Diese Arbeit wurde durch die Operational Infrastructure Support der viktorianischen Staatsregierung und die australische Regierung NHMRC IRIISS ermöglicht und durch finanzielle Unterstützung des National Health and Medical Research Council (ALW #1120300) und des Australian Research Council (KJH #FT190100265) unterstützt. Die Autoren möchten die technische Unterstützung der Monash Animal Research Platform, Monash Histology Platform und Monash Micro Imaging Facility würdigen.

Eierstöcke wurden von weiblichen C57BL6J-Mäusen gesammelt. Alle tierischen Verfahren und Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Australischen Verhaltenskodex für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt und von der Monash Animal Research Platform Animal Ethics Committee genehmigt.
ANMERKUNG: Ein Chemotherapeutikum, das nachweislich primordiale Follikeloozyten erschöpft, wie mit Stereologie11 und direktenZählungen 12bestimmt,13 wurde in diesem Bericht verwendet, um die beiden Zählmethoden bei demselben Tier zu vergleichen. Weibliche, 8 Wochen alte (junge Erwachsene) Mäuse wurden vor einer einzigen intraperitonealen Injektion von 75 mg/kg/Körpergewicht von Cyclophosphamid oder einer sainen Fahrzeugkontrolle (n=5/Gruppe) gewogen. Es hat sich gezeigt, dass diese Dosis eine Erschöpfung der Urfollikel von ca. 50 % verursacht, aber nicht berichtet, dass sie Morbidität oder Mortalität bei Mäusen verursacht14. Die Eierstöcke wurden 48 Stunden nach der Behandlung geerntet. Ein Eierstock von jedem Tier wurde in 10% (v/v) neutral gepufferte Formalin-Lösung für 24 Stunden fixiert, und der andere in Bouins Lösung für 24 Stunden fixiert. Das Gewebe wurde dann entweder in Glykolmethacrylatharz eingebettet und seriell auf 20 m oder in Paraffin und seriell auf 5 m geschnitten. Alle Gewebe wurden mit Periodensäure Schiff und Hämatoxylin gefärbt.
1. Histologische Präparation: Fixierung, Verarbeitung, Einbettung und Schnitt von Maus-Ovarien
<ol><li>Sezieren Sie die Eierstöcke der Maus, indem Sie das Eileiter und das gesamte umgebende Fett schneiden, ohne den Eierstock selbst zu beschädigen oder zu schneiden. Verwenden Sie bei Bedarf für diesen Schritt ein Sezieren von Mikroskop und eine feine Klinge (Abbildung 1A).</li>
	<li>Beheben Sie Gewebe sofort, indem Sie es in ein kleines, beschriftetes Rohr legen, das entweder Bouins fixative (Stereologie) oder formalin fixative (direkte Zählungen) für 24 Stunden enthält(Abbildung 1B), bevor Gewebe in 70 % Ethanol übertragen werden. HINWEIS: Die Follikelmorphologie wird am besten in Bouins festem Eierstockgewebe konserviert und in Glykolmethacrylatharz eingebettet (Abbildung 2).</li>
	<li>Verarbeiten Sie ganze feste Eierstöcke und betten Sie dann in Glykolmethacrylatharz für die Stereologie (Ergänzende Akte 1), oder Paraffinwachs für direkte Zählungen mit einem Standard histologisches Protokoll. VORSICHT: Harz ist giftig, so stellen Sie sicher, dass alle Gewebeverarbeitungsschritte in einer Dunstabzugshaube durchgeführt werden und Handschuhe zu jeder Zeit getragen werden.</li>
	<li>Verwenden Sie ein spezielles Harzmethacrylat-Mikrotom (Abbildung 1C), das mit einem Glasmesser (Abbildung 1D) ausgestattet ist, um dicke Glycolmethacrylatharzabschnitte (z. B. 20 m) erschöpfend zu schneiden. Sammeln Sie die Abschnitte in regelmäßigen Abständen (z. B. jeden3. Abschnitt) auf Glasmikroskop-Dias für die Stereologie.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Standard-Mikrotom, um dünne Paraffinabschnitte (z. B. 4-6 m) zu schneiden. Sammeln Sie Gewebeabschnitte in regelmäßigen Abständen (z. B. jeden9. Abschnitt) auf einem Glasmikroskopschlitten für direkte Follikelzahlen.</li>
	<li>Die Dias mit periodischer Säure Schiff und Hämatoxylin(Ergänzungsdatei 2) beflecken</li>
	<li>Coverslip mit Standard-DPX für Paraffinprofile oder dickes DPX für Glycolmethacrylatharzabschnitte (Abbildung 1E). VORSICHT: Glycolmethacrylatharz DPX ist gefährlich, also führen Sie diesen Schritt in, um Dunstabzugshaube zu verwenden. HINWEIS: Glycolmethacrylatharz DPX ist extrem zähflüssig. Der Glasdeckel muss fest mit einem Spachtel nach unten gedrückt werden, um sicherzustellen, dass der DPX gleichmäßig und dünn dispergiert ist und unter dem Deckschein keine Luftblasen vorhanden sind (Abbildung 1F).</li>
</ol>2. Stereologische Schätzung der urzeitlichen Follikelzahl mit dem optischen Fractionator
<ol><li>Schalten Sie den Computer, die Multi-Control-Einheit, die Kamera und die Lichtquelle innerhalb des stereologischen Setups ein und stellen Sie das Mikroskopobjektiv auf eine geringe Vergrößerung (z. B. 10x).</li>
	<li>Öffnen Sie die Stereologie-Software.</li>
