Diese Arbeit wurde durch die Operational Infrastructure Support der viktorianischen Staatsregierung und die australische Regierung NHMRC IRIISS ermöglicht und durch finanzielle Unterstützung des National Health and Medical Research Council (ALW #1120300) und des Australian Research Council (KJH #FT190100265) unterstützt. Die Autoren möchten die technische Unterstützung der Monash Animal Research Platform, Monash Histology Platform und Monash Micro Imaging Facility würdigen.

Eierstöcke wurden von weiblichen C57BL6J-Mäusen gesammelt. Alle tierischen Verfahren und Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Australischen Verhaltenskodex für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt und von der Monash Animal Research Platform Animal Ethics Committee genehmigt.
ANMERKUNG: Ein Chemotherapeutikum, das nachweislich primordiale Follikeloozyten erschöpft, wie mit Stereologie11 und direktenZählungen 12bestimmt,13 wurde in diesem Bericht verwendet, um die beiden Zählmethoden bei demselben Tier zu vergleichen. Weibliche, 8 Wochen alte (junge Erwachsene) Mäuse wurden vor einer einzigen intraperitonealen Injektion von 75 mg/kg/Körpergewicht von Cyclophosphamid oder einer sainen Fahrzeugkontrolle (n=5/Gruppe) gewogen. Es hat sich gezeigt, dass diese Dosis eine Erschöpfung der Urfollikel von ca. 50 % verursacht, aber nicht berichtet, dass sie Morbidität oder Mortalität bei Mäusen verursacht14. Die Eierstöcke wurden 48 Stunden nach der Behandlung geerntet. Ein Eierstock von jedem Tier wurde in 10% (v/v) neutral gepufferte Formalin-Lösung für 24 Stunden fixiert, und der andere in Bouins Lösung für 24 Stunden fixiert. Das Gewebe wurde dann entweder in Glykolmethacrylatharz eingebettet und seriell auf 20 m oder in Paraffin und seriell auf 5 m geschnitten. Alle Gewebe wurden mit Periodensäure Schiff und Hämatoxylin gefärbt.
1. Histologische Präparation: Fixierung, Verarbeitung, Einbettung und Schnitt von Maus-Ovarien
<ol><li>Sezieren Sie die Eierstöcke der Maus, indem Sie das Eileiter und das gesamte umgebende Fett schneiden, ohne den Eierstock selbst zu beschädigen oder zu schneiden. Verwenden Sie bei Bedarf für diesen Schritt ein Sezieren von Mikroskop und eine feine Klinge (Abbildung 1A).</li>
	<li>Beheben Sie Gewebe sofort, indem Sie es in ein kleines, beschriftetes Rohr legen, das entweder Bouins fixative (Stereologie) oder formalin fixative (direkte Zählungen) für 24 Stunden enthält(Abbildung 1B), bevor Gewebe in 70 % Ethanol übertragen werden. HINWEIS: Die Follikelmorphologie wird am besten in Bouins festem Eierstockgewebe konserviert und in Glykolmethacrylatharz eingebettet (Abbildung 2).</li>
	<li>Verarbeiten Sie ganze feste Eierstöcke und betten Sie dann in Glykolmethacrylatharz für die Stereologie (Ergänzende Akte 1), oder Paraffinwachs für direkte Zählungen mit einem Standard histologisches Protokoll. VORSICHT: Harz ist giftig, so stellen Sie sicher, dass alle Gewebeverarbeitungsschritte in einer Dunstabzugshaube durchgeführt werden und Handschuhe zu jeder Zeit getragen werden.</li>
	<li>Verwenden Sie ein spezielles Harzmethacrylat-Mikrotom (Abbildung 1C), das mit einem Glasmesser (Abbildung 1D) ausgestattet ist, um dicke Glycolmethacrylatharzabschnitte (z. B. 20 m) erschöpfend zu schneiden. Sammeln Sie die Abschnitte in regelmäßigen Abständen (z. B. jeden3. Abschnitt) auf Glasmikroskop-Dias für die Stereologie.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Standard-Mikrotom, um dünne Paraffinabschnitte (z. B. 4-6 m) zu schneiden. Sammeln Sie Gewebeabschnitte in regelmäßigen Abständen (z. B. jeden9. Abschnitt) auf einem Glasmikroskopschlitten für direkte Follikelzahlen.</li>
	<li>Die Dias mit periodischer Säure Schiff und Hämatoxylin(Ergänzungsdatei 2) beflecken</li>
	<li>Coverslip mit Standard-DPX für Paraffinprofile oder dickes DPX für Glycolmethacrylatharzabschnitte (Abbildung 1E). VORSICHT: Glycolmethacrylatharz DPX ist gefährlich, also führen Sie diesen Schritt in, um Dunstabzugshaube zu verwenden. HINWEIS: Glycolmethacrylatharz DPX ist extrem zähflüssig. Der Glasdeckel muss fest mit einem Spachtel nach unten gedrückt werden, um sicherzustellen, dass der DPX gleichmäßig und dünn dispergiert ist und unter dem Deckschein keine Luftblasen vorhanden sind (Abbildung 1F).</li>
</ol>2. Stereologische Schätzung der urzeitlichen Follikelzahl mit dem optischen Fractionator
<ol><li>Schalten Sie den Computer, die Multi-Control-Einheit, die Kamera und die Lichtquelle innerhalb des stereologischen Setups ein und stellen Sie das Mikroskopobjektiv auf eine geringe Vergrößerung (z. B. 10x).</li>
	<li>Öffnen Sie die Stereologie-Software.</li>
