We would like to thank the American Cancer Society, Illinois Division (282802) and the National Science Foundation CBET (1512598) for funding support. We also would like to thank Dr. Dianwen Zhang from the University of Illinois Beckman Institute for microscopy training. Finally, we would like to thank Jared Weddell, Stacie Chen, and Spencer Mamer for insightful discussions.

1. Reinigung der Glasoberfläche und Vorbereitung Reagenzien <ol><li> Legen Sie eine Glasoberfläche in einem Sauerstoffplasma Maschine für 5 Minuten bei 50% Leistung zu reinigen. </li><li> Bereiten 2,5 ml 2% rekonstituiert (3-Aminopropyl) triethoxysilan (APTES) Lösung, durch Zugabe von 50 &amp; mgr; l APTES und 2,45 ml Ethanol in einem konischen Röhrchen. </li></ol> 2. APTES und DSB Funktionalisierung <ol><li> Hinzufügen APTES Lösung auf die Oberflächen. Je 150 &amp; mgr; l pro Vertiefung für 8-Well-Platten. Je 100 &amp; mgr; l pro Vertiefung für 24-Well-Platten. Pipette 1,1 ml für 60 x 15 mm Glasschalen. Decken Sie die Oberflächen Verdunstung und ungleichmäßige Verteilung der APTES Lösung zu verhindern. Platzieren Sie die Oberflächen auf einem Plattformschüttler 50 Minuten lang bei Raumtemperatur, die eine gleichmäßige Verteilung der APTES Schicht erzeugt. HINWEIS: APTES ein Aminosilan, das die erste Schicht der Oberfläche bildet. Wenn eine andere Oberfläche unter Verwendung heuristisch das Volumen der Lösung bestimmen, erforderlich, um die Oberfläche zu bedecken. </li><li> Wählen Sie die Temperatur für den Ofen, während die Oberflächen auf dem Schüttler sind: Erwärme auf 55 ° C für 2 Stunden für die 8-Well-Platten und Platten mit 24 Vertiefungen. Wärme Glas nur Geschirr bis 90 ° C für 1 Stunde. </li><li> Spülen Sie die Oberflächen mit Ethanol. <ol><li> Verwalten die Menge an Ethanol erforderlich Referenzierung basierend auf der Oberfläche verwendet. In 150 ul Ethanol in jede Vertiefung für 8-Well-Platten. In 125 ul Ethanol zu jeder Vertiefung für 24-Well-Platten. In 1,1 ml Ethanol für Glasschalen. </li><li> Spülen der Oberfläche durch Entladen und die Flüssigkeit von einem festen Punkt, wie beispielsweise die Ecke des Bohrloches zu ziehen. Halten der Pipette bei ungefähr 70 ° Winkel, so wird die Spitze nicht direkt in die Oberfläche gerichtet. Spülen Sie zweimal unter Verwendung von Ethanol. HINWEIS: Wenn eine der Glasboden-Well-Platten in ihnen jede Kunststoff haben, sie nicht über 65 ° C erhitzen, da der Kunststoff zu schmelzen und verformen beginnt. </li></ol></li><li> Trocknen Sie mit 100% Stickstoffgas aus einem Tank abgegeben. Legen Sie die Oberflächen in der oven. </li><li> Bereiten 2,5 ml D-Desthiobiotin (DSB) Lösung durch Vereinigen von 1,5 mg / ml DSB in 37,5 &amp; mgr; l Dimethylsulfoxid (DMSO) und 5 mg / ml 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) in 2462,5 &amp; mgr; l der 0,1 M 4-Morpholinethansulfonsäure-Hydrat (MES) (pH 6) Puffer. Kombinieren Sie dann beide Lösungen. </li><li> 1 ul 2-Mercaptoethanol β, nach 15 min in die Lösung, um die Reaktion zwischen DSB und EDC zu quenchen. Entfernen Sie heißen APTES funktionalisierte Glasoberflächen aus dem Ofen. Warten Sie 5-10 min für die Glasflächen zu kühlen. </li><li> In MES die Oberfläche Puffer zu spülen, mit Mengen auf der Oberfläche basiert. In 150 ul MES in jede Vertiefung für 8-Well-Platten puffern. In 125 ul MES in jede Vertiefung für 24-Well-Platten puffern. In 1,1 ml MES-Puffer für Glasschalen. </li><li> Spülen Oberfläche durch Entladen und die Flüssigkeit von einem festen Punkt, wie beispielsweise die Ecke des Bohrloches zu ziehen. Halten Sie die Pipette auf etwa ein Winkel von 70 °, so wird die Spitze nicht direkt daraufin die Oberfläche. Spülen Sie zweimal mit MES-Puffer. </li><li> Tragen Sie die DSB-Lösung auf die Oberflächen zu ermöglichen, sie zu brüten. In 150 ul DSB-Lösung pro Vertiefung für 8-Well-Platten. 100 l DSB-Lösung pro Well für 24-Well-Platten. In 1,1 ml für Glasschalen DSB Lösung. </li><li> Legen Sie die DSB bedeckt Glasflächen auf einem feuchten Papiertuch in einer Petrischale. Zudecken und in einem 4 ° C Kühlschrank für 18-24 Stunden inkubiert. </li></ol> 3. Streptavidin-Funktionalisierung <ol><li> Spülen jeder Glasoberfläche dreimal mit 1 ml 1,0x Phosphate Buffered Saline (PBS). Spülen Oberfläche durch Entladen und die Flüssigkeit von einem festen Punkt, wie beispielsweise die Ecke des Bohrloches zu ziehen. Halten der Pipette bei ungefähr 70 ° Winkel, so wird die Spitze nicht direkt in die Oberfläche gerichtet. Man verdünnt das Streptavidin (Streptavidin) Stammlösung auf 0,4 mg / ml (empfohlen). HINWEIS: PBS isotonisch ist, so dass es als ein Medium zur Verdünnung und Spülen verwendet werden kann. PBS wird als Lösungsmittel für die SA verwendetv, und daher wird keine Auswirkung auf die Fähigkeit des SAv an die Oberfläche zu binden. </li><li> Gelten 0,4 mg / ml Streptavidin-Lösung gleichmäßig auf den Oberflächen, so dass eine dünne Schicht bildet sich an der Unterseite des Glases, die Menge der Lösung wählen basierend auf Oberfläche. Für 8-Well-Platten mit 150 &amp; mgr; l 0,4 mg / ml Streptavidin-Lösung pro Vertiefung. Für 24-Well-Platten mit 100 &amp; mgr; l 0,4 mg / ml Streptavidin-Lösung pro Vertiefung. Für Glasschalen, fügen Sie 1,1 ml 0,4 mg / ml Streptavidin-Lösung. </li><li> Decken und die Platten zu einer 14 cm Petrischale bewegen, Feuchtigkeit zu speichern. Inkubieren Sie die Petrischale im Kühlschrank für 18-24 Std. HINWEIS: Es ist wichtig, konsistente Mengen von APTES, DSB und SAv auf jeder Oberfläche zu verwenden. </li><li> Spülen jeder Glasoberfläche dreimal mit 150 ul PBS SAv zu entfernen. Spülen Oberfläche durch Entladen und die Flüssigkeit von einem festen Punkt, wie beispielsweise die Ecke des Bohrloches zu ziehen. Halten der Pipette bei ungefähr 70 ° Winkel, so wird die Spitze nicht direkt in die Oberfläche gerichtet. </li><li> Befeuchten Sie ein Papiertuch with de-ionisiertes Wasser und legen Sie das Papiertuch in 14 cm Petrischale flach, die Platten umgebenden Feuchtigkeit in den Vertiefungen zu halten. Decken Sie die Petrischale mit den Brunnen. Inkubieren Sie die Petrischale in einem 4 ° C Biosafety Level 1 (BSL-1) Kühlschrank, bis sie benötigt. </li></ol> 4. Zelleinfang und Freigabe <ol><li> Beginnen mit T175-Kolben (n) von Zellen für das Experiment bestimmt. Absaugen Medien von Kolben (s). Waschen Sie die restlichen Medien mit 5 ml Raumtemperatur PBS. Aspirat PBS aus dem Kolben (s). </li><li> 10 ml nichtenzymatische Hebemittel, wie Zelldissoziationslösung, auf die T-175-Kolben von Zellen. Setzen Sie den Kolben in den Inkubator für 6 min zum Anheben der Zellen aus dem Kolben zu ermöglichen. </li><li> Nach 6 min, 10 ml kalter Hanks Balanced Salt Solution (HBSS; Siehe Liste der Materialien), um das Hebemittel zu inaktivieren. Nehmen Sie 20 ul Zellen Anzahl von Zellen in Lösung zu zählen ein Hemacytometer verwenden. HINWEIS: Je nach functionalisierten Oberflächen im capture Experiment verwendet, variiert die Anzahl der Zellen benötigt. Für funktionalisierte 8-Well-Platten, verwenden 300.000 Zellen pro Vertiefung. Für funktionalisierte Glasschalen, verwenden Sie 1,1 Millionen Zellen. Für funktionalisierte 24-Well-Platten, werden 125.000 Zellen empfohlen. Mehr Informationen über Zellzählung wird im Supplement gefunden. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.1- 4.3 für einen anderen Kolben von Zellen, wenn weniger Zellen vorhanden sind, als für das Experiment benötigt. Kombinieren Zellsuspensionen und Nachzählung Zellen zur Gesamtzahl der Zellen in Lösung erhalten. </li><li> Spin-Down-Zellsuspension in einer Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C, um ein Pellet von konzentrierten Zellen zu erhalten. Finden Sie die entsprechende Menge an HBSS zur Zellsuspension hinzufügen , um eine Konzentration von 1 x 10 6 Zellen pro ml zu erhalten, aspirieren dann den Überstand von den Zellen abzentrifugiert, und fügen Sie das berechnete Volumen. Dieses Volumen kann unter Verwendung der Gleichungen im Supplement berechnet werden. </li><li> Pipette nach oben und unten (triturate) zu suspendieren the Zellen in Lösung und zelluläre Verklumpung in Lösung reduzieren, die Antikörperbindung reduzieren kann. Teilen Sie die zelluläre Lösung in getrennte Kontroll- und experimentellen Lösungen. Sehen Sie einen Brief Datei für Komponenten und Berechnungen. </li><li> Fügen Sie die biotinylierte Antikörper an die jeweiligen Zelllösungen, wie in der Supplemental Datei beschrieben. Inkubieren für 30 min bei 4 ° C auf einem End-Over-End-Mixer. HINWEIS: Bei MCF7GFP Zellen wurden 0,5 mg / ml hIgG oder 0,5 mg / ml HLA-ABC-Antikörper werden empfohlen. Bei RAW-Makrophagen, 1 mg / ml mCD11b werden auf die Hälfte des Volumens für die Bilanzierung der Verdünnung Unterschiede empfohlen. Für menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs), 0,5 mg / ml hCD31 wird empfohlen. </li><li> Waschen Sie die funktionalisierte Glasoberfläche mit HBSS. Für dieses Experiment ist ein 8-Well-Platte beraten. <ol><li> In 150 ul HBSS in jede Vertiefung für 8-Well-Platten. Spülen Sie zweimal HBSS verwenden. Spülen Oberfläche durch Entladen und die Flüssigkeit von einem festen Punkt, wie beispielsweise die Ecke des Bohrloches zu ziehen.Halten der Pipette bei ungefähr 70 ° Winkel, so wird die Spitze nicht direkt in die Oberfläche gerichtet. Halten Sie kalt bei 4 ° C. </li></ol></li><li> In Zelllösungen in die Vertiefungen und 45 Minuten warten, bis die Zellen auf Eis auf dem Schüttler inkubiert. Sprechen Sie die Lösung von Biotin in steriler HBSS von berechneten Volumina unter Verwendung der in der Ergänzung beschrieben. </li><li> Entfernen Sie die Zell-Lösung aus den Glasbrunnen durch HBSS