Mit dieser Methode kann jeder Rachenbogen unterteilt werden. Endothelzellzahlen können dann in jedem Bogen quantifiziert werden, um die Entwicklung der Pharyngealbogenarterie zu untersuchen. Die Hauptvorteile dieses Ansatzes sind die Fähigkeit, die Beziehung zwischen verschiedenen Gefäßstrukturen zu visualisieren und die Fähigkeit, quantitativ zu bestimmen, wie sich die Strukturen auf die Mutanten auswirkten.
Aortenbogenarterien werden häufig bei angeborenen Herzerkrankungen mutiert. Unsere Methode ermöglicht die Untersuchung, wie Mutationen den physiologischen Prozess der Gefäßbildung und -umgestaltung verändern. Obwohl wir diese Methode verwenden, um Einblicke in die Mechanismen der angeborenen Herzkrankheit zu gewinnen, kann sie auf andere Systeme angewendet werden, insbesondere mit dem Aufkommen der Lichtbogenmikroskopie.
Beginnen Sie mit einer Glaspipette, um jeden Maus-Embryonaltag 9,5 oder 10,5 Embryo in einzelne zwei Milliliter-Röhren mit einem Milliliter PBS zu übertragen. Nach der Fixierung verwenden Sie feine Zangen, um den Embryo vorsichtig über dem Hinterglied zu kneifen und einen Querschnitt zu machen, um die hintere Hälfte des Embryos zu entfernen. Um die Embryonen zu permeabilisieren, ersetzen Sie das PBS durch PBST und platzieren Sie die Embryonen über Nacht bei vier Grad Celsius mit sanfter Erregung.
Ersetzen Sie am nächsten Tag den PBST durch 600 Mikroliter Sperrpuffer, ohne die Embryonen für eine 16- bis 18-stündige Inkubation bei vier Grad Celsius mit sanfter Rührung zu berühren. Ersetzen Sie am nächsten Morgen den Sperrpuffer durch 600 Mikroliter des primären, interessierenden Antikörpers pro Röhre für eine vier- bis fünftägige Inkubation bei vier Grad Celsius mit sanfter Rührung. Am Ende der Inkubation die Embryonen in einem Milliliter PBST vier bis fünf Stunden waschen, mit sanfter Erregung bei Raumtemperatur, die die PBS stündlich ändert, gefolgt von einer nächtlichen Inkubation in frischem PBST bei vier Grad Celsius und vier bis fünf zusätzlichen einstündigen Wähteilen am nächsten Tag.
Nach der letzten Wäsche den PBST in jedem Rohr durch 600 Mikroliter der entsprechenden Sekundärantikörperlösung für eine vier- bis fünftägige Inkubation bei vier Grad Celsius ersetzen. Waschen Sie die Embryonen am Ende der Inkubation in einem Milliliter frischer PBST pro Wäsche, wie gerade gezeigt, und verwenden Sie eine Glaspipette, um jeden Embryo sanft in einzelne Kunststoffparaffinformen zu übertragen. Entfernen Sie vorsichtig jeden PBST um jeden Embryo herum und orientieren Sie jeden Embryo in einer sagittalen Position.
Dann fügen Sie schnell etwa 500 Mikroliter heiße Agarose zu jeder Form, bis jeder Embryo ist nur bedeckt und legen Sie die Formen auf Eis mit Aluminiumfolie bedeckt, bis die Agarose verfestigt hat. Zur Dehydrierung der embryonalen Proben verwenden Sie ein sauberes Skalpell, um einen Block Agarose um jeden Embryo zu schneiden und die Agarose mit Zangen zu erfassen, um die Agarose für den Transfer in eine beschriftete Zwei-Milliliter-Röhre mit einem Milliliter 25%Methanol zu erfassen. Nach einer einstündigen Inkubation mit sanfter Erregung im Dunkeln 25% Methanol durch einen Milliliter 50% Methanol pro Tube für eine zusätzliche einstündige Inkubation im Dunkeln ersetzen.
Nach dem Ende der Austrocknung das 100%methanol durch einen Milliliter 50%BABB für eine einstündige Inkubation mit sanfter Erregung im Dunkeln ersetzen. Am Ende der Inkubation die 50%BABB durch einen Milliliter 100%BABB pro Röhre für eine einstündige Inkubation mit sanfter Unruhe im Dunkeln ersetzen, gefolgt von einer zweiten Inkubation mit 100%BABB, wie gerade gezeigt. Um die Embryonen für die Bildgebung zu montieren, entfernen Sie den Klebstoff aus einem schnellen Brunnenstoßfänger und legen Sie den Stoßfänger auf eine 24 mal sechs Milliliter Nummer 1,5 Glasabdeckung.
Tragen Sie sanften Druck auf den Klebstoff auf, um Luftblasen zwischen dem Deckelund der Stoßstange zu entfernen und die 100%BABB vorsichtig aus jedem Rohr zu entsorgen. Dann verwenden Sie feine Zangen, um den Embryo vorsichtig in den schnellen Brunnen zu übertragen, ohne den Embryo zu berühren und legen Sie einen zweiten Deckelrutsch auf die Stoßstange. Um das Endothel im gesamten dritten Pharyngealbogen zu beschaffen, öffnen Sie das Bild von Interesse an der Software und klicken Sie auf neue Oberfläche hinzufügen.
Doppelklicken Sie auf Fläche eins, und benennen Sie die neue Fläche in dritten Pharyngealbogen um. Wählen Sie automatische Erstellung überspringen, manuell bearbeiten und die Oberflächenausrichtung auf die YZ-Ebene festlegen. Verwenden Sie die Schnittposition, um die dritte Pharyngealbogen-Oberflächenebene an die Stelle zu platzieren, an der sich die dritte PAA und die dorsale Aorta verbinden.
