Unser Protokoll beschreibt eine einfache und zuverlässige Methode für einen osteoklastischen Resorptionsassay. Die Verwendung von mit Calciumphosphat beschichteten Zellkulturplatten kann mit Hilfe von im Labor verfügbaren Materialien leicht vorbereitet und visualisiert werden. Im Gegensatz zu undurchsichtigen Knochen- oder Dentinscheiben ermöglicht die Calciumphosphatbeschichtung die gleichzeitige Visualisierung von Resorptionsgruben und -zellen.
In diesem Protokoll verwenden wir PBMCs zur Osteoklastendifferenzierung. Es kann jedoch auch auf andere Zelltypen wie aus Knochenmark abgeleitete Monozyten oder Raw 264.7-Zellen angewendet werden. Nehmen Sie zuerst eine flache Bodenzellkulturplatte mit 96 Vertiefungen und pipettieren Sie 300 Mikroliter zuvor vorbereitete Calciumphosphatlösung in jede Vertiefung.
Dann bedecken Sie die Platte mit dem Deckel und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für drei Tage. Nach drei Tagen aspirieren Sie die Vorverkalkungslösung aus den vorverkalkten 96 Zellkulturplatten und fügen Sie 300 Mikroliter Calciumphosphatlösung zu jeder Vertiefung hinzu. Decken Sie die Platten mit einem Deckel ab und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für einen Tag.
Dann drehen Sie die Platte um, um die Lösung auszugießen, und waschen Sie die Platte dreimal gründlich mit deionisiertem Wasser. Trocknen Sie die Platte sofort mit einem Haartrockner oder komprimiertem Kohlendioxid oder Stickstoffgas, um eine gleichmäßige Oberfläche zu erhalten. Bestrahlen Sie nun die beschichtete Platte auf einer sauberen Bank eine Stunde lang mit ultravioletten Strahlen.
Verwenden Sie die beschichtete Platte sofort oder versiegeln Sie die Platte mit Parafilm und lagern Sie sie bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie 15 Milliliter frisches Blut mit einem gleichen Volumen PBS und mischen Sie sie durch mehrmaliges Umdrehen oder Pipettieren. Nehmen Sie dann 15 Milliliter Dichtegradientenlösung in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen, kippen Sie das Röhrchen und schichten Sie vorsichtig 30 Milliliter verdünnte Blutprobe auf die 15 Milliliter Dichtegradientenlösung.
Später zentrifugieren Sie das Rohr in einem schwingenden Schaufelrotor ohne Pause bei 810 mal G für 20 Minuten bei 20 Grad Celsius. Dann aspirieren Sie die obere Schicht und lassen Sie die mononukleäre Zellschicht ungestört an der Grenzfläche. Übertragen Sie die mononukleäre Zellschicht vorsichtig auf ein neues 50-Milliliter-konisches Rohr.
Füllen Sie das Röhrchen mit PBS, mischen und zentrifugieren Sie bei 300 mal G für 10 Minuten bei 20 Grad Celsius. Resuspendieren Sie PBMCs in einem vollständigen Alpha-MEM, das 20 Nanogramm pro Milliliter Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktor enthält, und säen Sie 2,5 mal 10 bis die fünften Zellen pro Zentimeter Quadrat PBMCs in einem Kolben. Inkubieren Sie die mit Calciumphosphat beschichteten Platten mit 50 Mikrolitern fetalem Rinderserum bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.
Als nächstes waschen Sie den Kolben zweimal mit PBS, um die Osteoklastenvorläufer von toten oder nicht adhärenten Zellen zu lösen, und fügen Sie dann vier Milliliter Trypsin pro 75 Quadratzentimeter Kolben hinzu. Stoppen Sie nach 30 Minuten die Verdauung, indem Sie vier Milliliter vollständiges Alpha-MEM hinzufügen, und lösen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Zellenschaber ab. Übertragen Sie die Zellen in ein 50-Milliliter-Röhrchen und zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen mit einer Zählkammer.
Zentrifen Sie das Röhrchen bei 350 mal G für sieben Minuten, um die Zellen zu pelletieren und das Pellet wiederzubeleben und das Alpha-MEM mit M-CSF und RANKL zu vervollständigen, um einmal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter zu erhalten. Saugen Sie das fetale Rinderserum von der mit Calciumphosphat beschichteten Platte ab und pipettieren Sie 200 Mikroliter Zellsuspension pro Well. Nach der Inkubation die Zellen zweimal mit PBS waschen.
Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 10 Minuten und waschen Sie sie erneut mit PBS. Für die Färbung fügen Sie den festen Zellen Permeabilisierungspuffer hinzu und inkubieren Sie sie für fünf Minuten. Um die Aktinfilamente zu färben, inkubieren Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern Alexa Fluor 546-markierter Phalloidinlösung in PBS für 30 Minuten, saugen dann die Färbelösung ab und färben Sie die Kerne mit 100 Mikrolitern Hoechst für 10 Minuten.
Färben Sie die Calciumphosphatbeschichtung mit 100 Mikrolitern 10 mikromolarem Calcein und PBS für 10 Minuten. Nachdem Sie dreimal mit PBS gewaschen haben, nehmen Sie Bilder auf. Für die Von Kossa-Färbung der Calciumphosphatbeschichtung fügen Sie 50 Mikroliter 5% Silbernitrat und deionisiertes Wasser zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie die Platte unter ultravioletter Strahlung für eine Stunde, bis die Beschichtung auf dem Boden der Bohrlöcher braun geworden ist.
Die Calciumphosphatbeschichtung am Boden der 96 Wellplatten schien gleichmäßig und gut haftend zu sein. Nach neun Tagen Kultur in M-CSF und RANKL auf den mit Calciumphosphat beschichteten Platten bildeten Osteoklastenvorläufer Resorptionsgruben und große Osteoklasten. Die in den Gruben befindlichen mehrkernigen Osteoklasten drückten hohe TRAP-Werte aus.
Die reifen Osteoklasten zeigten das Vorhandensein von drei oder mehr Kernen und den ausgeprägten Aktinring. Die grüne Calciumphosphatbeschichtung zeigte das Vorhandensein von schwarzen Resorptionsgruben. Die Fluoreszenzbilder der Grubenfläche wurden mit dem Schwellenwertwerkzeug von Bild J gemessen.Die Anzahl und Größe der Osteoklasten wurden mit dem ROI-Manager und dem Polygonauswahlwerkzeug von Bild J berechnet.Osteoklasten-Vorläufer, die in Abwesenheit von RANKL gezüchtet wurden, konnten keine Resorptionsgruben bilden, jedoch erleichterten M-CSF und RANKL die Bildung von osteoklastogenen Gruben.
Und die Grubenfläche wurde mit dem Bild J quantifiziert.Das sofortige Trocknen der beschichteten Platte mit Luftstrom hilft, eine gleichmäßige Calciumphosphatbeschichtung herzustellen. Andernfalls neigt es dazu, eine dickere Beschichtung in der Mitte des Brunnens zu bilden.