mit. <ol><li> Gently Pipette in jede Vertiefung 150 ul HBSS. Dann die HBSS Pipette aus. Spülen Oberfläche durch Entladen und die Flüssigkeit von einem festen Punkt, wie beispielsweise die Ecke des Bohrloches zu ziehen. Halten der Pipette bei ungefähr 70 ° Winkel, so wird die Spitze nicht direkt in die Oberfläche gerichtet. </li><li> Wiederholen Sie zwei weitere Male. Nach dem Waschen hinzufügen HBSS in die Vertiefungen, die Zellen feucht zu halten. </li></ol></li><li> In 150 ul 20 mM Biotin-Lösung auf die jeweilige Veröffentlichung gut, und warten Sie 20 Minuten für die Reaktion zu ermöglichen. </li><li> Erinnere nicht spezifisch gebundene Zelles durch Waschen mit HBSS, wie oben angegeben, und dann fluoreszierend markierten Zellen bei Verwendung, gehen Bild zur Fluoreszenz der Zellen. Auch Bild lebenden Zellen in einem Kolben (als Kontrolle, wobei die Zellen in der Vertiefung zu vergleichen). Wenn das grün fluoreszierende Protein (GFP) transfizierte Zellen verwenden, wird die Anregung 470 nm, und die Emission wird 515 nm sein. </li></ol> 5. Antikörperoptimierung: Antikörper-Titration <ol><li> Beginnen Sie, indem die Zellen aus dem T75 oder T175-Kolben heben, wie in Schritt 4.1- 4.3 erläutert. HINWEIS: Diese Volumina sind für 24-Well-Platten kalibriert, kann aber keine Glas funktionalisierten Oberflächen durch heuristische Tests zu entsprechen geändert werden. Eine repräsentative Antikörpertitration ist in Abbildung 1 dargestellt. </li><li> Zählen von Zellen unter Verwendung des Hämazytometers und dann drehen, um die Zell-Lösung in einem konischen Röhrchen bei 500 xg für 5 min bei 4 ° C. Rekonstitution Zellen zu 1 Million Zellen pro ml, unter Verwendung der in der Ergänzung beschriebenen Berechnungen. </li><li> Teilen Sie die 1 million Zellen pro ml Lösung in sechs verschiedenen Lösungen von 500 &amp; mgr; l in verschiedene Zentrifugenröhrchen für den Antikörper (Ab) Lösungen. <ol><li> Verdünne die Antikörper-Stammlösung zu 10 &amp; mgr; g / ml, 1 ug / ml, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml. Erzeugen die Steuerungen unter Verwendung von 100 &amp; mgr; l Stain-Puffer (PBS + 1% Natriumazid + 1% BSA) und 500 &amp; mgr; l Zellen für die Kontrolle ohne Ab darin. Für die Blindkontrolle (No Ab und keine Zellen), eine Lösung von 300 &amp; mgr; l PBS verwenden. HINWEIS: ACHTUNG: Natriumazid ist extrem giftig, explosiv, und extreme Vorsicht ist geboten, wenn es zu benutzen. Bitte beachten Sie die Sicherheitsdatenblatt (SDB) und die entsprechende Sicherheitsausrüstung verwenden. </li></ol></li><li> Kombinieren und inkubieren Sie die Ab-Lösungen mit den Zell Lösungen im End-Over-End-Mixer bei 4 ° C für 30 min. Spülen Sie die funktionalisierten 24-Well-Platten mit HBSS dreimal. Spülen der Oberfläche durch Entladen und die Flüssigkeit von einem festen Punkt, wie beispielsweise die Ecke des Bohrloches zu ziehen. Halten Sie die piPette ungefähr in einem 70 ° Winkel, so dass die Spitze nicht direkt in die Oberfläche gerichtet wird. </li><li> Aliquot 125 ul jeder Probenlösung in die entsprechenden APTES, DSB und SAv gut funktionalisiert. Inkubieren bei 4 ° C oder auf Eis für 45 min auf der Glasoberfläche. Spülen der Oberfläche mit HBSS dreimal unspezifisch gebundenen Zellen zu entfernen. Spülen Oberfläche durch Entladen und die Flüssigkeit von einem festen Punkt, wie beispielsweise die Ecke des Bohrloches zu ziehen. Halten der Pipette bei ungefähr 70 ° Winkel, so wird die Spitze nicht direkt in die Oberfläche gerichtet. Sie NICHT die untere Reihe spülen, wie die Kontrollen sind. </li><li> In 150 ul HBSS zu jeder gut gewaschen, legte die 24-Well-Platten auf Eis, und dann einen Plattenleser verwenden Fluoreszenz von GFP Zellen zu messen (Anregung 485 nm / Emission 528 nm). </li></ol> 6. Zell Optimierung: Titrierzelle <ol><li> Heben Sie die Zellen wie in den Schritten 4.1 -4.3 erwähnt. </li><li> Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämacytometers. Spin down Zelle sosung in konischen Röhrchen bei 500 xg für 5 min bei 4 ° C. Rekonstituieren Zellen zu 1 Million Zellen pro ml. HINWEIS: Weitere Informationen über die Verwendung des Hämazytometers kann im Supplement finden. </li><li> Pipette 1,6 ml der Zelllösung für die 1,6 Millionen Zellen Lager und in einem konischen Rohr. Pipette 800 ul Zellen aus der Zelllösung für die 800.000 Zellen Lager und in einem konischen Rohr. Pipette 80 ul aus der Zelle Lager für die 80.000 Zellen Lager und in einem konischen Rohr. Pipette 8 ul aus der Zelle Lager für 8000 Zellen Lager und in einem konischen Rohr. HINWEIS: Die Konzentrationen werden pro 8-Well-Platte Messungen gegeben, replizieren nach Bedarf. Ein Beispiel der Plattenausgabe wird in Abbildung 2 dargestellt. </li><li> Nehmen Sie die vier Stammlösungen und Spin in einer Zentrifuge bei 500 xg für 5 min bei 4 ° C. Re-suspend alle