	<li>Setzen Sie den ersten Schlitten sicher auf die Mikroskopstufe.</li>
	<li>Stellen Sie die Lichtbelichtung ein, indem Sie im Bedienfeld "Kameraeinstellungen" (Ergänzende Abbildung 1A ) unter Automatisch unter Belichtung überprüfen. Alternativ können Sie die Lichtbelichtung manuell einstellen.</li>
	<li>Verwenden Sie den Joystick, um die erste Gewebeprobe zu lokalisieren und die Probe in den Fokus zu rücken.</li>
	<li>Passen Sie den Weißabgleich an, indem Sie entweder auf Weitere Einstellungen (unten rechts im Bedienfeld Kameraeinstellungen) klicken und dann auf Weißabgleich und auf Automatisch klicken (Ergänzende Abbildung 1B). Alternativ können Sie auf die Schaltfläche Weißabgleich neben der Schaltfläche Weitere Einstellungen (oder Bereich in weiteren Einstellungen auswählen ) klicken, um den Weißabgleich manuell festzulegen, indem Sie einen weißen Bereich im Abschnitt auswählen.</li>
	<li>Gehen Sie zum Dropdown-Menü "Sonden" und klicken Sie auf Optical Fractionator Workflow. Klicken Sie dann auf Neues Projekt starten und klicken Sie auf OK.
	<ol>
<li>Wenn eine vorhandene Sampling-Konfiguration gespeichert wurde, klicken Sie unter Sampling-Parameter auf Ja | ... und wählen Sie die gewünschte Sampling-Konfiguration aus.</li>
		<li>Wenn dies nicht der Fall ist, klicken Sie auf Nein, und geben Sie die Informationen zum seriellen Abschnitt (Ergänzende Abbildung 1C) manuell ein, und definieren Sie die Prüfpunktkonfiguration in Schritt 2.13.</li>
	</ol></li>
	<li>Klicken Sie auf Weiter, stellen Sie das Mikroskop auf Niedrige Vergrößerung ein und wählen Sie aus dem Dropdown-Menü die 10-fache Vergrößerung aus.</li>
	<li>Klicken Sie auf Weiter, und verfolgen Sie dann den gesamten Eierstockbereich – beginnen Sie mit einem links klickenden Abschnitt und klicken Sie am Ende mit der rechten Maustaste und wählen Sie Kontur schließen.</li>
	<li>Klicken Sie auf Weiter, stellen Sie das Mikroskop auf Hohe Vergrößerung und wählen Sie 100x Ölvergrößerung aus dem Dropdown-Menü.</li>
	<li>Legen Sie einen Tropfen Öl auf den Gewebebereich auf dem Dia und bewegen Sie das Mikroskopobjektiv auf die 100-fache Vergrößerung.</li>
	<li>Passen Sie die Lichtbelichtung an (wie in Schritt 2.4) und klicken Sie auf Weiter.</li>
	<li>Richten Sie die Sampling-Parameter ein, um die Prüfpunktkonfiguration zu definieren. Hier wurde der Zählrahmen auf 47,5 x 47,5 m (2.256,25 m2) und die Schrittlänge auf 100 x 100 m (10.000 m2) eingestellt (Zusatzabbildung 2). Nachdem die Samplingparameter festgelegt wurden, speichern Sie die Vorlage und öffnen Sie sie während der nachfolgenden Analysesitzungen unter Schritt 2.7 erneut.</li>
	<li>Klicken Sie auf Counting starten (Zusatzabbildung 1D). Konzentrieren Sie sich auf den Oberen Rand des Beispiels, klicken Sie auf OK, und beginnen Sie mit der Zählung.</li>
	<li>Verwenden Sie den Fokussierknopf, um sich durch die 10 m Probentiefe zu bewegen und alle Urfollikel zu zählen, deren Eizellenkern in den Fokus rückt. Klicken Sie auf Weiter, um zum nächsten Bereich zu wechseln.<ol>
<li>Klassifizieren Sie Follikel als Ur-Ur-Zellen, wenn die Oozyte von Plattenzellen (abgeflachten) Granulosazellen umgeben ist, aber keine quakodenalen Granulosazellen (Abbildung 2A). ANMERKUNG: Primordialfollikel unterscheiden sich von Zwischen-/Übergangsfollikel, die eine Kombination von quatolen und Plattenepithelzellen(Abbildung 2B) und Primärfollikel umfassen, die überwiegend von quaderalen Granulosazellen umgeben sind (Abbildung 2C). Diese Follikelklassen sollten separat quantifiziert werden.</li>
		<li>Zählen Sie nur Follikel, in denen der Eizellkern sichtbar ist. Der Oozytenkern muss innerhalb des Zählrahmens erscheinen oder die grünen Einschlusslinien des Zählrahmens berühren (Zusatzabbildung 1E,F).</li>
		<li>Wenn der Oozytenkern außerhalb des Zählrahmens liegt (Zusatzabbildung 1G) oder die roten Ausschlusslinien des Zählrahmens berührt, zählen Sie diesen Follikel nicht.</li>
		<li>Bei der Beurteilung des Urfollikelabbaus als Reaktion auf eine exogene Chemikalie (z. B. Chemotherapie) stellen Sie sicher, dass alle gezählten Follikel gesund sind und somit eine normale Morphologie haben (Abbildung 2). Zählen Sie alle abnormalen oder atretischen Follikel separat. Oft wird der Follikeltod durch Beleidigungen wie Chemotherapie induziert, und die Quantifizierung der atretischen Follikel sollte separat erfolgen, um zwischen gesunden und atretischen Follikel zu unterscheiden, da nur gesunde Follikel die Ovarialreserve15umfassen.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie nach Abschluss der Zählung in diesem Abschnitt eine der folgenden Schritte aus:<ol>