	<li>Setzen Sie den ersten Schlitten sicher auf die Mikroskopstufe.</li>
	<li>Stellen Sie die Lichtbelichtung ein, indem Sie im Bedienfeld "Kameraeinstellungen" (Ergänzende Abbildung 1A ) unter Automatisch unter Belichtung überprüfen. Alternativ können Sie die Lichtbelichtung manuell einstellen.</li>
	<li>Verwenden Sie den Joystick, um die erste Gewebeprobe zu lokalisieren und die Probe in den Fokus zu rücken.</li>
	<li>Passen Sie den Weißabgleich an, indem Sie entweder auf Weitere Einstellungen (unten rechts im Bedienfeld Kameraeinstellungen) klicken und dann auf Weißabgleich und auf Automatisch klicken (Ergänzende Abbildung 1B). Alternativ können Sie auf die Schaltfläche Weißabgleich neben der Schaltfläche Weitere Einstellungen (oder Bereich in weiteren Einstellungen auswählen ) klicken, um den Weißabgleich manuell festzulegen, indem Sie einen weißen Bereich im Abschnitt auswählen.</li>
	<li>Gehen Sie zum Dropdown-Menü "Sonden" und klicken Sie auf Optical Fractionator Workflow. Klicken Sie dann auf Neues Projekt starten und klicken Sie auf OK.
	<ol>
<li>Wenn eine vorhandene Sampling-Konfiguration gespeichert wurde, klicken Sie unter Sampling-Parameter auf Ja | ... und wählen Sie die gewünschte Sampling-Konfiguration aus.</li>
		<li>Wenn dies nicht der Fall ist, klicken Sie auf Nein, und geben Sie die Informationen zum seriellen Abschnitt (Ergänzende Abbildung 1C) manuell ein, und definieren Sie die Prüfpunktkonfiguration in Schritt 2.13.</li>
	</ol></li>
	<li>Klicken Sie auf Weiter, stellen Sie das Mikroskop auf Niedrige Vergrößerung ein und wählen Sie aus dem Dropdown-Menü die 10-fache Vergrößerung aus.</li>
	<li>Klicken Sie auf Weiter, und verfolgen Sie dann den gesamten Eierstockbereich – beginnen Sie mit einem links klickenden Abschnitt und klicken Sie am Ende mit der rechten Maustaste und wählen Sie Kontur schließen.</li>
	<li>Klicken Sie auf Weiter, stellen Sie das Mikroskop auf Hohe Vergrößerung und wählen Sie 100x Ölvergrößerung aus dem Dropdown-Menü.</li>
	<li>Legen Sie einen Tropfen Öl auf den Gewebebereich auf dem Dia und bewegen Sie das Mikroskopobjektiv auf die 100-fache Vergrößerung.</li>
	<li>Passen Sie die Lichtbelichtung an (wie in Schritt 2.4) und klicken Sie auf Weiter.</li>
	<li>Richten Sie die Sampling-Parameter ein, um die Prüfpunktkonfiguration zu definieren. Hier wurde der Zählrahmen auf 47,5 x 47,5 m (2.256,25 m2) und die Schrittlänge auf 100 x 100 m (10.000 m2) eingestellt (Zusatzabbildung 2). Nachdem die Samplingparameter festgelegt wurden, speichern Sie die Vorlage und öffnen Sie sie während der nachfolgenden Analysesitzungen unter Schritt 2.7 erneut.</li>
	<li>Klicken Sie auf Counting starten (Zusatzabbildung 1D). Konzentrieren Sie sich auf den Oberen Rand des Beispiels, klicken Sie auf OK, und beginnen Sie mit der Zählung.</li>
	<li>Verwenden Sie den Fokussierknopf, um sich durch die 10 m Probentiefe zu bewegen und alle Urfollikel zu zählen, deren Eizellenkern in den Fokus rückt. Klicken Sie auf Weiter, um zum nächsten Bereich zu wechseln.<ol>
<li>Klassifizieren Sie Follikel als Ur-Ur-Zellen, wenn die Oozyte von Plattenzellen (abgeflachten) Granulosazellen umgeben ist, aber keine quakodenalen Granulosazellen (Abbildung 2A). ANMERKUNG: Primordialfollikel unterscheiden sich von Zwischen-/Übergangsfollikel, die eine Kombination von quatolen und Plattenepithelzellen(Abbildung 2B) und Primärfollikel umfassen, die überwiegend von quaderalen Granulosazellen umgeben sind (Abbildung 2C). Diese Follikelklassen sollten separat quantifiziert werden.</li>
		<li>Zählen Sie nur Follikel, in denen der Eizellkern sichtbar ist. Der Oozytenkern muss innerhalb des Zählrahmens erscheinen oder die grünen Einschlusslinien des Zählrahmens berühren (Zusatzabbildung 1E,F).</li>
		<li>Wenn der Oozytenkern außerhalb des Zählrahmens liegt (Zusatzabbildung 1G) oder die roten Ausschlusslinien des Zählrahmens berührt, zählen Sie diesen Follikel nicht.</li>
		<li>Bei der Beurteilung des Urfollikelabbaus als Reaktion auf eine exogene Chemikalie (z. B. Chemotherapie) stellen Sie sicher, dass alle gezählten Follikel gesund sind und somit eine normale Morphologie haben (Abbildung 2). Zählen Sie alle abnormalen oder atretischen Follikel separat. Oft wird der Follikeltod durch Beleidigungen wie Chemotherapie induziert, und die Quantifizierung der atretischen Follikel sollte separat erfolgen, um zwischen gesunden und atretischen Follikel zu unterscheiden, da nur gesunde Follikel die Ovarialreserve15umfassen.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie nach Abschluss der Zählung in diesem Abschnitt eine der folgenden Schritte aus:<ol>