Stammlösungen in 400 ul HBSS. </li><li> In 1,6 ul 100 ng / ml Antikörper an die 1,6 Millionen Zelle Lager, 0,8 μl auf die 800.000 Zelle Lager, und 0,5 ul auf alle anderen Aktien. Inkubieren des Antikörpers für 30 min in die End-over-End-Mixer für 30 min bei 4 ° C. Waschen Sie die funktionalisierte Glasoberfläche mit HBSS dreimal. HINWEIS: Die funktionalisierte 8-Well-Platte ist für die Mikroskopie Quantifizierung empfohlen, während das funktionalisierte 24-Well-Platte für Platte Leser Quantifizierung empfohlen. Antikörperkonzentration für 8000 Zellstoff wurde nicht der begrenzende Faktor der Erfassungsfläche zu ermöglichen, reduziert nicht der Mangel an Antikörper in Lösung zu sein, sondern die Erfassung von Eigenschaften der Oberfläche. </li><li> Anwenden 150 ul der Probenlösungen in jede Kammer. Tragen Sie die 1,6 Millionen Zelle Lager auf der ersten Spalte der Brunnen auf der linken Seite. Tragen Sie die 800.000 Zelle Lager auf der zweiten Spalte von links. Tragen Sie die 80000 Zelle Lager auf der dritten Spalte von links. Schließlich gelten die 8000 Zelle Aktie der letzten Spalte. für 45 min inkubieren, auf dem Schüttler bei 4 ° C. HINWEIS: Die 1,6 MillionenZelle Lager dient als höchste Konzentration getestet werden, und ist die doppelte Menge an Zellen, die normalerweise in der Zelltrennung Experimente verwendet (600.000 Zellen pro Vertiefung) Die 800.000 Zelle Lager dient als Kontrolle für das Experiment, wie es die typische Zellkonzentration ist dass in Zelltrennungsversuche (3.000.000 Zellen pro Vertiefung) verwendet. Die 80.000 Zelle Lager dient als zehnfache Verdünnung für niedrigere Konzentrationen für die zelluläre Erfassung (30.000 Zellen pro Vertiefung) zu testen. Die 8000 Zelle Lager dient als hundert fache Verdünnung als Test verwenden, um die untere Grenze der Zelltrennung (3.000 Zellen pro Vertiefung) zu überprüfen. </li><li> Spülen Sie mit HBSS dreimal. Spülen Oberfläche durch Entladen und die Flüssigkeit von einem festen Punkt, wie beispielsweise die Ecke des Bohrloches zu ziehen. Halten der Pipette bei ungefähr 70 ° Winkel, so wird die Spitze nicht direkt in die Oberfläche gerichtet. Sammeln Sie alle Wäschen. </li><li> Bild die Zellen auf einem Fluoreszenzmikroskop, bei Verwendung von 8-Well-Platten, machen Sie Fotos von jedem surGesicht und auf jede Oberfläche bei 4 ° C auf dem Schüttler eine Stunde Biotin 150 &amp; mgr; l an. Biotin Release Brunnen mit HBSS 3 mal Nach einer Stunde gründlich wie zuvor. Sammeln Sie alle Waschungen aus Brunnen zum Zählen mit dem Hämozytometer und Bild die Freigabe Brunnen. </li><li> Bewerben 150 ul 20 mM überschüssige Biotinlösung an Biotin Freisetzung Vertiefungen für 1 Stunde veranschlagen, wenn 24-Well-Platten verwenden, und dann spülen den Vertiefungen 3 mal mit HBSS. Quantifizieren 24-Well-Platten mit einem Plattenleser. Verwenden Sie eine Hemacytometer Zellen aus allen gesammelten gut Waschungen zu zählen. </li></ol> 7. Bildanalyse Hinweis: Die FIJI-Software-Paket (http://fiji.sc/Fiji) wird für die Bildanalyse empfohlen. Zunächst wurden die Bilder in Graustufenbild umgewandelt, und dann wird die Helligkeit / Kontrast verändert wurde, um die Zellen zu bringen. <ol><li> Laden Sie das Bild nach oben, und konvertieren, indem Sie auf das Bild und dann auf das Scrollen nach unten zu &quot;Typ&quot; in Graustufen und dann auf4; 8-Bit &quot;. </li><li> Erhöhen Sie den Kontrast des Bildes durch das Bild Registerkarte klicken und dann scrollen auf &quot;Anpassen&quot;. Klicken Sie auf &quot;Helligkeit und Kontrast&quot;, und dann die Bildlaufleisten verwenden, um die Zellen abheben. Wenn Fluoreszenzbilder verwenden, invertieren die Bilder um die Zellen zu machen mehr definiert. </li><li> Laden Sie ein Plugin auf ImageJ ITCN genannt (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html), um die Bilder zu analysieren. </li><li> Öffnen Sie ITCN. Wenn ein Dialogfeld angezeigt, das den Benutzer mit verschiedenen Parametern aufgefordert, die Größe der Zelle zu schätzen, die minimalen Breite der Zelle zunächst von Interesse. Klicken Sie auf die &quot;Detect Dunkle Peaks&quot; Option, wenn das Bild fluoresziert und die Zellen werden abgedunkelt. </li><li> Stellen Sie den Grenzwert bei 2 zunächst, und dann drücken Sie die &quot;Count&quot; -Taste. Eine neu gezählt Version des Bildes erscheint mit roten Punkten abgrenzen, wo Zellen gezählt wurden. </li><li> Stellen Sie die Schwelle und Breitenparameter genauer Handy-Daten von defini zu erhaltenng die Größe einer &quot;Zelle&quot;. Hinweis: Die Anzahl der gezählten Zellen in einem Dialogfeld auf der rechten Seite sein wird. Ändern von Parametern unterschiedliche Anzahl von Zellen gezählt geben. </li><li> Weiterhin durch die Schwelle und Breitenparameter zu iterieren, bis eine gute Abschätzung für die Anzahl von Zellen erreicht ist. </li></ol>

