Die konfokale Tomographie wurde entwickelt, um die volle Bandbreite des Verhaltens von Krebszellen zu erhalten, da sie mit der zellulären Barriere und Nische interagieren. Diese Methode bietet eine Grundlage für die Untersuchung von Metastasen, wie sie auftreten. Dieser Ansatz ist nützlich, um das Verhalten von Lebenden Zellen zu quantifizieren.
Die konfokale Tomographie ist in Kombination mit maschinellem Lernen für eine Vielzahl von Organ-on-a-Chip-Plattformen nützlich. Die Analyse von primären oder rezidivierenden Tumorzellen oder zirkulierenden Tumorzellen kann ein wichtiges diagnostisches Werkzeug darstellen, um Hirnmetastasen vorherzusagen und Hirnmetastasen von nicht hirnmetastasierenden Zellen zu unterscheiden. Um das mikrofluidische BBN-Gerät zu montieren, übertragen Sie ein Gerät aus dem Vakuum-Desiccator auf eine geeignete Oberfläche mit nach unten gerichteten Einlässe und legen Sie das gesamte Setup in eine Plasmakammer.
Legen Sie das gesamte Setup in eine Plasmakammer und ziehen Sie ein Vakuum, bevor Sie das Gerät 30 Sekunden lang mit Plasma bei 80 Watt behandeln. Verwenden Sie am Ende der Behandlung eine Anleitung, um das Gerät schnell auf die Glasrutsche auf der Laborbank zu legen, um eine dauerhafte Verbindung zwischen den PDMs des Geräts und dem Dia herzustellen. Als nächstes 200 Mikroliter Pipettenspitzen einsetzen, zwei Millimeter von der Spitze in alle Ein- und Auslässe schneiden und das Gerät für eine achtminütige, 200 Watt Plasmabehandlung in die Plasmakammer legen.
Nachdem das Gerät abgekühlt ist, legen Sie das Gerät in einen sterilen Sekundärbehälter und übertragen Sie innerhalb von 15 Minuten nach der Plasmidbehandlung 120 Mikroliter einer Kollagen-Astrozytenlösung über die Pipettespitze für die Bodenkammer in das Gerät. Lassen Sie die Lösung über die Kammer in die gegenüberliegende Pipettespitze leiten und füllen Sie den nächsten Kanal des Geräts. Wenn alle vier Kanäle des Geräts gefüllt sind, legen Sie den Chip für eine Stunde in den Zellkultur-Inkubator.
Wenn das Kollagen gesetzt ist, alle Pipettenspitzen, die die untere Kammer mit dem entsprechenden kompletten Zellkulturmedium füttern, in Rechnung stellen und die obere Kammer mit 2% Wachstumsfaktor reduziertem Matrigel in komplettem endotheliaalen Medium beschichten. Wenn beide Kammern codiert sind, legen Sie das Gerät für eine Stunde in den Inkubator, bevor Sie die obere Kammer mit dem entsprechenden Medium abspülen. Wechselnde Spitzen, siehe 30 Mikroliter von einem mal 10 bis zur sechsten Endothelzellen pro Milliliter des entsprechenden Mediums, durch die Spitzen in die obere Kammer alle 15 Minuten, für insgesamt vier Aliquots von Zellen pro Spitze.
Inkubieren Sie das Gerät zwischen den Aussaaten. Wenn alle Endothelzellen gesät sind, füllen Sie alle Spitzen mit dem Medium und geben Sie das Gerät für 48 Stunden an den Zellkultur-Inkubator zurück. Wenn die Endothelschicht gereift ist, ersetzen Sie das Medium im Chip, um das Zellkulturmedium aufzufüllen, und säen Sie jeden oberen Kammerkanal mit 30 Mikrolitern von einem mal 10 bis zu den sechs Krebszellen pro Milliliter des entsprechenden Mediums.
Nachdem jeder 30 Mikroliter Aliquot der Zellen gesät wurde, geben Sie das Gerät für 15 Minuten an den Inkubator zurück und füllen Sie dann alle Spitzen mit dem entsprechenden Medium zurück das Gerät in den Zellkultur-Inkubator für 24 bis 48 Stunden. Nachdem das Gerät kultiviert und abgebildet wurde, um den Phänotyp der Krebszellen zu messen, öffnen Sie die mitgelieferte Software und lesen Sie das konfokale Bild ins Gedächtnis. Die Software speichert jeden Farbkanal aus dem konfokalen 3D-Bild in einer separaten TIFF-Datei.