<li>Klicken Sie auf Neuer Abschnitt hinzufügen, und kehren Sie dann zu Schritt 2.3 zurück, um den nächsten Abschnitt für die Zählung einzurichten.</li>
		<li>Klicken Sie auf Ich habe die Zählung beendet, um die Sitzung zu beenden. Setzen Sie das Objektiv auf 10x zurück, beenden Sie die Stereologie-Software und schalten Sie die Lichtquelle, Kamera, Multi-Control-Einheit und Computer aus.</li>
	</ol></li>
	<li>Beziehen Sie die Summe Rohfollikelzahl (Q) aus jedem Gewebeabschnitt aus dem gesamten Eierstock, dann mit einer Tabelle, verwenden Sie die Gleichung unten, um den endgültigen Wert von jedem replizierenden Tier (N)4zu erhalten. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ01.jpg">Wo: N = Gesamtgeschätzte Anzahl der Follikel innerhalb des Eierstocks. Q = Rohe Urfollikelzahl. f1 = Abtastintervall. Jederdritte Abschnitt wurde so abgetastet. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ02.jpg"> f2 = Beziehung zwischen Zählrahmen (Beispielfläche) und Stepper, berechnet als <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ03.jpg"> . Da die Probenfläche 2256 m2 (47,5 x 47,5 m) betrug und die Schrittfläche 10000 m2 (100 x 100 m) <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ04.jpg"> betrug. f3 = Anteil des Eierstockschnitts. Da 10 m des 20-mm-Abschnitts abgetastet wurden, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ05.jpg"> . Daher. <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ06.jpg"> ANMERKUNG: Dieses Protokoll beschreibt, wie diese Prinzipien der stereologischen Analysen mit einer viel zitierten Stereologie-Software (Tabelle der Materialien)angewendet werden können; es steht jedoch eine andere stereologische Software zur Verfügung. Die Prinzipien, die bei stereologischen Analysen von Eierstockfollikel angewendet werden, sind die gleichen, unabhängig von der Software, die zum Einrichten der Parameter verwendet wird. Die Stereologie ist am genauesten, wenn 100 oder mehr Objekte in einem erwachsenen Maus-Ovarial4gezählt werden, da dies einen Fehlerkoeffizienten für die Schätzung unter 10%16ergibt. Die hier beschriebenen Stichprobenparameter wurden optimiert, um sicherzustellen, dass mindestens 100 Objekte (d. h. Ur-, Übergangs- und Primärfollikel) in der Kontrolle der adulten Wild-Typ C57BL6J-Eierstöcke gezählt werden können. Eine Pilotstudie mit einem kleinen Stichprobenumfang kann durchgeführt werden, um die optimalen Stichprobenparameter zu ermitteln, wie das Intervall und die Anzahl der zu analysierenden Abschnitte und die Anzahl der optischen Dissektoren innerhalb der stichprobenartig untersuchten Abschnitte17.</li>
</ol>3. Schätzung der Urfollikelzahl durch direkte Ovarialfollikelzahl
<ol><li>Platzieren Sie den Mikroskopschlitten sicher unter einem Standard-Lichtmikroskop und führen Sie direkte Zählungen durch, um eine rohe Urfollikelzahl zu erhalten.<ol>
<li>Klassifizieren Sie Follikel als Ur-Granulosa-Zellen, aber keine quaroilen Granulosazellen (Abbildung 2D). ANMERKUNG: Primordialfollikel unterscheiden sich von Zwischen-/Übergangsfollikel, die eine Kombination von quatolen und Plattenepithelzellen (Abbildung 2E) und Primärfollikel umfassen, die überwiegend von quaderalen Granulosazellen umgeben sind (Abbildung 2F). Diese Follikelklassen sollten separat quantifiziert werden.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass alle gezählten Follikel gesund sind und somit eine normale Morphologie haben (Abbildung 2). Zählen Sie alle abnormalen oder atretischen Follikel separat, da nur gesunde Follikel die Eierstockreserve umfassen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternativ können Sie mehrere oder genähte Hochleistungsphotomikroskope (z. B. 20x) des gesamten Eierstockgewebeabschnitts verwenden, um Zählungen durchzuführen, indem Sie die Bilddatei(en) öffnen. Dies kann manuell oder mit einem automatisierten Diascanner erfolgen.</li>
	<li>Erhalten Sie die Summe Rohfollikelzahl (Q) aus jedem Gewebeabschnitt, der im vorgegebenen Intervall aus dem gesamten Eierstock entnommen wird. Multiplizieren Sie diese Zahl mit der Umkehrung des Stichprobenbruchs, um den Endwert für jedes Replizierungstier (N) zu erhalten, wobei die folgende Gleichung verwendet wird. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ07.jpg">Wo: N = Gesamtgeschätzte Anzahl der Follikel innerhalb des Eierstocks. Q = Rohfollikelzahl (von jedem einzelnen Typ, separat berechnet). f1 = Abtastintervall. Jeder9. Abschnitt wurde so <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ08.jpg"> abgetastet. Daher. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ09.jpg"></li>
</ol>