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D., Eslamizar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin,+avidin,+and+other+biotin-binding+proteins:+uses+for+protein+labeling,+detection,+and+isolation.">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Anal. Biochem. 308 (2), 343-357 (2002).</li><li>Wilchek, M., Bayer, E. 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I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+quantum+dot+calibration+standards+for+quantitative+fluorescent+profiling.">Engineering quantum dot calibration standards for quantitative fluorescent profiling.</a> J. Mater. Chem. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+solution-phase+and+vapor-phase+deposition+of+aminosilanes+on+silicon+dioxide+surfaces.">Comparative study of solution-phase and vapor-phase deposition of aminosilanes on silicon dioxide surfaces.</a> Mater. Sci. Eng. C. 35 (1), 283-290 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Verbesserungen in der Zellisolationstechniken fördert wissenschaftliche Untersuchungen in der Struktur-Funktions - Beziehungen in den Neurowissenschaften 18, Zell - Programmierung in der regenerativen Biologie stammen, und angiogenen Signalgebung in der Gefäßbiologie 19. Tatsächlich primäre Zellkultur 20 (zB HUVECs) in vaskulären biology wird in erster Linie durch die Verwendung von Zellisolierungstechniken durchgeführt. Zellisolierung wurde auch für die quantitative Flo...

Strom bench-top Zelltrennungsansätze (zB Fluoreszenz - aktivierte Zellsortierung 1, Laser Capture Mikrodissektion 2, immuno-magnetische bead Trennung 1) kann mehrere Stunden dauern Vorbereitung und Sortierung. Diese großen Zeitskalen können physiologische Reaktion und Expressionsspiegel beeinflussen, in Analysen führt , die nicht repräsentativ für die physiologische Reaktion 3 sind. Die Systeme werden benötigt, die schnell und effizient spezifische Zelltypen Zelloberflächenrezeptor-Ebenen, um Zellisolierung und Bereicherung für biomedizinische Anwendungen ohne Unterbrechung zu verbessern isolieren kann. Daher ist der Grund für unser Ansatz einen sanften Ansatz zur Zellisolierung zu entwickeln. Das &quot;Lab on a Chip&quot; -Konzept bietet das Versprechen um Größenordnungen schneller (Stunden zu Minuten) Zellisolierung und am häufigsten werden Zellen auf einer Oberfläche und die Freigabe Zellen oder intrazelluläre conte Erfassungnts durch physikalische 4,5 oder chemische Verfahren 6. Obwohl diese Ansätze einige Vorteile, wie die Identifizierung Protein 7,8 Expression bieten, Identifizieren RNA - Expression 9-11, oder sogar Zellen für die in vitro Kultur 12,13, sind viele dieser Techniken Bereitstellung kann aufgrund Diagnostik wie Zellrezeptor Profilierungs übersetzt zu ihren nicht-physiologischen Umgebungen. Die enzymatische Hebemittel wie Kollagenasen können auch diese Rezeptor Mengen 14,15, was bedeutet , Zell - Rezeptor Quantifizierung Techniken beeinflussen , dass diese Hebemittel verwenden, nicht genaue physiologische Daten erzeugen. Zelluläre Lyse verhindert Differenzierung zwischen den nativen Oberflächenrezeptoren, und solche , die 16 zuvor verinnerlicht wurden. Dieses Protokoll beschreibt einen schnellen und schonenden Ansatz zur Zellisolierung.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)</td><td>Acros Organics</td><td>919-30-2</td><td>Used to make 2% APTES solution</td></tr><tr><td>Plasma Cleaner Pico</td><td>Diener</td><td>Model 1</td><td>Cleans surfaces and allows for bonding of PDMS to glass</td></tr><tr><td>d-Desthiobiotin (DSB)</td><td>Sigma</td><td>D20655</td><td>Used as the releasing mechanism in the cellular capture surface.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>British Drug Houses (BDH)</td><td>BDH1115-1LP</td><td>Dissolves the DSB into solution</td></tr><tr><td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>5g: 22980&lt;br/&gt; 25g: 22981</td><td>Activates carboxylic acids and allows binding of proteins to glass surface.</td></tr><tr><td>uncoated 8-well culture slide</td><td>BD Falcon</td><td>Case of 24: 354118&lt;br/&gt; Case of 96: 354108</td><td>Used in cellular experiments involving Zeiss fluorescence microscope such as initial capture and release quantification experiments</td></tr><tr><td>Glass bottom 24-well plates</td><td>MatTek</td><td>P24G-0-13-F</td><td>Used in cellular experiments involving the plate reader such as antibody and cellular titration experiments</td></tr><tr><td>Mercaptoethanol</td><td>Science Lab</td><td>60-24-2</td><td>Used to quench reaction between EDC and DSB</td></tr><tr><td>4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate&lt;br/&gt; (MES Hydrate 99%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC172590250</td><td>Used to make 0.1 M MES Buffer for use in EDC reaction</td></tr><tr><td>Precision Oven</td><td>Thermo Scientific</td><td>11-475-153</td><td>Used in curing of PDMS and APTES layer.