Dieses Protokoll beschreibt eine schrittweise Methode zur radioaktiven Markierung von Zellen und Zirkonium-89-DBN und deren nicht-invasives Tracking mittels PET. Diese Technik bietet auch eine zuverlässige und stabile Methode zur radioaktiven Markierung von Zellen durch eine kovalente Konjugation von Zirkonium-89-DBN mit den primären Mitteln der Zelloberflächenproteine. Für Ärzte und Wissenschaftler, die mit Zelltherapien für neurologische Erkrankungen und verschiedene Krebsarten arbeiten, ist dieses Protokoll für das Verständnis der Pharmakokinetik zellbasierter Therapien durch nicht-invasive PET-Bildgebung von entscheidender Bedeutung.
Das detaillierte Protokoll bietet neuen Benutzern eine Anleitung zum Erlernen und Anwenden dieser radioaktiven Markierungstechnik. Zusätzliche Knoten, die bei den kritischen Schritten enthalten sind, helfen bei der Problembehandlung für einen neuen Benutzer. Bereiten Sie zunächst eine Säule mit etwa 100 Milligramm Hydroxamatharz vor und aktivieren Sie sie, indem Sie die Säule mit acht Millilitern reinem wasserfreiem Acetonitril waschen, gefolgt von einer Spülung mit fünf bis sechs Millilitern Luft.
Zwei Milliliter 0,5 normale Salzsäure in die Säule geben. Nach einer zusätzlichen Spülung von fünf bis sechs Millilitern Luft wird die Lösung, die sowohl Zirkonium-89 als auch natürliches Yttrium enthält, langsam in das Hydroxamatharz gegeben. Waschen Sie das ungebundene natürliche Yttrium aus dem Hydroxamatharz mit 20 Millilitern zweier normaler Salzsäure, gefolgt von 10 Millilitern entionisiertem Wasser.
Um Zirkonium in Form von Zirkonium-89-Hydrogenphosphat zu vermeiden, geben Sie 0,5 Milliliter 1,2 molaren Dikaliumphosphat-Kaliumdihydrogenphosphatpuffer in die Säule und lassen Sie sie 30 Minuten lang auf der Säule sitzen. Fügen Sie zusätzlich 1,5 Milliliter 1,2 molaren Puffer hinzu, um das Zirkonium aus der Säule zu eluieren. Als nächstes nehmen Sie etwa 120 Mikroliter Zirkonium-89-Hydrogenphosphat, das im Puffer formuliert ist, und neutralisieren Sie die Lösung mit HEPES-KOH und Kaliumcarbonat, um einen pH-Wert von 7,528 zu erreichen.
Vier Mikroliter frisch zubereitetes fünfmillimolares DFO-Bn-NCS werden zu rund 285 Mikrolitern neutralisiertem Zirkonium-89-Hydrogenphosphat gegeben. Und mischen Sie die Lösung durch Pipettieren. Nach der Isolierung von Zirkonium aus Yttrium werden 0,5 Milliliter eines molaren Oxalsäures in die Säule gegeben und eine Minute lang auf der Säule gelassen, um Zirkonium in Form von Zirkonium-89-Oxalat zu eluieren.
Geben Sie weitere 2,5 Milliliter einer molaren Oxalsäure in die Säule. Um Zirkonium-89-Oxalat in Zirkonium-89-Chlorid umzuwandeln, waschen Sie die Anionenaustauschsäule mit sechs Millilitern Acetonitril und spülen Sie anschließend fünf bis sechs Milliliter Luft. Waschen Sie dann die Säule mit 10 Milliliter Kochsalzlösung, gefolgt von einem weiteren Luftstoß.
Laden Sie die zirkonium-89-oxalathaltige Lösung langsam auf die aktivierte Anionenaustauschsäule, bevor Sie sie erneut mit Luft waschen. Waschen Sie dann die Säule mit 50 Millilitern deionisiertem Wasser, um das ungebundene Oxalat-Ion zu entfernen. Um Zirkonium in Form von Zirkonium-89-Chlorid zu vermeiden, geben Sie 0,1 Milliliter einer normalen Salzsäure in die Säule und lassen Sie sie eine Minute lang auf der Säule sitzen.