<li>Klicken Sie auf Neuer Abschnitt hinzufügen, und kehren Sie dann zu Schritt 2.3 zurück, um den nächsten Abschnitt für die Zählung einzurichten.</li>
		<li>Klicken Sie auf Ich habe die Zählung beendet, um die Sitzung zu beenden. Setzen Sie das Objektiv auf 10x zurück, beenden Sie die Stereologie-Software und schalten Sie die Lichtquelle, Kamera, Multi-Control-Einheit und Computer aus.</li>
	</ol></li>
	<li>Beziehen Sie die Summe Rohfollikelzahl (Q) aus jedem Gewebeabschnitt aus dem gesamten Eierstock, dann mit einer Tabelle, verwenden Sie die Gleichung unten, um den endgültigen Wert von jedem replizierenden Tier (N)4zu erhalten. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ01.jpg">Wo: N = Gesamtgeschätzte Anzahl der Follikel innerhalb des Eierstocks. Q = Rohe Urfollikelzahl. f1 = Abtastintervall. Jederdritte Abschnitt wurde so abgetastet. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ02.jpg"> f2 = Beziehung zwischen Zählrahmen (Beispielfläche) und Stepper, berechnet als <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ03.jpg"> . Da die Probenfläche 2256 m2 (47,5 x 47,5 m) betrug und die Schrittfläche 10000 m2 (100 x 100 m) <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ04.jpg"> betrug. f3 = Anteil des Eierstockschnitts. Da 10 m des 20-mm-Abschnitts abgetastet wurden, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ05.jpg"> . Daher. <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ06.jpg"> ANMERKUNG: Dieses Protokoll beschreibt, wie diese Prinzipien der stereologischen Analysen mit einer viel zitierten Stereologie-Software (Tabelle der Materialien)angewendet werden können; es steht jedoch eine andere stereologische Software zur Verfügung. Die Prinzipien, die bei stereologischen Analysen von Eierstockfollikel angewendet werden, sind die gleichen, unabhängig von der Software, die zum Einrichten der Parameter verwendet wird. Die Stereologie ist am genauesten, wenn 100 oder mehr Objekte in einem erwachsenen Maus-Ovarial4gezählt werden, da dies einen Fehlerkoeffizienten für die Schätzung unter 10%16ergibt. Die hier beschriebenen Stichprobenparameter wurden optimiert, um sicherzustellen, dass mindestens 100 Objekte (d. h. Ur-, Übergangs- und Primärfollikel) in der Kontrolle der adulten Wild-Typ C57BL6J-Eierstöcke gezählt werden können. Eine Pilotstudie mit einem kleinen Stichprobenumfang kann durchgeführt werden, um die optimalen Stichprobenparameter zu ermitteln, wie das Intervall und die Anzahl der zu analysierenden Abschnitte und die Anzahl der optischen Dissektoren innerhalb der stichprobenartig untersuchten Abschnitte17.</li>
</ol>3. Schätzung der Urfollikelzahl durch direkte Ovarialfollikelzahl
<ol><li>Platzieren Sie den Mikroskopschlitten sicher unter einem Standard-Lichtmikroskop und führen Sie direkte Zählungen durch, um eine rohe Urfollikelzahl zu erhalten.<ol>
<li>Klassifizieren Sie Follikel als Ur-Granulosa-Zellen, aber keine quaroilen Granulosazellen (Abbildung 2D). ANMERKUNG: Primordialfollikel unterscheiden sich von Zwischen-/Übergangsfollikel, die eine Kombination von quatolen und Plattenepithelzellen (Abbildung 2E) und Primärfollikel umfassen, die überwiegend von quaderalen Granulosazellen umgeben sind (Abbildung 2F). Diese Follikelklassen sollten separat quantifiziert werden.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass alle gezählten Follikel gesund sind und somit eine normale Morphologie haben (Abbildung 2). Zählen Sie alle abnormalen oder atretischen Follikel separat, da nur gesunde Follikel die Eierstockreserve umfassen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternativ können Sie mehrere oder genähte Hochleistungsphotomikroskope (z. B. 20x) des gesamten Eierstockgewebeabschnitts verwenden, um Zählungen durchzuführen, indem Sie die Bilddatei(en) öffnen. Dies kann manuell oder mit einem automatisierten Diascanner erfolgen.</li>
	<li>Erhalten Sie die Summe Rohfollikelzahl (Q) aus jedem Gewebeabschnitt, der im vorgegebenen Intervall aus dem gesamten Eierstock entnommen wird. Multiplizieren Sie diese Zahl mit der Umkehrung des Stichprobenbruchs, um den Endwert für jedes Replizierungstier (N) zu erhalten, wobei die folgende Gleichung verwendet wird. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ07.jpg">Wo: N = Gesamtgeschätzte Anzahl der Follikel innerhalb des Eierstocks. Q = Rohfollikelzahl (von jedem einzelnen Typ, separat berechnet). f1 = Abtastintervall. Jeder9. Abschnitt wurde so <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ08.jpg"> abgetastet. Daher. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ09.jpg"></li>
</ol>