</td></tr><tr><td>Titramax 1000 Shaker</td><td>Heidolph</td><td>13-889-420</td><td>Used to ensure even distribution of APTES on surfaces.</td></tr><tr><td>1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg]</td><td>Proteo Chem</td><td>9013-20-1</td><td>Biotin-binding protein. May cause irritation.</td></tr><tr><td>5 cm Glass Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>08748A</td><td>Used in HUVEC studies as well as future profiling studies.</td></tr><tr><td>14 cm Petri Dish with Cover</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z717231</td><td>Used to hold samples being functionalized and transport them.</td></tr><tr><td>MCF7-GFP cells</td><td>Cell Biolabs</td><td>AKR211</td><td>Stored in liquid nitrogen</td></tr><tr><td>RAW264.7 mouse macrophages</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td>Gifted to us from Smith lab at the University of Illinois. Stored in liquid nitrogen.</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12605036</td><td>Stored in 100 ml at room temperature</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle medium</td><td>Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC</td><td>50003PC</td><td>Supplier: Corning</td></tr><tr><td>Nonessential amino acids</td><td>Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC</td><td>25-025-CI</td><td>Already added into DMEM by facility. Supplier: Corning.</td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-58</td><td>Small 23 cm 50 pack</td></tr><tr><td>Cell Dissociation Solution</td><td>Corning</td><td>MT-25-056CI</td><td>Used to lift cells non-enzymatically for the use in cell experiments</td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Hausser</td><td>02-671-54</td><td>Used to count cells for quantification of cell solutions and capture and release effectivity.</td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Amresco</td><td>58-85-5</td><td>Used to release cells from surface.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Created from Recipe</td><td>N/A</td><td>Used to keep cells alive in suspension as well as wash surfaces of non-specific binding. Adapted from Cold Spring Harbor Protocols: In 500&amp;nbsp;ml, use 4&amp;nbsp;g NaCl, 0.2&amp;nbsp;g KCl, 0.0402&amp;nbsp;g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.03&amp;nbsp;g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; and 0.5&amp;nbsp;g glucose. Add DI water to get to&amp;nbsp;500 ml, filter, and then refrigerate.</td></tr><tr><td>HLA-ABC Antibody</td><td>BioLegend</td><td>311402</td><td>Antibody used to capture MCF7gfp cells</td></tr><tr><td>hIgG Antibody</td><td>BioLegend</td><td>HP6017</td><td>Antibody used to capture MCF7gfp cells</td></tr><tr><td>MCF7 GFP cells</td><td>Cell Biolabs</td><td>AKR-211</td><td>Luminal Breast Cancer line that has been transfected with green fluorescent protein.</td></tr><tr><td>Assorted Conicals</td><td>Thermo-Scientific</td><td>15mL: 12-565-268</td><td>50/15 ml plastic conicals for storing solutions and aliquots.</td></tr><tr><td>Mini-Tube Rotators (End over End Mixer)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td>Used to incubate antibody and mix other cellular solutions in order to mix</td></tr><tr><td>Axiovert 200M (Fluorescence Microscope)</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Zeiss Axiovert 200 M inverted florescence microscope.</td></tr><tr><td>Zeba Desalting columns</td><td>Thermo-Scientific</td><td>PI-87770</td><td>Used to purify newly biotinylated antibodies after the use of the Biotinylation Kit. Instructions provided at: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf</td></tr><tr><td>EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation Kit</td><td>Thermo- Scientific</td><td></td><td>Used to biotinylate antibodies to allow them to integrate with the capture surface</td></tr><tr><td>Plate Reader</td><td>BioTek</td><td>Synergy HTX Multimode Reader</td><td>Used to quantitatively measure fluorescent intensity in the titration experiments.</td></tr></tbody></table>