<ol>
	<li>Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+capacity+of+oocytes+for+DNA+repair.">The capacity of oocytes for DNA repair.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).</li><li>Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+DNA+repair+for+maintaining+oocyte+quality+in+response+to+anti-cancer+treatments,+environmental+toxins+and+maternal+ageing.">The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing.</a> Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).</li><li>Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Mullerian+hormone:+ovarian+reserve+testing+and+its+potential+clinical+implications.">Anti-Mullerian hormone: ovarian reserve testing and its potential clinical implications.</a> Human Reproduction Update. 20 (5), 688-701 (2014).</li><li>Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+quantifying+follicular+numbers+within+the+mouse+ovary.">Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary.</a> Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).</li><li>Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereology:+introduction+to+basic+concepts+and+practical+approaches+for+estimation+of+cell+number.">Design-based stereology: introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number.</a> Toxicologic Pathology. 38 (7), 1011-1025 (2010).</li><li>Ristic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+dexamethasone+treatment+reduces+ovarian+follicle+number+in+neonatal+rat+offspring.">Maternal dexamethasone treatment reduces ovarian follicle number in neonatal rat offspring.</a> Journal of Microscopy. 232 (3), 549-557 (2008).</li><li>Soleimani Mehranjani, M., Mansoori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+study+on+the+effect+of+vitamin+C+in+preventing+the+adverse+effects+of+bisphenol+A+on+rat+ovary.">Stereological study on the effect of vitamin C in preventing the adverse effects of bisphenol A on rat ovary.</a> International Journal of Reproductive Biomedicine (Yazd). 14 (6), 403-410 (2016).</li><li>Brown, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bias+in+image+analysis+and+its+solution:+unbiased+stereology.">Bias in image analysis and its solution: unbiased stereology.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 30 (3), 183-191 (2017).</li><li>Hasselholt, S., Lykkesfeldt, J., Overgaard Larsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thick+methacrylate+sections+devoid+of+lost+caps+simplify+stereological+quantifications+based+on+the+optical+fractionator+design.">Thick methacrylate sections devoid of lost caps simplify stereological quantifications based on the optical fractionator design.</a> Anatomical Record (Hoboken). 298 (12), 2141-2150 (2015).</li><li>Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicle+counts--not+as+simple+as+1,+2,+3.">Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).</li><li>Nguyen, Q. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+PUMA+protects+the+ovarian+reserve+during+DNA-damaging+chemotherapy+and+preserves+fertility.">Loss of PUMA protects the ovarian reserve during DNA-damaging chemotherapy and preserves fertility.</a> Cell Death and Disease. 9 (6), 618 (2018).</li><li>Meirow, D., Assad, G., Dor, J., Rabinovici, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GnRH+antagonist+cetrorelix+reduces+cyclophosphamide-induced+ovarian+follicular+destruction+in+mice.">The GnRH antagonist cetrorelix reduces cyclophosphamide-induced ovarian follicular destruction in mice.</a> Human Reproduction. 19 (6), 1294-1299 (2004).</li><li>Winship, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PARP+inhibitor,+olaparib,+depletes+the+ovarian+reserve+in+mice:+implications+for+fertility+preservation.">The PARP inhibitor, olaparib, depletes the ovarian reserve in mice: implications for fertility preservation.</a> Human Reproduction. , (2020).</li><li>Meirow, D., Lewis, H., Nugent, D., Epstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclinical+depletion+of+primordial+follicular+reserve+in+mice+treated+with+cyclophosphamide:+clinical+importance+and+proposed+accurate+investigative+tool.">Subclinical depletion of primordial follicular reserve in mice treated with cyclophosphamide: clinical importance and proposed accurate investigative tool.</a> Human Reproduction. 14 (7), 1903-1907 (1999).</li><li>Nguyen, Q. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-+and+cyclophosphamide-induced+primordial+follicle+depletion+is+caused+by+direct+damage+to+oocytes.">Cisplatin- and cyclophosphamide-induced primordial follicle depletion is caused by direct damage to oocytes.</a> Molecular Human Reproduction. , (2019).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology+and+its+prediction.">The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction.</a> Journal of Microscopy. 147, 229-263 (1987).</li><li>Olesen, M. V., Needham, E. K., Pakkenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Optical+Fractionator+Technique+to+Estimate+Cell+Numbers+in+a+Rat+Model+of+Electroconvulsive+Therapy.">The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55737 (2017).</li><li>Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Is+the+Number+of+Primordial+Follicles+in+the+Ovarian+Reserve+Established.">How Is the Number of Primordial Follicles in the Ovarian Reserve Established.</a> Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).</li><li>Omari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mcl-1+is+a+key+regulator+of+the+ovarian+reserve.">Mcl-1 is a key regulator of the ovarian reserve.</a> Cell Death and Disease. 6, 1755 (2015).</li><li>Winship, A. L., Bakai, M., Sarma, U., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dacarbazine+depletes+the+ovarian+reserve+in+mice+and+depletion+is+enhanced+with+age.">Dacarbazine depletes the ovarian reserve in mice and depletion is enhanced with age.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6516 (2018).</li><li>Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+accurate,+simple+method+for+unbiased+determination+of+primordial+follicle+number+in+the+primate+ovary.">An accurate, simple method for unbiased determination of primordial follicle number in the primate ovary.</a> Biology of Reproduction. 56 (4), 909-915 (1997).</li><li>Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+primordial+follicle+number+in+pigtailed+monkey+ovaries:+symmetry+and+relationship+with+age.">Morphometric analysis of primordial follicle number in pigtailed monkey ovaries: symmetry and relationship with age.</a> Biology of Reproduction. 61 (2), 553-556 (1999).</li><li>Charleston, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+human+ovarian+non-growing+follicle+number:+the+application+of+modern+stereology+techniques+to+an+old+problem.">Estimating human ovarian non-growing follicle number: the application of modern stereology techniques to an old problem.</a> Human Reproduction. 22 (8), 2103-2110 (2007).</li><li>Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+primordial+and+nongrowing+follicle+counts+according+to+the+Stages+of+Reproductive+Aging+Workshop+(STRAW)+staging+system.">Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW) staging system.</a> Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).</li><li>Hansen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+reproductive+aging:+the+decline+in+ovarian+non-growing+follicle+number+from+birth+to+menopause.">A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause.</a> Human Reproduction. 23 (3), 699-708 (2008).</li><li>Sonigo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+ovarian+follicle+counting+by+an+innovative+deep+learning+approach.">High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).</li><li>McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+iDISCO+and+CUBIC+tissue+clearing+and+lightsheet+microscopy+for+in+toto+analysis+of+the+adult+mouse+ovarydagger.">Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger.</a> Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).</li><li>Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+evaluation+of+murine+ovarian+follicles+using+a+modified+CUBIC+tissue+clearing+method.">Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieser Artikel enthält ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Goldstandard-Technik zur Aufzählung von Maus-Urfollikel, Stereologie und die am häufigsten verwendete Methode der direkten Follikelzählung. Die Chemotherapie wurde verwendet, um die Ergebnisse dieser beiden verschiedenen Methoden innerhalb des linken und rechten Eierstocks desselben Tieres zu vergleichen und zu vergleichen. Beide Methoden zeigten eine hohe variabilile Zwischentiervariabilität bei den ursprünglichen Follikelzahlen. Eine signifikante ...