Drehen Sie das Bild so, dass die dritte Pharyngealbogen-Oberflächenebene sichtbar ist, und deaktivieren Sie den Orthoschneider. Wählen Sie im Zeichnungsmodus die Funktion des Abstandszeichnungsmodus aus und passen Sie die Parametereinstellungen nach Bedarf an. Wenn alle Parameter festgelegt sind, drücken Sie die Escape-Taste und klicken Sie auf Zeichnen, um den Umfang des dritten Rachenbogens mit dem Mauszeiger zu verfolgen.
Verwenden Sie dann die Slice-Position, um 10 bis 25 Scheiben zu verschieben und den Umfang des Rachenbogens nachzuverfolgen. Wenn der gesamte Bogen nachverfolgt wurde, klicken Sie auf Fläche erstellen, um die Oberfläche des verfolgten Bereichs zu generieren. Um die oberflächenbeschaffenen Strukturen zu maskieren, wählen Sie im Bearbeitungsmenü die Maskenauswahl für die dritte PAA und DAPI aus, und klicken Sie auf OK. Benennen Sie dann den neuen Kanal in PAA DAPI um.
Wiederholen Sie diesen Schritt für die verbleibenden Kanäle. Um den Endothelplexus getrennt von der PAA zu visualisieren, wählen Sie die Maskenauswahl für die dritte PAA und DAPI aus. Deaktivieren Sie die Option Voxel außerhalb der Oberfläche, und überprüfen Sie die Option Voxel innerhalb der Oberfläche.
Setzen Sie die Auswahl der Voxel innerhalb der Oberfläche auf Null und klicken Sie auf OK. Benennen Sie den neuen Kanal in Nicht-PAA-DAPI um. Wiederholen Sie diesen Schritt für die verbleibenden Kanäle. Wählen Sie die Maskenauswahl für den dritten PA aus, und wählen Sie nicht-PAA-DAPI aus, und klicken Sie auf OK. Benennen Sie den neuen Kanal in plexus DAPI um.
Wiederholen Sie diesen Schritt für die verbleibenden Kanäle. Um die einzelnen Endothelzellen innerhalb jeder Interessenstruktur im Display-Anpassungspanel zu quantifizieren, schalten Sie alle Kanäle außer dem PAA ERG-Kanal aus. Klicken Sie im Menü Eigenschaften auf Neue Flecken hinzufügen, und klicken Sie auf , um die Orte umzubenennen, bei der die Gesamtzahl der Endothelzellen als PAA angezeigt wird.
Klicken Sie auf den blauen Pfeil und wählen Sie den PAA ERG-Kanal für den Quellkanal aus. Passen Sie den geschätzten XY-Durchmesser auf vier Mikrometer an, und klicken Sie auf den blauen Pfeil, um zum nächsten Bedienfeld zu gelangen. Verwenden Sie die Gleiterskala, um die Anzahl der Flecken anzupassen, um sicherzustellen, dass jeder ERG-positive Endothelzellkern durch einen Punkt dargestellt wird.
Klicken Sie als Nächstes auf den grünen Doppelpfeil und schalten Sie den PAA ERG-Kanal im Anzeige-Anpassungsfenster aus. Aktivieren Sie den PAA VEGFR2-Kanal, um das PAA-Endothel zu visualisieren, und klicken Sie auf Bearbeiten und Hinzufügen/Löschen, um die Oberfläche des Objekts auszuwählen. Drücken Sie dann Escape und halten Sie die Umschalttaste gedrückt, um alle Punkte zu löschen, die nicht VEGFR2 positiv sind, und klicken Sie auf die Registerkarte Statistik, um die Gesamtzahl der Endothelzellen zu bestimmen.
Die Immunfluoreszenz der ganzen Halterung liefert klare und saubere Ergebnisse, die die 3D-Rekonstruktion des Pharyngealbogenendothel ermöglichen. In diesem Bild ist das Vorhandensein der großen hellen Punkte das Ergebnis von Partikeln im Antikörper oder blockierenden Pufferlösungen. Nach der Pharyngealbogen- und PAA-Oberflächenfärbung ermöglicht die Verwendung der Maskenfunktion, die oberflächeten Bereiche visuell zu trennen und unabhängig zu analysieren.
Die Maskierung ermöglicht auch die individuelle Analyse und Quantifizierung von Endothelzellnummern innerhalb jeder Struktur. Hier wurde z. B. das Spot-Feature verwendet, um die Gesamtzahl der Endothelzellen sowohl in der PAA als auch im Plexus zu quantifizieren, indem jedem Kern, der ERG exzessiiert, ein einziger Punkt zugewiesen wurde. In diesem Bild kann ein ERG-positiver VEGFR2-Negativpunkt beobachtet werden, der durch die Spotfunktion erzeugt wurde.
Daher ist es wichtig zu überprüfen, ob jeder von der Software erkannte Punkt tatsächlich eine einzelne Endothelzelle darstellt. Um saubere und klare Bilder zu erhalten, denken Sie daran, alle Lösungen herunterzuspinnen und jeden Embryo nach Antikörper-Inkubationen richtig und gründlich zu waschen. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass BABB ätzend und giftig ist.
Behandeln und entsorgen Sie das Lösungsmittel ordnungsgemäß und achten Sie darauf, die geschmolzenen Embryonen vollständig zu versiegeln, um EIN Leck in BABB zu verhindern.