a method of targeted cell isolation via glass surface functionalization

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual nuances in expression from patient to patient. Current methodologies that try to separate cells to fill this niche result in disruption of physiological expression, making the separation technique useless as a diagnostic tool. In this protocol, we describe the functionalization and optimization of a surface for the cellular capture and release. This functionalized surface integrates biotinylated antibodies with a glass surface functionalized with an aminosilane (APTES), desthiobiotin and streptavidin. Cell release is facilitated through the introduction of biotin, allowing the recollection and purification of cells captured by the surface. This release is done through the targeting of the secondary moiety desthiobiotin, which results in a much more gentle release paradigm. This reduction in harsh reagents and shear forces reduces changes in cellular expression. The functionalized surface captures up to 80% of cells in a single cell mixture and has demonstrated 50% capture in a dual-cell mixture. Applications of this technology to xenografts and cancer separation studies are investigated. Quantification techniques for surface verification such as plate reader and ImageJ analyses are described as well.

Mit diesem Protokoll wir Zelleinfang zeigen (3A) und Zellfreisetzung (3C) von MCF7GFP Zellen sowie Live - Zellkontrollen (Abbildung 4). Wir quantifizierten die Zelle capture als 60% und 80% freigesetzt wurden (Abbildung 3C). Wenn wir diesen Ansatz zu einer Mischung aus RAW 264.7 Makrophagen und MCF7GFP Zellen verlängert, 50% der RAW - Makrophagen wurden gefangen genommen (Abb. 3D) und 80% der RAW - Makr...

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A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

This protocol describes customizable surface functionalization of the desthiobiotin, streptavidin, and APTES system in order to isolate specific cell types of interest. In addition, this manuscript covers the applications, optimization, and verification of this process.

Ein Verfahren zur gezielten Zellisolierung über Glas Oberflächenfunktionalisierung

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

a-method-targeted-cell-isolation-via-glass-surface

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.3K Aufrufe.  University of Illinois at Urbana-Champaign. This protocol describes customizable surface functionalization of the desthiobiotin, streptavidin, and APTES system in order to isolate specific cell types of interest. In addition, this manuscript covers the applications, optimization, and verification of this process. 

Serie: A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently developed method uses a medical wire functionalized with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies for in vivo isolation of circulating tumor cells (CTCs)1. A patient-matched cohort in non-metastatic prostate cancer showed that the in vivo isolation technique resulted in a higher percentage of patients positive for CTCs as well as higher CTC counts as compared to the current gold standard in CTC enumeration. As cells cannot be recovered from current medical devices, a new functionalized wire (referred to as Device) was manufactured allowing capture and subsequent detachment of cells by enzymatic treatment. Cells are allowed to attach to the Device, visualized on a microscope and detached using enzymatic treatment. Recovered cells are cytocentrifuged onto membrane-coated slides and harvested individually by means of laser microdissection or micromanipulation. Single-cell samples are then subjected to single-cell whole genome amplification allowing multiple downstream analysis including screening and target-specific approaches. The procedure of isolation and recovery yields high quality DNA from single cells and does not impair subsequent whole genome amplification (WGA). A single cell&#39;s amplified DNA can be forwarded to screening and/or targeted analysis such as array comparative genome hybridization (array-CGH) or sequencing. The device allows ex vivo isolation from artificial rare cell samples (i.e. 500 target cells spiked into 5 mL of peripheral blood). Whereas detachment rates of cells are acceptable (50 - 90%), the recovery rate of detached cells onto slides spans a wide range dependent on the cell line used (&#60;10 - &#62;50%) and needs some further attention. This device is not cleared for the use in patients.

This protocol is to recover and prepare rare target cells from a mixture with non-target background cells for molecular genetic characterization at the single-cell level. DNA quality is equal to non-treated single cells and allows for single-cell application (both screening based and targeted analysis).

Ziel Zelle Voranreicherung und ganze Genome Amplifikation für einzelne Zelle nachgelagerten Charakterisierung

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Forschung

Krebsforschung

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Biotechnik

Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular infiltrate and epithelial cell activation. The progenitor cell population during such inflammatory reactions has mostly been investigated using single surface markers, either by histological analysis or by flow cytometry-based techniques. However, novel surface markers identified various functionally distinct subsets within the liver progenitor/stem cell compartment. The method presented here describes the isolation and detailed flow cytometry analysis of progenitor subsets using novel surface marker combinations. Moreover, it demonstrates how the various progenitor cell subsets can be isolated with high purity using automated magnetic and FACS sorting-based methods. Importantly, novel and simplified enzymatic dissociation of the liver allows for the isolation of these rare cell populations with a high viability that is superior in comparison to other existing methods. This is especially relevant for further studying progenitor cells in vitro or for isolating high-quality RNA to analyze the gene expression profile.

Liver injuries are accompanied by progenitor cell expansion that represents a heterogeneous cell population. Novel classification of this cellular compartment allows for the distinguishing of multiple subsets. The method described here illustrates the flow cytometry analysis and high purity isolation of various subsets that can be used for further assays.

Isolierung und Anreicherung von Progenitor-Subsets Leber identifiziert durch eine neuartige Oberflächenmarkerkombination

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular ...