Die unreifen, meiotisch verhafteten Eizellen, die in Urfollikel im Eierstock gelagert werden, sind die Lagereinheit für die weibliche Keimbahn und bilden die lebenslange Eierstockreserve eines Individuums. Primordial Follikel Zahlen sinken natürlich mit dem Alter1, oder alternativ, kann vorzeitig nach der Exposition gegenüber exogenen Chemikalien, einschließlich einiger Pharmazeutika und Umweltgifte in Luft, Lebensmittel und Wasser2. Da die ursprüngliche Follikelzahl endlich ist, bestimmen die Menge und Qualität der Follikel innerhalb des Eierstocks weitgehend die weibliche Fruchtbarkeit und die Gesundheit der Nachkommen. Daher ist eine genaue Quantifizierung der Urfollikelzahl bei Frauen für die Bewertung der außerhalb des Ziels von exogenen Beleidigungen auf die Eierstockreserve wichtigen Bedeutung.
Bei Frauen ist eine Analyse des gesamten Eierstocks im Allgemeinen nicht möglich, so dass nicht-invasive Ersatzmaßnahmen der Ovarialreserve in einem klinischen Umfeld eingesetzt werden müssen. Das Anti-M-Llerian-Hormon (AMH) ist der am weitesten verbreitete Ersatz-Biomarker klinisch3. Serum AMH-Spiegel werden oft bei Frauen im fortgeschrittenen mütterlichen Alter oder vor und nach der Krebsbehandlung, wie Chemotherapie, gemessen. AMH wird jedoch durch den Anbau von Follikel und nicht durch Urfollikel erzeugt, und daher informieren serumspiegel nicht über die absolute Urfollikelzahl.
Da es keine Methoden gibt, um die Primordialzahl bei Frauen in situgenau zu bestimmen, bleibt die Zählung der Eierstockfollikel in Kleintiermodellen wie Nagetieren ein wesentliches Forschungsinstrument, um zu beurteilen, inwieweit exogene Beleidigungen Auswirkungen auf die Urfollikel und damit auf die Fruchtbarkeit haben. Leider sind die Berichte in der gesamten Literatur über urfolgische Zahlen in Nagetiermodellen sehr variabel4. Ein Hauptgrund dafür sind weithin berichtete technische Unterschiede in der eingesetzten Zählmethode. Vor allem gibt es zwei verschiedene Techniken, die in der Literatur beschrieben werden, um Urfollikel bei Mäusen aufzuzählen. Dazu gehören die Stereologie, die die optische Dissektormethode des Fraktionators verwendet, und die Anzahl der direkten Follikel.
Die Stereologie wird weithin als Goldstandard angesehen, da sie systematische einheitliche Stichproben5verwendet, was sie zur genauesten Methode zur Quantifizierung der urtypischen Follikelzahl in der ganzen Maus oder Ratteneierstöcke4,6,7macht. Die Stereologie ist unvoreingenommen, da sie die dreidimensionale Struktur desObjektsvon Interesse 8 berücksichtigt. Mit Hilfe einer optischen Dissektor-/Fraktionatormethode werden drei Stichprobenebenen angewendet, um Urfollikel mit dicken Gewebeabschnitten (z. B. 20 m) innerhalb eines bekannten Bruchteils des gesamten Mausovarials zu quantifizieren. Zunächst wird das Stichprobenintervall (z. B. jederdritte Abschnitt) zu einem zufälligen Start gewählt (Sampling-Fraktion 1, f1)4. Die Abschnitte werden dann systematisch und einheitlich von diesem Punkt an durch den gesamten Eierstock abgetastet. Dann wird ein unvoreingenommener Zählrahmen über dem Eierstockbereich überlagert und nach und nach entlang eines definierten, randomisierten Zählrasters bewegt (Sampling-Fraktion 2, f2)8. Schließlich wird ein bekannter Bruchteil der Schnittdicke optisch beprobt (z.B. 10 m) und Follikel in diesem Bereich gezählt (Probenahmefraktion 3, f3)4. Die rohe Follikelzahl wird mit der Umkehrung dieser Stichprobenfraktionen multipliziert, um den Endwert zu erhalten. Diese Methode erfordert eine fachkundige Schulung und Ausrüstung, einschließlich eines Mikroskops mit einer motorisierten Bühne, die von stereologischer Software angetrieben wird. Gewebe sollten in einem speziellen Bouin-Fixativ konserviert und in Glycolmethacrylatharz eingebettet werden, damit dicke Gewebeabschnitte mit einem Glycolmethacrylatharz-Mikrotom mit einem Glasmesser geschnitten werden können. Diese Methode wurde entwickelt, um Gewebeschrumpfung und Verformung zu berücksichtigen, um die dreidimensionale morphologische Struktur des Eierstocks und der Follikel am besten zu erhalten9.
Die direkte Follikelzählung ist die am häufigsten verwendete Methode zum Zählen von Follikel10. Es können häufigere Fixative (d. h. Formalin) verwendet werden, gefolgt von Paraffinwachseinbettung und erschöpfender serieller Schnitte mit einem Standardmikrotome mit einer Dicke zwischen 4 und 6 m. Follikel werden systematisch im gesamten Gewebeabschnitt in einem definierten Intervall gezählt und dann mit der Umkehrung des Probenahmeintervalls multipliziert, um die Gesamtfollikelschätzung zu erhalten. Diese Methode ist schnell und einfach, kann mit archivierten Geweben durchgeführt und mit standardmäßigen histologischen Techniken vorbereitet werden. Es erfordert nur ein Lichtmikroskop mit Standard-Bildgebungsfunktionen. Trotz dieser Vorteile fehlt es der direkten Follikelzählung jedoch an Genauigkeit und strengen Zählparametern der Stereologie, was sie anfälliger für Voreingenommenheit der Prüfer macht. Darüber hinaus können Gewebe während der Verarbeitung schrumpfen und verformt werden, wodurch die Integrität und Morphologie des Eierstocks gestört wird und somit die Follikelklassifizierung und -quantifizierung erschwert wird.
Ziel dieses Artikels ist es, zwei häufig verwendete Methoden zur quantitativen Bewertung der Urfollikelzahl in den Eierstöcken der Maus zu beschreiben: Stereologie und direkte Follikelzählung. Wir werden detaillierte Protokolle für diese beiden Methoden bereitstellen und einige ihrer Stärken und Schwächen aufzeigen, um die Reproduzierbarkeit in unserem Bereich zu verbessern und es den Forschern zu ermöglichen, eine fundierte Entscheidung über die am besten geeignete Zählmethode für ihre Studien zu treffen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Butanol (HPLC)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>#A383-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid alcohol</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#ACDL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#8217;s fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#HT10132</td>
			<td>Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophosphamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C0768-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#06522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#ETH</td>
			<td>Ethanol 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle</td>
			<td>Designs for Vision</td>
			<td>#FEA-745-SR</td>
			<td>Feather blade for dissections (seen in Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin fixative</td>
			<td>Australian Biostain</td>
			<td>#ANBFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MENCS22501GP</td>
			<td>22 mm x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycomethacrylate resin RM2165 microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>#RM2165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycolmethacrylate DPX</td>
			<td>*made in house</td>
			<td></td>
			<td>*Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histolene</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#11031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#8217;s haematoxylin</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX50 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#BX50</td>
			<td>Brightfield microscope fitted with 10x dry &#38; 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus immersion oil type-F</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#IMMOIL-F30CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus TH4-200 light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#TH4-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#03987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic acid</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#PERI1%</td>
			<td>Periodic acid 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Microtome CUT 4060</td>
			<td>MicroTec</td>
			<td>#4060R/F</td>
			<td>Used to cut paraffin sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schiff&#8217;s reagent</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#SCHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scott&#39;s tap water</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#SCOT</td>
			<td>Potassium carbonate, magnesium sulphate, water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StereoInvestigator Stereological System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MENSF41296SP</td>
			<td>1 mm, 72 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit 7100 Plastic embedding system</td>
			<td>Emgrid Australia</td>
			<td>#64709003</td>
			<td>500 mL/5 x 1 g/40 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit 3040 yellow</td>
			<td>Emgrid Australia</td>
			<td>#64708805</td>
			<td>100 g/80 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries

Sexuell reproduzierende weibliche Säugetiere werden mit ihrer gesamten lebensleinen Versorgung mit Eizellen geboren. Unreife, stille Eizellen finden sich in den Urfollikel, der Speichereinheit der weiblichen Keimbahn. Sie sind nicht erneuerbar, so dass ihre Zahl bei der Geburt und anschließende Verlustrate weitgehend die weibliche fruchtbare Lebensdauer diktiert. Eine genaue Quantifizierung der Urfollikelzahlen bei Frauen und Tieren ist für die Bestimmung der Auswirkungen von Arzneimitteln und Giftstoffen auf die Eierstockreserve von entscheidender Bedeutung. Es ist auch notwendig, die Notwendigkeit und den Erfolg bestehender und neu entstehender Techniken zur Erhaltung der Fruchtbarkeit zu bewerten. Derzeit gibt es keine Methoden, um die Anzahl der Urfollikel, die die Eierstockreserve bei Frauen umfassen, genau zu messen. Darüber hinaus ist es oft nicht möglich, Eierstockgewebe von großen Tieren oder gefährdeten Arten für Experimente zu erhalten. So sind Mäuse zu einem wesentlichen Modell für solche Studien geworden, und die Fähigkeit, urfolale Follikelzahlen in ganzen Eierstöcken der Maus zu bewerten, ist ein entscheidendes Werkzeug. Berichte über absolute Follikelzahlen in den Eierstöcken der Maus in der Literatur sind jedoch sehr variabel, was es schwierig macht, Daten zu vergleichen und/oder zu replizieren. Dies ist auf eine Reihe von Faktoren wie Belastung, Alter, Behandlungsgruppen sowie technische Unterschiede in den methoden zur Zählung zurückzuführen. In diesem Artikel stellen wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Vorbereitung histologischer Abschnitte und das Zählen von Urfollikel in Denstöcken der Maus mit zwei verschiedenen Methoden bereit: [1] Stereologie, die sich auf die Fraktionator-/optische Dissektortechnik stützt; und [2] die direkte Zähltechnik. Einige der wichtigsten Vor- und Nachteile jeder Methode werden hervorgehoben, so dass die Reproduzierbarkeit vor Ort verbessert werden kann und die Forscher die am besten geeignete Methode für ihre Studien auswählen können.