Wählen Sie Opazitätswerte für jeden Mikroskopkanal ändern' und passen Sie den Kanal-Alphawert für die im Bild vorhandenen Farbkanäle an, sodass der Hintergrund entfernt wird und nur die Leuchtstoffröhren innerhalb der Zellen verbleiben. Um den Effekt zu visualisieren, wählen Sie Anzeigen eines 3D-Renderings aus, um zu überprüfen, ob der Schwellenwert richtig eingestellt ist, und wenn das Bild richtig aussieht, speichern Sie die Deckkraftwerte in der Experimenttracker-Tabelle. Verwenden Sie dann Marschwürfel, um das Volumenbild in einzelne dreieckige 3D-Netzobjekte zu konvertieren, die im VTK-Datenformat gespeichert sind.
Um eine Ebene an die Endothelbarriere anzupassen, lokalisieren Sie zuerst die Zellzentroide. Verwenden Sie den Polydatenverbindungsfilter, um die Liste der Netze in der VTK-Datei zu durchlaufen, um die Regionen zu extrahieren, die nicht verbunden sind. Berechnen Sie den Schwerpunkt jedes Netzes, und fügen Sie die Messung einer Liste von Zentroiden hinzu, die nach Netzen filtern, die zu groß oder zu klein sind.
Um eine Ebene an die Liste der Zentroide für die Endothelzellen anzupassen, verwenden Sie eine Minimierung der Fehlermethode, führen Sie Visualize RFP-Zentroide und Ebene fit aus, um die Ebene zu generieren und zu zeichnen und die Passform der Ebene zu überprüfen, indem Sie die Passform bei Bedarf manuell anpassen. Wenn das Flugzeug ordnungsgemäß montiert wurde, speichern Sie die Normale des Flugzeugs in der Experimentier-Tracker-Datei. Um jeden Krebszellen-Phänotyp zu messen, nachdem er die Endothelschicht mit einer Ebene charakterisiert hat, laden Sie die Zellanalysefunktion und führen Sie Read in den Experiment-Tracker-Informationen aus, und analysieren Sie die vorhandenen Kanäle, um jede Region in der VTK-Datei zu iterieren und zu analysieren.
Für jede Region wird die Funktion jede Zelle beschneiden, sodass das Netz unterhalb der Membran berechnet wird. Um den zellulären Phänotyp zu messen, berechnen Sie die Form, das Volumen und die Position jeder Krebszelle. Messen Sie dann das Volumen und die Position jeder abgeschnittenen Krebszelle, um den Prozentsatz der Zelle zu berechnen, die durch die Endothelbarriere extravasiert wurde.
Nachdem Sie diese Schritte für mehrere Experimente ausgeführt haben, führen Sie Exportieren Sie die Daten als einzelne xlsx-Datei aus, um die Daten in einer Kalkulationstabelle zu speichern. Ein mikrofluidischer BBN-Chip mit einer konfluenten Endothelbarriere ist für Experimente akzeptabel, ein mikrofluidischer BBN-Chip mit besonders schlechter Endothelabdeckung nicht. In dieser repräsentativen Analyse zeigt das Gehirn, das Krebszelllinie sucht, eine Subpopulation von Zellen, die über die Endothelbarriere extravasiert und tief in den Gehirnnischenraum des mikrofluidischen BBN-Chips wandert. , während die metastasierende Krebszellpopulation des Gehirns einen Anteil der Zellen beibehielt, die größer als 100% extravasiert waren.
Die morphologische Quantifizierung der Krebszellform zeigte, dass die Elternzellen weniger sphärisch geformte Zellen an einem Tag nach der Aussaat zeigten, während beide Krebszelllinien nach zwei und neun Tagen Interaktion dazu neigten, ihre Sphärizität zu verringern. Darüber hinaus waren die Krebszellsubpopulationen, die in die astricydic Nische extravasierten, kleiner, verglichen mit den Krebszellen, die in Wechselwirkung mit der Endothelbarriere blieben, ohne in das Gehirn zu extravasieren. Gehirn auf der Suche nach Krebszelllinien und Patienten abgeleitet Xenografts, zeigen ein phänotypisches Muster in der mikrofluidischen BBN-Chip, die genutzt werden könnte, um zwischen dem Gehirn metastasieren und nicht Gehirn metastasierende Krebszellen durch maschinelles Lernen zu unterscheiden.
Selbstauswahl ist wichtig. Endothelzellen mit einer höheren, niedrigen Durchgangszahl wiesen ein variables Barriereverhalten auf. Darüber hinaus können sich Krebszellen und ihre fluoreszierende Expression im Laufe der Zeit ändern.
Nach diesem Verfahren können Forscher molekulare Profilierung des Hauses oder der Zellen des Geheimnisses im Gerät verwenden, um molekulare Mechanismen von Metastasen zu untersuchen. Diese Technik ermöglicht die Erforschung komplexer Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und ihren Mikroumgebungen, indem eine technische Mikroumgebung mit einer quantitativen Bildgebung von Nischenkomponenten im Laufe der Zeit kombiniert wird.