<ol>
	<li>Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+capacity+of+oocytes+for+DNA+repair.">The capacity of oocytes for DNA repair.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).</li><li>Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+DNA+repair+for+maintaining+oocyte+quality+in+response+to+anti-cancer+treatments,+environmental+toxins+and+maternal+ageing.">The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing.</a> Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).</li><li>Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. 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S., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+iDISCO+and+CUBIC+tissue+clearing+and+lightsheet+microscopy+for+in+toto+analysis+of+the+adult+mouse+ovarydagger.">Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger.</a> Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).</li><li>Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+evaluation+of+murine+ovarian+follicles+using+a+modified+CUBIC+tissue+clearing+method.">Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieser Artikel enthält ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Goldstandard-Technik zur Aufzählung von Maus-Urfollikel, Stereologie und die am häufigsten verwendete Methode der direkten Follikelzählung. Die Chemotherapie wurde verwendet, um die Ergebnisse dieser beiden verschiedenen Methoden innerhalb des linken und rechten Eierstocks desselben Tieres zu vergleichen und zu vergleichen. Beide Methoden zeigten eine hohe variabilile Zwischentiervariabilität bei den ursprünglichen Follikelzahlen. Eine signifikante ...

Die unreifen, meiotisch verhafteten Eizellen, die in Urfollikel im Eierstock gelagert werden, sind die Lagereinheit für die weibliche Keimbahn und bilden die lebenslange Eierstockreserve eines Individuums. Primordial Follikel Zahlen sinken natürlich mit dem Alter1, oder alternativ, kann vorzeitig nach der Exposition gegenüber exogenen Chemikalien, einschließlich einiger Pharmazeutika und Umweltgifte in Luft, Lebensmittel und Wasser2. Da die ursprüngliche Follikelzahl endlich ist, bestimmen die Menge und Qualität der Follikel innerhalb des Eierstocks weitgehend die weibliche Fruchtbarkeit und die Gesundheit der Nachkommen. Daher ist eine genaue Quantifizierung der Urfollikelzahl bei Frauen für die Bewertung der außerhalb des Ziels von exogenen Beleidigungen auf die Eierstockreserve wichtigen Bedeutung.
Bei Frauen ist eine Analyse des gesamten Eierstocks im Allgemeinen nicht möglich, so dass nicht-invasive Ersatzmaßnahmen der Ovarialreserve in einem klinischen Umfeld eingesetzt werden müssen. Das Anti-M-Llerian-Hormon (AMH) ist der am weitesten verbreitete Ersatz-Biomarker klinisch3. Serum AMH-Spiegel werden oft bei Frauen im fortgeschrittenen mütterlichen Alter oder vor und nach der Krebsbehandlung, wie Chemotherapie, gemessen. AMH wird jedoch durch den Anbau von Follikel und nicht durch Urfollikel erzeugt, und daher informieren serumspiegel nicht über die absolute Urfollikelzahl.
Da es keine Methoden gibt, um die Primordialzahl bei Frauen in situgenau zu bestimmen, bleibt die Zählung der Eierstockfollikel in Kleintiermodellen wie Nagetieren ein wesentliches Forschungsinstrument, um zu beurteilen, inwieweit exogene Beleidigungen Auswirkungen auf die Urfollikel und damit auf die Fruchtbarkeit haben. Leider sind die Berichte in der gesamten Literatur über urfolgische Zahlen in Nagetiermodellen sehr variabel4. Ein Hauptgrund dafür sind weithin berichtete technische Unterschiede in der eingesetzten Zählmethode. Vor allem gibt es zwei verschiedene Techniken, die in der Literatur beschrieben werden, um Urfollikel bei Mäusen aufzuzählen. Dazu gehören die Stereologie, die die optische Dissektormethode des Fraktionators verwendet, und die Anzahl der direkten Follikel.