Entwicklungsbiologie

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Eine neue Methode zur Lokalisierung Reporter fluoreszierende Kügelchen In der Nähe der Zellkulturoberfläche für Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

Automated System für Single Molecule Fluorescence Messungen der Oberflächen-immobilisierten Biomoleküle

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Biologie

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Isolation und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur des Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T-Zellen, eine extrathymic αβT-Zell-Vorläufer

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Immunologie und Infektion

Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging techniques require propagation of light through glass, but on glass macrophage fusion is a rare event. This protocol presents the fabrication of several optical-quality glass surfaces where adsorption of compounds containing long-chain hydrocarbons transforms glass into a fusogenic surface. First, preparation of clean glass surfaces as starting material for surface modification is described. Second, a method is provided for the adsorption of compounds containing long-chain hydrocarbons to convert non-fusogenic glass into a fusogenic substrate. Third, this protocol describes fabrication of surface micropatterns that promote a high degree of spatiotemporal control over MGC formation. Finally, fabricating glass bottom dishes is described. Examples of use of this in vitro cell system as a model to study macrophage fusion and MGC formation are shown.

This protocol describes the fabrication of optical-quality glass surfaces adsorbed with compounds containing long-chain hydrocarbons that can be used to monitor macrophage fusion of living specimens and enables super-resolution microscopy of fixed specimens.

Herstellung optischer Qualität Glasflächen, Makrophagen Fusion zu studieren

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to develop practical technologies that couple microscopic cell screening with cell isolation at high purity for downstream genetic analysis. Here, the use of photodegradable poly(ethylene glycol) hydrogels for screening and isolation of bacteria with unique growth phenotypes from heterogeneous cell populations is described. The method relies on encapsulating or entrapping cells with the hydrogel, followed by culture, microscopic screening, then use of a high-resolution light patterning tool for spatiotemporal control of hydrogel degradation and release of selected cells into a solution for retrieval. Applying different light patterns allows for control over the morphology of the extracted cell, and patterns such as rings or crosses can be used to retrieve cells with minimal direct UV light exposure to mitigate DNA damage to the isolates. Moreover, the light patterning tool delivers an adjustable light dose to achieve various degradation and cell release rates. It allows for degradation at high resolution, enabling cell retrieval with micron-scale spatial precision. Here, the use of this material to screen and retrieve bacteria from both bulk hydrogels and microfabricated lab-on-a-chip devices is demonstrated. The method is inexpensive, simple, and can be used for common and emerging applications in microbiology, including isolation of bacterial strains with rare growth profiles from mutant libraries and isolation of bacterial consortia with emergent phenotypes for genomic characterizations.

The use of photodegradable hydrogels to isolate bacterial cells by utilizing a high-resolution light pattering tool is reported. Essential experimental procedures, results, and advantages of the process are reviewed. The method enables rapid and inexpensive isolation of targeted bacteria showing rare or unique functions from heterogeneous communities or populations.

Photodegradierbare Hydrogel-Grenzflächen für Bakterienscreening, -selektion und -isolierung

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...

Clinical Microfluidic Chip Platform for the Isolation of Versatile Circulating Tumor Cells

Circulating tumor cells (CTCs) are significant in cancer prognosis, diagnosis, and anti-cancer therapy. CTC enumeration is vital in determining patient disease since CTCs are rare and heterogeneous. CTCs are detached from the primary tumor, enter the blood circulation system, and potentially grow at distant sites, thus metastasizing the tumor. Since CTCs carry similar information to the primary tumor, CTC isolation and subsequent characterization can be critical in monitoring and diagnosing cancer. The enumeration, affinity modification, and clinical immunofluorescence staining of rare CTCs are powerful methods for CTC isolation because they provide the necessary elements with high sensitivity. Microfluidic chips offer a liquid biopsy method that is free of any pain for the patients. In this work, we present a list of protocols for clinical microfluidic chips, a versatile CTC isolating platform, that incorporate a set of functionalities and services required for CTC separation, analysis, and early diagnosis, thus facilitating biomolecular analysis and cancer treatment. The program includes rare tumor cell counting, clinical patient blood preprocessing, which includes red blood cell lysis, and the isolation and recognition of CTCs in situ on microfluidic chips. The program allows the precise enumeration of tumor cells or CTCs. Additionally, the program includes a tool that incorporates CTC isolation with versatile microfluidic chips and immunofluorescence identification in situ on the chips, followed by biomolecular analysis.

The clinical microfluidic chip is an important biomedical analysis technique that simplifies clinical patient blood sample preprocessing and immunofluorescently stains circulating tumor cells (CTCs) in situ on the chip, allowing the rapid detection and identification of a single CTC.

Klinische Mikrofluidik-Chip-Plattform zur Isolierung vielseitig zirkulierender Tumorzellen

Circulating tumor cells (CTCs) are significant in cancer prognosis, diagnosis, and anti-cancer therapy. CTC enumeration is vital in determining patient ...

Functionalized Wire-based Target Cell Isolation: An Ex Vivo Technique to Isolate Cancer Cells from Spiked Peripheral Blood

Source: Chen S. et al. <a href="https://www.jove.com/video/56394" target="_blank">Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization.</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we demonstrate the isolation of EpCAM-expressing epithelial cancer cells from peripheral blood samples. The technique involves the use of a medical-grade wire functionalized with EpCAM&#160;antibodies to capture the target cells. The captured cells are then subsequently extracted into a buffer solution.

Funktionalisierte drahtbasierte Zielzellisolierung: Eine ex vivo Technik zur Isolierung von Krebszellen aus gespicktem peripherem Blut

Source: Chen S. et al. Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization. J. Vis. Exp. (2018)
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