Es wurde ein gut charakterisiertes Modell der Follikeldepletion verwendet, bei dem jungen erwachsenen weiblichen Mäusen eine Einzeldosis Cyclophosphamid-Chemotherapie oder kochische Fahrzeugkontrolle (n=5/Gruppe) verabreicht wurde und beide Eierstöcke nach 48 Stunden von jedem Tier geerntet wurden. Für jede der beiden Methoden wurde ein Eierstock pro Tier hergestellt, wie in Schritt 1 beschrieben: Stereologie oder direkte Zählung. Der linke und rechte Eierstock jedes Tieres wurde jeder Gruppe zufällig zugeordnet. Di...

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Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Hier beschreiben, vergleichen und kontrastieren wir zwei verschiedene Techniken für die genaue Follikelzählung von festen Eierstockgeweben der Maus.

Genaue Follikel-Aufzählung in adulten Maus-Ovarien

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

accurate-follicle-enumeration-in-adult-mouse-ovaries

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.0K Aufrufe.  Monash University. Hier beschreiben, vergleichen und kontrastieren wir zwei verschiedene Techniken für die genaue Follikelzählung von festen Eierstockgeweben der Maus.

Serie: Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

Kultur und Co-Kultur von Maus Eierstöcke und Eibläschen

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

Isolieren von Haarfollikelstammzellen und epidermalen Keratinozyten von Dorsal Mäusehaut

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and differentiation. Typically, pHi dynamics are determined in cultured cells, which are amenable to measuring and experimentally manipulating pHi. However, the recent development of new tools and methodologies has made it possible to study pHi dynamics within intact, live tissue. For Drosophila research, one important development was the generation of a transgenic line carrying a pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Here, we describe a protocol that we routinely use for imaging live Drosophila ovarioles to measure pHi in the epithelial follicle stem cell (FSC) lineage in mCherry::pHluorin transgenic wild type lines; however, the methods described here can be easily adapted for other tissues, including the wing discs and eye epithelium. We describe techniques for expressing mCherry::pHluorin in the FSC lineage, maintaining ovarian tissue during live imaging, and acquiring and analyzing images to obtain pHi values.