Die Stereologie wird weithin als Goldstandard angesehen, da sie systematische einheitliche Stichproben5verwendet, was sie zur genauesten Methode zur Quantifizierung der urtypischen Follikelzahl in der ganzen Maus oder Ratteneierstöcke4,6,7macht. Die Stereologie ist unvoreingenommen, da sie die dreidimensionale Struktur desObjektsvon Interesse 8 berücksichtigt. Mit Hilfe einer optischen Dissektor-/Fraktionatormethode werden drei Stichprobenebenen angewendet, um Urfollikel mit dicken Gewebeabschnitten (z. B. 20 m) innerhalb eines bekannten Bruchteils des gesamten Mausovarials zu quantifizieren. Zunächst wird das Stichprobenintervall (z. B. jederdritte Abschnitt) zu einem zufälligen Start gewählt (Sampling-Fraktion 1, f1)4. Die Abschnitte werden dann systematisch und einheitlich von diesem Punkt an durch den gesamten Eierstock abgetastet. Dann wird ein unvoreingenommener Zählrahmen über dem Eierstockbereich überlagert und nach und nach entlang eines definierten, randomisierten Zählrasters bewegt (Sampling-Fraktion 2, f2)8. Schließlich wird ein bekannter Bruchteil der Schnittdicke optisch beprobt (z.B. 10 m) und Follikel in diesem Bereich gezählt (Probenahmefraktion 3, f3)4. Die rohe Follikelzahl wird mit der Umkehrung dieser Stichprobenfraktionen multipliziert, um den Endwert zu erhalten. Diese Methode erfordert eine fachkundige Schulung und Ausrüstung, einschließlich eines Mikroskops mit einer motorisierten Bühne, die von stereologischer Software angetrieben wird. Gewebe sollten in einem speziellen Bouin-Fixativ konserviert und in Glycolmethacrylatharz eingebettet werden, damit dicke Gewebeabschnitte mit einem Glycolmethacrylatharz-Mikrotom mit einem Glasmesser geschnitten werden können. Diese Methode wurde entwickelt, um Gewebeschrumpfung und Verformung zu berücksichtigen, um die dreidimensionale morphologische Struktur des Eierstocks und der Follikel am besten zu erhalten9.
Die direkte Follikelzählung ist die am häufigsten verwendete Methode zum Zählen von Follikel10. Es können häufigere Fixative (d. h. Formalin) verwendet werden, gefolgt von Paraffinwachseinbettung und erschöpfender serieller Schnitte mit einem Standardmikrotome mit einer Dicke zwischen 4 und 6 m. Follikel werden systematisch im gesamten Gewebeabschnitt in einem definierten Intervall gezählt und dann mit der Umkehrung des Probenahmeintervalls multipliziert, um die Gesamtfollikelschätzung zu erhalten. Diese Methode ist schnell und einfach, kann mit archivierten Geweben durchgeführt und mit standardmäßigen histologischen Techniken vorbereitet werden. Es erfordert nur ein Lichtmikroskop mit Standard-Bildgebungsfunktionen. Trotz dieser Vorteile fehlt es der direkten Follikelzählung jedoch an Genauigkeit und strengen Zählparametern der Stereologie, was sie anfälliger für Voreingenommenheit der Prüfer macht. Darüber hinaus können Gewebe während der Verarbeitung schrumpfen und verformt werden, wodurch die Integrität und Morphologie des Eierstocks gestört wird und somit die Follikelklassifizierung und -quantifizierung erschwert wird.
Ziel dieses Artikels ist es, zwei häufig verwendete Methoden zur quantitativen Bewertung der Urfollikelzahl in den Eierstöcken der Maus zu beschreiben: Stereologie und direkte Follikelzählung. Wir werden detaillierte Protokolle für diese beiden Methoden bereitstellen und einige ihrer Stärken und Schwächen aufzeigen, um die Reproduzierbarkeit in unserem Bereich zu verbessern und es den Forschern zu ermöglichen, eine fundierte Entscheidung über die am besten geeignete Zählmethode für ihre Studien zu treffen.

