li> Machen Sie 2D- oder 3D-Plots von Zellverfolgungsdaten mit demVantage-Add New Vantage Plot-Menü ( Abbildung 3 E und 3F ). </li><li> Wählen Sie Volume oder Spots und wählen Sie Create / Category und Plot Type </li><li> Passen Sie Plot-Werte an, um verschiedene Vantage-Graphen zu erzeugen. </li><li> Exportieren Sie Graphen mit der Snapshot- Funktion. HINWEIS: Statistische Daten können auch als Tabellenkalkulation für weitere quantitative Analysen exportiert werden, indem man auf Plotnummernbereich | Speichern . </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Live-Bildgebung der Gewebemorphogenese mit der 3D-Organ-Explantat-Kultur kann detaillierte Informationen über zelluläre Prozesse liefern, die bei der herkömmlichen Färbeanalyse von festen Gewebeschnitten nicht gezeigt werden können. Unter Verwendung der in vitro explantischen Kultur des embryonalen Sekundärgaumens der Maus beobachteten wir einige interessante zelluläre Verhaltensweisen, die uns dazu führten, einen neuartigen Mechanismus der Gaumenfusion vorzuschlagen, der epitheliale Konvergenz und ...

Tissue Fusion ist ein wichtiger Schritt in der Entwicklung von mehreren Organen. Wichtige menschliche Geburtsfehler wie Spaltlippe und Gaumen, Spina bifida und Missbildungen des Herzens können aus Defekten der Gewebefusion resultieren 1 . Maus-Sekundär-Gaumen-Fusion wurde intensiv untersucht, um die zellulären und molekularen Mechanismen zu identifizieren, die die Gewebefusion in der Entwicklung 2 , 3 , 4 kontrollieren. In der Maus beginnt die sekundäre Gaumenentwicklung um etwa E11.5 mit dem Auswachsen eines sekundären palatinalen Regals aus jedem der bilateralen Oberkieferprozesse. Das anfängliche Wachstum der Gaumenböden erfolgt senkrecht entlang der Zunge, bis etwa E14.0, zu welcher Zeit die Gaumenböden waagerecht über die Zunge hoch werden. Das medial gerichtete Wachstum führt zu einem physischen Kontakt zwischen den applizierten Epithelien der beiden palatinalen Regale und bildet die Mittellinie epitheliAl Naht (MES) bei E14.5. Die dazwischen MES müssen zwischen den sekundären palatal Regalen entfernt werden mesenchymale Konfluenz zu ermöglichen , und die Entwicklung eines intakten, vollständig verschmolzen Sekundär Gaumen durch E15.5 3. Wie eine gemeinsame epitheliale MES-Zellschicht zwischen zwei getrennten Gaumenböden gebildet und dann entfernt wurde, um mesenchymale Konfluenz zu erreichen, war eine zentrale Frage in der Gaumenentwicklung. Basierend auf Maus-Histologie- und Elektronenmikroskopie (EM) -Studien, explantischen Kulturstudien und funktionellen Mausgenetik-Experimenten wurden in diesem Prozess mehrere grundlegende Zellverhalten verwickelt. Filopodienähnliche Projektionen aus dem medialen Randepithel MEE jedes palatinalen Regals erleichtern den Anfangskontakt 5 , 6 , gefolgt von einer Interkalation dieser Epithelzellen zu einer gemeinsamen MES 6 , 7 . Beseitigung der resultierenden gemeinsamen MESWurde vorgeschlagen, um durch drei nicht-exklusive Mechanismen vorzugehen. Frühe Studien mit histologischer Beobachtung und ex vivo- Linienverfolgung mit lebenswichtigen Farbstoffen zeigten, dass die MES durch epithelialen bis mesenchymalen Übergang (EMT) der MES-Zellen 8 , 9 entfernt werden könnte , obwohl in jüngster Zeit die genetische Linienverfolgung von Epithelzellen die Unsicherheit erhöht hat Der langfristige Beitrag der Epithelzellen zum Gaumenregal Mesenchym 10 , 11 , 12 . Eine signifikante Anzahl von apoptotischen Zellen und eine Verringerung ihrer Zahl in einigen Mutanten, die einer ordentlichen Gaumenfusion nicht unterliegen, hat zu der Vorstellung geführt, dass Apoptose ein wichtiger Treiber der MES-Auflösung 2 , 3 sein kann . Schließlich basiert zunächst auf Studien mit epithelialer Markierung und statischer Beobachtung zu progressiven Zeitpunkten, MES-ZellenWurden vorgeschlagen, um in den oronasalen und anteroposterioren Dimensionen 11 , 13 zu wandern, aber solche dynamischen Zellverhalten wurden zunächst unbestätigt wegen einer Unfähigkeit, sie in lebendem palatinalem Gewebe zu beobachten. In letzter Zeit konnten wir diese Verhaltensweisen direkt beobachten, indem wir eine neue Live-Imaging-Methodik entwickelten, die mäusegenetische Methoden der fluoreszierenden Markierung mit konfokaler Live-Imaging von explantierten Palastregalen kombiniert. Zuerst, um dynamische zelluläre Verhaltensweisen in Gaumenepithelzellen während der Gaumenfusion zu visualisieren, erzeugten wir eine epithelspezifische Reportermaus, indem wir ROSA26-mTmG- Flox- Mäuse mit Keratin14-cre- Mäusen 14 , 15 kreuzten . Die konfokale Live-Darstellung der Gaumen-Explantat-Kultur der resultierenden Embryos bestätigte einige zuvor vorgeschlagene zelluläre Verhaltensweisen und identifizierte neuartige Ereignisse im Fusionsprozess 6 </Sup&gt;. Epithelzellmembranvorsprünge gingen dem anfänglichen Zellzellkontakt voraus, gefolgt von einer epithelialen Konvergenz durch Zellinterkalation und oronasale Zellverdrängung. Bemerkenswerterweise haben wir auch entdeckt, dass die Zellextrusion, ein Prozeß, der berichtet wurde, um wichtige Rollen in der epithelialen Homöostase zu spielen, ein wichtiger Mechanismus war, der die Maus sekundäre Gaumenfusion 6 , 16 antrieb. Diese Abbildungsmethode kann mit anderen Reporterlinien verwendet werden; Wir haben Lifeact-mRFPruby- transgene Mäuse 17 , 18 verwendet , um die aktin- zytoskeletale Dynamik während des Fusionsprozesses zu untersuchen. Andere Reporter können auch eingesetzt werden, um andere spezifische Aspekte der Gaumenfusion zu beobachten, und diese Methode kann entweder auf die Laser-Scanning-konfokale Mikroskopie oder die Spinndiskette konfokale Mikroskopie angepasst werden, je nach Abbildungsbedarf und Mikroskopverfügbarkeit. Live-Imaging wird zunehmend zum Keystone-Ansatz in der Entwicklungsbiologie. PartiCulario, kraniofaziale Morphogenese ist komplex und menschliche Geburtsfehler, die das Gesicht beeinflussen, sind üblich. Diese konfokale Live-Imaging-Methode wird dazu beitragen, ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden grundlegenden Entwicklungsmechanismen sowie Ursprünge von menschlichen kraniofazialen Anomalien zu ermöglichen.

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			<td height="19" style="height:19px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-glutamine</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pennicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Low melting agarose</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>E-3111-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35mm glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Petrolieum Jelly (Vaseline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16415-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Keratin14-cre</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:65294</td>
			<td>Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ROSA26mTmG</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:124702</td>
			<td>Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Lifeact-mRFPruby</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:164274</td>
			<td>Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">White Light SP5 confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cell Observer spinning disk confocal microscope</td>
			<td>Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of mouse secondary palate fusion

Die Verschmelzung der sekundären palatinalen Regale zur Bildung des intakten sekundären Gaumens ist ein wichtiger Prozess in der Entwicklung von Säugetieren und ihre Störung kann zu Spalten-Sekundärgaumen führen, eine gemeinsame angeborene Anomalie beim Menschen. Sekundäre Gaumenfusion wurde ausführlich untersucht, was zu mehreren vorgeschlagenen zellulären Mechanismen führte, die diesen Prozess vermitteln können. Diese Studien wurden jedoch meistens an festen embryonalen Geweben zu fortschreitenden Zeitpunkten während der Entwicklung oder in festen explantierten Kulturen durchgeführt, die zu statischen Zeitpunkten analysiert wurden. Die statische Analyse ist für die Analyse von dynamischen morphogenetischen Prozessen wie eine Gaumenfusion begrenzt und welche Arten von dynamischen zellulären Verhaltensweisen die palatale Fusion vermitteln, ist unvollständig verstanden. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Live-Bildgebung der ex vivo sekundären Gaumenfusion bei Mausembryonen. Um zelluläre Verhaltensweisen der Gaumenfusion zu untersuchen, wurde epithelspezifisches Keratin14 -cre verwendet, um Gaumenepithelzellen in ROS zu etikettierenA26-mTmG- Flox- Reporter-Embryonen Um das filamentöse Actin zu visualisieren, wurden Lifeact-mRFPruby- Reporter-Mäuse verwendet. Die lebendige Bildgebung der sekundären Gaumenfusion erfolgte durch Sezieren von kürzlich adhärierten sekundären palatinalen Regalen von embryonalen Tag (E) 14,5-stufigen Embryonen und Kultivieren in agarosehaltigen Medien auf einer Glasbodenschale, um die Bildgebung mit einem umgekehrten konfokalen Mikroskop zu ermöglichen. Mit dieser Methode haben wir eine Vielzahl von neuartigen Zellverhalten während der sekundären Gaumenfusion nachgewiesen. Eine Anerkennung dessen, wie unterschiedliche Zellverhalten in Raum und Zeit koordiniert sind, trägt wesentlich zu unserem Verständnis dieses dynamischen morphogenetischen Prozesses bei. Dieses Protokoll kann auf mutierte Mauslinien angewendet werden, oder Kulturen, die mit pharmakologischen Inhibitoren behandelt werden, um das Verständnis darüber zu fördern, wie die Sekundärspalter-Fusion kontrolliert wird.

Live-Bildgebung der Gaumen-Explantat-Kultur zeigte mehrere zelluläre Prozesse, die die Gaumenfusion vermitteln 6 . Die Anfangskontakte zwischen zwei Epithelzellen werden durch Membranvorsprünge hergestellt ( Abbildung 2 B-2E ). Wenn sich zwei Epithelschichten treffen, bilden sie eine mehrzellige, geschichtete MES, gefolgt von einer Interkalation, um eine integrierte Einzelzellschicht MES durch epitheliale Konvergenz...

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Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Live-Bildgebung der Maus-Sekundär-Gaumen-Fusion mit konfokaler Mikroskopie. Dieses Protokoll kann in Kombination mit einer Vielzahl von fluoreszierenden Reporter-Maus-Linien und mit Pfad-Inhibitoren für mechanistische Einsicht verwendet werden. Dieses Protokoll kann für die Live-Bildgebung in anderen Entwicklungssystemen angepasst werden.

Live Imaging der Maus Sekundärer Gaumen Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

live-imaging-of-mouse-secondary-palate-fusion

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.5K Aufrufe.  University of California San Francisco.  Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Live-Bildgebung der Maus-Sekundär-Gaumen-Fusion mit konfokaler Mikroskopie. Dieses Protokoll kann in Kombination mit einer Vielzahl von fluoreszierenden Reporter-Maus-Linien und mit Pfad-Inhibitoren für mechanistische Einsicht verwendet werden. Dieses Protokoll kann für die Live-Bildgebung in anderen Entwicklungssystemen angepasst werden. 

Serie: Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-Bilder aus dem<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Augen

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily conserved structures that compose it are assembled remains under investigation. Their size and physiological features often constrain manipulation and imaging applications. The culture of immortalized cell lines is widely used, but it can only replicate the early steps of differentiation.
Here, we describe a protocol that enables easy genetic manipulation of myofibers originating from primary mouse myoblasts. After one week of differentiation, the myofibers display contractility, aligned sarcomeres and triads, as well as peripheral nuclei. The entire differentiation process can be followed by live imaging or immunofluorescence. This system combines the advantages of the existing ex vivo and in vitro protocols. The possibility of easy and efficient transfection as well as the ease of access to all differentiation stages broadens the potential applications. Myofibers can subsequently be used not only to address relevant developmental and cell biology questions, but also to reproduce muscle disease phenotypes for clinical applications.

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

In vitro Differenzierung von Mature Muskelfasern für Live - Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Live-konfokale Bildgebung Entwicklung Arabidopsis Blumen

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Langfristige Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Augen Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioengineering von humanisierten Knochenmark-Mikroumgebungen in der Maus und ihre Visualisierung durch Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In-vitro- Ovulum Anbau für Live Cell Imaging der Zygote Polarisation und Embryo Musterung in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Live Cell Imaging der Segregation der Chromosomen während der Mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Live Imaging und Analyse von Muskelkontraktionen im Drosophila-Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

Vaskuläres Gießen von Erwachsenen und frühpostnatalen Mauslungen für Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

Dissektion und Live-Imaging der späten embryonalen Drosophila-Gonade

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...