Das Zirkonium wird mit zusätzlichen 0,4 Millilitern einer normalen Salzsäure aus der Säule eluiert. Trocknen Sie das ausgetretene Zirkonium-89-Chlorid in einem V-förmigen Fläschchen, indem Sie es 10 bis 30 Minuten lang bei 65 Grad Celsius unter einem stetigen Stickstoffgasstrom in einen Heizblock legen, und stellen Sie dann das getrocknete Zirkonium-89-Chlorid in Wasser wieder her. Bereiten Sie 500 Mikroliter Zellsuspension mit ca. 6 Millionen Zellen in 500 Mikrolitern HEPES-gepuffertem HBSS in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor und fügen Sie etwa 100 Mikroliter des formulierten Zirkonium-89-DBN hinzu.
Mischen Sie das Zirkonium-89-DBN und die Zellsuspension, indem Sie die Lösung vorsichtig mit einer Mikropipette auf und ab pipettieren. Inkubieren Sie die Zellen und das Zirkonium-89-DBN-Gemisch auf einem Schüttler bei etwa 550 U/min bei 25 bis 37 Grad Celsius für 30 bis 45 Minuten für die Zellmarkierung. Führen Sie eine radioaktive TLC für die radioaktive Markierungsreaktion der Zelle mit einem frisch hergestellten radioaktiven DC-Lösungsmittel durch.
Berechnen Sie den Prozentsatz der Radioaktivität bei Rf gleich 0,01 bis 0,02 anhand der auf dem Bildschirm angezeigten Gleichung. Mischen Sie in einem separaten 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen etwa 100 Mikroliter des formulierten Zirkonium-89-DBN mit etwa 500 Mikrolitern HEPES-gepuffertem HBSS, um es als No-Cell-Kontrolle für die Hintergrundkorrektur zu verwenden. Berechnen Sie den Prozentsatz der Radioaktivität bei Rf gleich 0,01 bis 0,02 mit der auf dem Bildschirm angezeigten Gleichung, und berechnen Sie dann die effektive radioaktive Markierung der Zelle, indem Sie die beiden berechneten Radioaktivitätsprozentsätze subtrahieren.
Nachdem Sie den Abschluss der radioaktiven Markierung bestätigt haben, fügen Sie 600 Mikroliter gekühltes, für die Zelle geeignetes vollständiges Medium hinzu, um die radioaktive Markierungsreaktion zu löschen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 96 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Und wirf den Überstand weg.
Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen vorsichtig in 500 Mikroliter des gekühlten Mediums, indem Sie das Medium mit einer Mikropipette auf und ab pipettieren. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 96 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie den Überstand. Berechnen Sie als Nächstes die endgültige radioaktive Markierungseffizienz nach allen Wäschen anhand der auf dem Bildschirm angezeigten Gleichung.
Um die Qualität der radioaktiv markierten Zellen sicherzustellen, wird die endgültige Suspension der radioaktiv markierten Zellen visuell inspiziert, und wenn keine Klumpen vorhanden sind, wird innerhalb einer Stunde nach der radioaktiven Markierung und den Waschschritten ein Trypanblau-Ausschluss-Viabilitätstest mit einer 0,4%igen Trypanblaulösung durchgeführt, die in PBS hergestellt wurde. Die Chelatbildungseffizienz von DFO-Bn-NCS für Zirkonium-89 unter Verwendung von Zirkonium-89-Hydrogenphosphat und Zirkonium-89-Chlorid ist unterschiedlich, gemessen durch radioaktive DC. Hier wird die Stabilität verschiedener mit Zirkonium-89 radioaktiv markierter Zellen über sieben Tage gezeigt.
Die Retention von Zirkonium-89-Radioaktivität durch radioaktiv markierte Zellen erwies sich in allen untersuchten Zellen als stabil, wobei ein vernachlässigbarer Ausfluss über sieben Tage nach der Markierung beobachtet wurde. Die Effizienz der radioaktiven Markierung von Zellen in verschiedenen Zelltypen mit Zirkonium-89-DBN ist in dieser Tabelle dargestellt. Die radioaktive Markierungseffizienz der Zelle variiert zwischen 20 und 50 %, da nach dem Waschen eine unkorrigierte Ausbeute im radioaktiv markierten Zellpellet beobachtet wird.
Der kritischste Schritt dieses Protokolls ist die Zugabe von DFO-Bn-NCS zum Chelat-Gemisch und die Qualitätsbewertung der radioaktiv markierten Zellen. Die Anwendung dieser Technik wird dazu beitragen, die Pharmakokinetik zellbasierter Therapien zu verstehen. Es würde auch die Frage aufwerfen, ob es klinisch notwendig ist, das Clearance-Profil von Zelltherapien zu verändern.