<table><tbody><tr><td>1-Butanol (HPLC)</td><td>Fisher Chemical</td><td>#A383-1</td><td></td></tr><tr><td>Acid alcohol</td><td>Amber Scientific</td><td>#ACDL</td><td></td></tr><tr><td>Bouin&amp;rsquo;s fixative</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#HT10132</td><td>Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v)</td></tr><tr><td>Cyclophosphamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C0768-5G</td><td></td></tr><tr><td>Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#06522</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Amber Scientific</td><td>#ETH</td><td>Ethanol 100%</td></tr><tr><td>Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle</td><td>Designs for Vision</td><td>#FEA-745-SR</td><td>Feather blade for dissections (seen in Figure 1)</td></tr><tr><td>Formalin fixative</td><td>Australian Biostain</td><td>#ANBFC</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td>Thermo Scientific</td><td>#MENCS22501GP</td><td>22 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>Glycomethacrylate resin RM2165 microtome</td><td>Leica Microsystems</td><td>#RM2165</td><td></td></tr><tr><td>Glycolmethacrylate DPX</td><td>*made in house</td><td></td><td>*Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks</td></tr><tr><td>Histolene</td><td>Trajan</td><td>#11031</td><td></td></tr><tr><td>Mayer&amp;rsquo;s haematoxylin</td><td>Amber Scientific</td><td>#MH</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX50 microscope</td><td>Olympus</td><td>#BX50</td><td>Brightfield microscope fitted with 10x dry &amp;amp; 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3)</td></tr><tr><td>Olympus immersion oil type-F</td><td>Olympus</td><td>#IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>Olympus TH4-200 light source</td><td>Olympus</td><td>#TH4-200</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin wax</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#03987</td><td></td></tr><tr><td>Periodic acid</td><td>Trajan</td><td>#PERI1%</td><td>Periodic acid 1%</td></tr><tr><td>Rotary Microtome CUT 4060</td><td>MicroTec</td><td>#4060R/F</td><td>Used to cut paraffin sections</td></tr><tr><td>Schiff&amp;rsquo;s reagent</td><td>Trajan</td><td>#SCHF</td><td></td></tr><tr><td>Scott&#039;s tap water</td><td>Amber Scientific</td><td>#SCOT</td><td>Potassium carbonate, magnesium sulphate, water</td></tr><tr><td>StereoInvestigator Stereological System</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td>Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick</td></tr><tr><td>Superfrost microscope slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>#MENSF41296SP</td><td>1 mm, 72 pcs</td></tr><tr><td>Technovit 7100 Plastic embedding system</td><td>Emgrid Australia</td><td>#64709003</td><td>500 mL/5 x 1 g/40 mL</td></tr><tr><td>Technovit 3040 yellow</td><td>Emgrid Australia</td><td>#64708805</td><td>100 g/80 mL</td></tr></tbody></table>

accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries

Sexuell reproduzierende weibliche Säugetiere werden mit ihrer gesamten lebensleinen Versorgung mit Eizellen geboren. Unreife, stille Eizellen finden sich in den Urfollikel, der Speichereinheit der weiblichen Keimbahn. Sie sind nicht erneuerbar, so dass ihre Zahl bei der Geburt und anschließende Verlustrate weitgehend die weibliche fruchtbare Lebensdauer diktiert. Eine genaue Quantifizierung der Urfollikelzahlen bei Frauen und Tieren ist für die Bestimmung der Auswirkungen von Arzneimitteln und Giftstoffen auf die Eierstockreserve von entscheidender Bedeutung. Es ist auch notwendig, die Notwendigkeit und den Erfolg bestehender und neu entstehender Techniken zur Erhaltung der Fruchtbarkeit zu bewerten. Derzeit gibt es keine Methoden, um die Anzahl der Urfollikel, die die Eierstockreserve bei Frauen umfassen, genau zu messen. Darüber hinaus ist es oft nicht möglich, Eierstockgewebe von großen Tieren oder gefährdeten Arten für Experimente zu erhalten. So sind Mäuse zu einem wesentlichen Modell für solche Studien geworden, und die Fähigkeit, urfolale Follikelzahlen in ganzen Eierstöcken der Maus zu bewerten, ist ein entscheidendes Werkzeug. Berichte über absolute Follikelzahlen in den Eierstöcken der Maus in der Literatur sind jedoch sehr variabel, was es schwierig macht, Daten zu vergleichen und/oder zu replizieren. Dies ist auf eine Reihe von Faktoren wie Belastung, Alter, Behandlungsgruppen sowie technische Unterschiede in den methoden zur Zählung zurückzuführen. In diesem Artikel stellen wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Vorbereitung histologischer Abschnitte und das Zählen von Urfollikel in Denstöcken der Maus mit zwei verschiedenen Methoden bereit: [1] Stereologie, die sich auf die Fraktionator-/optische Dissektortechnik stützt; und [2] die direkte Zähltechnik. Einige der wichtigsten Vor- und Nachteile jeder Methode werden hervorgehoben, so dass die Reproduzierbarkeit vor Ort verbessert werden kann und die Forscher die am besten geeignete Methode für ihre Studien auswählen können.

Es wurde ein gut charakterisiertes Modell der Follikeldepletion verwendet, bei dem jungen erwachsenen weiblichen Mäusen eine Einzeldosis Cyclophosphamid-Chemotherapie oder kochische Fahrzeugkontrolle (n=5/Gruppe) verabreicht wurde und beide Eierstöcke nach 48 Stunden von jedem Tier geerntet wurden. Für jede der beiden Methoden wurde ein Eierstock pro Tier hergestellt, wie in Schritt 1 beschrieben: Stereologie oder direkte Zählung. Der linke und rechte Eierstock jedes Tieres wurde jeder Gruppe zufällig zugeordnet. Di...

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Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Hier beschreiben, vergleichen und kontrastieren wir zwei verschiedene Techniken für die genaue Follikelzählung von festen Eierstockgeweben der Maus.

Genaue Follikel-Aufzählung in adulten Maus-Ovarien

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

accurate-follicle-enumeration-in-adult-mouse-ovaries

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.1K Aufrufe.  Monash University. Hier beschreiben, vergleichen und kontrastieren wir zwei verschiedene Techniken für die genaue Follikelzählung von festen Eierstockgeweben der Maus.

Serie: Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

Kultur und Co-Kultur von Maus Eierstöcke und Eibläschen

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Retrieval of Mouse Oocytes

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), we are characterizing the salient differences needed to develop this system.  A primary goal has been to optimize oocyte/early embryo retrieval.

This protocol illustrates the technique for extracting oocytes or early-stage fertilized embryos from the oviduct of mice. The ability to identify the infindibulum and insert a blunt end needle into it is essential to correctly performing the procedure.

Retrieval von Maus-Oozyten

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

Biologie

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

In-vitro- Wachstum der Maus Preantral Follikel in simulierter Schwerelosigkeit

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus improving the overall pregnancy outcome. We recently developed a classification method based on microscopic live observations of mouse oocytes during their in vitro maturation from the germinal vesicle (GV) to the metaphase II stage, followed by the analysis of the cytoplasmic movements occurring during this time-lapse period. Here, we present detailed protocols of this procedure. Oocytes are isolated from fully-grown antral follicles and cultured for 15 h inside a microscope equipped for time-lapse analysis at 37 &#176;C and 5% CO2. Pictures are taken at 8 min intervals. The images are analyzed using the Particle Image Velocimetry (PIV) method that calculates, for each oocyte, the profile of Cytoplasmic Movement Velocities (CMVs) occurring throughout the culture period. Finally, the CMVs of each single oocyte are fed through a mathematical classification tool (Feed-forward Artificial Neural Network, FANN), which predicts the probability of a gamete to be developmentally competent or incompetent with an accuracy of 91.03%. This protocol, set up for the mouse, could now be tested on oocytes of other species, including humans.

Here, we present a protocol for non-invasive assessment of oocyte developmental competence performed during their in vitro maturation from the germinal vesicle to the metaphase II stage. This method combines time-lapse imaging with particle image velocimetry (PIV) and neural network analyses.

Eine neuronale Netzwerk-basierte Identifikation der entwicklungsgeschichtlich zuständigen oder inkompetent Maus ausgewachsene Eizellen

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

Ganze Mount Immunfluoreszenz und Follikel Quantifizierung der kultivierten Maus Eierstöcke

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

Ovarian Tissue Culture Phänomene in der Maus Eierstock zu visualisieren

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells entering meiotic prophase I are eliminated during Fetal Oocyte Attrition (FOA) and the first week of postnatal life. Three major mechanisms regulate the number of oocytes that survive during development and establish the ovarian reserve in females entering puberty. In the first wave of oocyte loss, 30-50% of the oocytes are eliminated during early FOA, a phenomenon that is attributed to high Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) expression. The second wave of oocyte loss is the elimination of oocytes with meiotic defects by a meiotic quality checkpoint. The third wave of oocyte loss occurs perinatally during primordial follicle formation when some oocytes fail to form follicles. It remains unclear what regulates each of these three waves of oocyte loss and how they shape the ovarian reserve in either mice or humans.
Immunofluorescence and 3D visualization have opened a new avenue to image and analyze oocyte development in the context of the whole ovary rather than in less informative 2D sections. This article provides a comprehensive protocol for whole ovary immunostaining and optical clearing, yielding preparations for imaging using multiphoton microscopy and 3D modeling using commercially available software. It shows how this method can be used to show the dynamics of oocyte attrition during ovarian development in C57BL/6J mice and quantify oocyte loss during the three waves of oocyte elimination. This protocol can be applied to prenatal and early postnatal ovaries for oocyte visualization and quantification, as well as other quantitative approaches. Importantly, the protocol was strategically developed to accommodate high-throughput, reliable, and repeatable processing that can meet the needs in toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Here, we present an optimized protocol for imaging entire ovaries for quantitative and qualitative analyses using whole-mount immunostaining, multiphoton microscopy, and 3D visualization and analysis. This protocol accommodates high-throughput, reliable, and repeatable processing that is applicable for toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Immunfluoreszenz, Clearing und Multiphotonenmikroskopie des gesamten Eierstocks zur quantitativen 3D-Analyse der sich entwickelnden Ovarialreserve in der Maus

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine system, but the complex structural relationships and three-dimensional (3D) vasculature architectures of the ovary are not well described. In order to visualize the 3D connections and architecture of blood vessels in the intact ovary, the first important step is to make the ovary optically clear. In order to avoid tissue shrinkage, we used the hydrogel fixation-based passive CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) protocol method to clear an intact ovary. Immunostaining, advanced multiphoton confocal microscopy, and 3D image-reconstructions were then used for the visualization of ovarian vessels and follicular capillaries. Using this approach, we showed a significant positive correlation (P &#60;0.01) between the length of the follicular capillaries and volume of the follicular wall.

Here we present an adaptation of the passive CLARITY and 3D reconstruction method for visualization of the ovarian vasculature and follicular capillaries in intact mouse ovaries.

Dreidimensionale Rekonstruktion der vaskulären Architektur des Eierstocks Passive Klarheit geclearte Maus

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Entwicklung eines ovariektomierten Mausmodells mit erhöhtem FSH-Spiegel

Exploring Independent Effects of Follicle-Stimulating Hormone In Vivo in a Mouse Model

During the transition from a reproductive to a nonreproductive phase (menopause), many women experience significant physiological and pathological changes, including decreased bone mass, increased blood lipids, and increased visceral adiposity. Levels of follicle-stimulating hormone (FSH) rise during the menopausal transition. Many studies have shown that FSH in various extragonadal tissues and organs is associated with the pathogenesis of multiple diseases. Thus, building an animal model that can help study the independent effects of FSH in vivo is particularly important. In this study, C57BL/6 female mice were ovariectomized and supplemented with estradiol valerate (OVX + E2) to eliminate the effect of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. The OVX + E2 mice received solvent (N.S.) or different doses of recombinant FSH via intraperitoneal injection to create a mouse model (OVF) characterized by relatively stable estrogen and rising FSH levels. Thus, we successfully generated an experimental mouse model to mimic the early stage of menopause transition, characterized by elevated serum FSH levels. The OVF model has the advantages of being stable, low cost, and easy to operate, which is suitable for studies to explore the extragonadal actions of FSH. Here, we describe detailed protocols for the mouse OVF model.

Autoren-Spotlight: Untersuchung des Zusammenhangs zwischen FSH und pathophysiologischen Veränderungen bei perimenopausalen Frauen - Erkenntnisse aus einem Mausmodell 

Follicle-stimulating hormone (FSH) in various extragonadal tissues and organs is associated with the pathogenesis of multiple diseases. The ovariectomized and FSH-treated mouse model (OVF) can be used to explore the extragonadal actions of FSH.