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

We provide a protocol for imaging intracellular pH of an epithelial stem cell lineage in live Drosophila ovarian tissue. We describe methods to generate transgenic flies expressing a pH biosensor, mCherry::pHluorin, image the biosensor using quantitative fluorescence imaging, generate standard curves, and convert fluorescence intensity values to pH values.

Methoden für Imaging intrazellulären pH der Follikel Stem Cell Linie in Live Drosophila Eierstockgewebe

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Präparation und Färbung von Drosophila Pupal Eierstöcke

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

Ganze Mount Immunfluoreszenz und Follikel Quantifizierung der kultivierten Maus Eierstöcke

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell fate determining and maturing factors. We previously set out to define the minimal set of factors necessary for instructing red blood cell development using direct lineage reprogramming of fibroblasts into induced erythroid progenitors/precursors (iEPs). We showed that overexpression of Gata1, Tal1, Lmo2, and c-Myc (GTLM) can rapidly convert murine and human fibroblasts directly to iEPs that resemble bona fide erythroid cells in terms of morphology, phenotype, and gene expression. We intend that iEPs will provide an invaluable tool to study erythropoiesis and cell fate regulation. Here we describe the stepwise process of converting murine tail tip fibroblasts into iEPs via transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR). In this example, we perform the reprogramming in fibroblasts from erythroid lineage-tracing mice that express the yellow fluorescent protein (YFP) under the control of the erythropoietin receptor gene (EpoR) promoter, enabling visualization of erythroid cell fate induction upon reprogramming. Following this protocol, fibroblasts can be reprogrammed into iEPs within five to eight days. 
While improvements can still be made to the process, we show that GTLM-mediated reprogramming is a rapid and direct process, yielding cells with properties of bona fide erythroid progenitor and precursor cells.

Here we present our protocol for producing induced erythroid progenitors (iEPs) from mouse adult fibroblasts using transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR).

Direkte Linie Reprogrammierung von adulten Maus-Fibroblasten zu erythroiden Vorläuferzellen

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

Vaskuläres Gießen von Erwachsenen und frühpostnatalen Mauslungen für Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that during the reproductive life span only about 1% of the oocytes in an ovary mature and ovulate, several techniques have been developed to increase the exploitation of the ovarian reserve to the growing population of non-ovulatory follicles. Such technologies have allowed interventions of fertility preservation, selection programs in livestock, and conservation of endangered species. However, the vast potential of the ovarian reserve is still largely unexploited. In cows, for instance, some attempts have been made to support in vitro culture of oocytes at specific developmental stages, but efficient and reliable protocols have not yet been developed. Here we describe a culture system that reproduce the physiological conditions of the corresponding follicular stage, defined to develop in vitro growing oocytes collected from bovine early antral follicles to the fully-grown stage, corresponding to the medium antral follicle in vivo. A combination of hormones and a phosphodiesterase 3 inhibitor was used to prevent untimely meiotic resumption and to guide oocyte&#39;s differentiation.

We describe the procedures for isolation of growing oocytes from ovarian follicles at early stages of development, as well as the setup of an in vitro culture system which can support the growth and differentiation up to the fully-grown stage. &#160;

In Vitro Kulturstrategie für Oozyten aus dem frühen Antralfollikel bei Rindern

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily obtained from a slaughterhouse. Adult ovaries always bear several antral follicles, while in pre-pubertal donors the maximal numbers of oocytes are available at 4 weeks of age, when ovaries bear peak numbers of antral follicles. Thus, 4 weeks old lambs are considered good donors, even if the developmental competence of prepubertal oocytes is lower compared to their adult counterpart. 
Basic research and commercial applications would be boosted by the possibility of successfully cryopreserving vitrified oocytes obtained from both adult and prepubertal donors. The vitrification of oocyte collected from prepubertal donors would also allow shortening the generation interval and thus increasing the genetic gain in breeding programs. However, the loss of developmental potential after cryopreservation makes mammalian oocytes probably one of the most difficult cell types to cryopreserve. Among the available cryopreservation techniques, vitrification is widely applied to animal and human oocytes. Despite recent advancements in the technique, exposures to high concentrations of cryoprotective agents as well as chilling injury and osmotic stress still induce several structural and molecular alterations and reduce the developmental potential of mammalian oocytes. Here, we describe a protocol for the vitrification of sheep oocytes collected from juvenile and adult donors and matured in vitro prior to cryopreservation. The protocol includes all the procedures from oocyte in vitro maturation to vitrification, warming and post-warming incubation period. Oocytes vitrified at the MII stage can indeed be fertilized following warming, but they need extra time prior to fertilization to restore damage due to cryopreservation procedures and to increase their developmental potential. Thus, post-warming culture conditions and timing are crucial steps for the restoration of oocyte developmental potential, especially when oocyte are collected from juvenile donors.

The protocol aims at providing a standard method for the vitrification of adult and juvenile sheep oocytes. It includes all the steps from the preparation of the in vitro maturation media to the post-warming culture. Oocytes are vitrified at the MII stage using Cryotop to ensure the minimum essential volume.

Vitrifikation von in vitro gereiften Eizellen, die aus adulten und präpubertären Eierstöcken bei Schafen entnommen wurden

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily ...