Die Möglichkeit, verschiedene Biotinten zu verwenden, ist für die erfolgreiche Entwicklung von biogedruckten Strukturen von größter Bedeutung, und diese Technologie erleichtert die Verwendung von Materialien, die mit herkömmlichen Drucktechniken im Allgemeinen nicht kompatibel sind. Das Suspensionsmedium verhindert den Kollaps von niedrigviskosen Biotinten bei der Abscheidung und ermöglicht die Integration verschiedener Biotinten in ein einziges Konstrukt, um regionale Variationen der chemischen und mechanischen Eigenschaften zu erzeugen, die eher dem nativen Gewebe ähneln. Das Verfahren wird von Dr. Tom Robertson, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter der Universität Birmingham, und Dr. Jessica Senior, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin der Universität Huddersfield, demonstriert.
Schalten Sie zunächst das Rheometer ein und setzen Sie 40 Millimeter gezackte Geometrien ein, so dass es 30 Minuten stehen kann. Nullen Sie die Spalthöhe des Rheometers mit der Null-Spalthöhen-Funktion. Geben Sie etwa zwei Milliliter Probe auf die Bodenplatte und senken Sie die obere Geometrie ab, um eine Spalthöhe von einem Millimeter zu erzeugen.
Schneiden Sie die Probe ab, indem Sie überschüssiges Material, das zwischen den Platten ausgestoßen wurde, mit einer flachen, nicht abrasiven Kante entfernen, um überschüssige Flüssigkeit aus dem Spalt zu ziehen, und saugen Sie sie mit Seidenpapier auf. Um die Injizierbarkeit der Biotinte zu bestimmen, führen Sie Viskosimetrieprofile durch, indem Sie Viskosimetrietest aus den Benutzeroptionen auswählen. Geben Sie die Parameter für einen scherratengesteuerten Rampentest bei 0,1 bis 500 pro Sekunde mit einer Rampenzeit von einer Minute ein.
Legen Sie eine neue Probe ein und wiederholen Sie den Vorgang, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Um die Geliereigenschaften der Biotinte zu bestimmen, wurden kleine Verformungstests durchgeführt, indem Oszillationstests aus den Benutzeroptionen ausgewählt wurden. Geben Sie Parameter in einen Einzelfrequenztest unter konstanter Dehnung ein, z. B. die Frequenz von einem Hertz, eine Dehnung von 0,5 % über eine Stunde, während die Tinte geliert.
Wiederholen Sie den Viskosimetrie-Rampentest an neuen Proben unter Spannungskontrolle unter Verwendung der oberen und unteren Spannungen, die aus dem Rampentest mit Schergeschwindigkeit bestimmt wurden, wie zuvor gezeigt. Um In-situ-Amplituden- und Frequenzmessungen an gelierten Proben durchzuführen, wählen Sie einen Oszillationstest aus den Benutzeroptionen aus. Nachdem Sie den Amplituden-Sweep ausgewählt haben, geben Sie die Parameter für einen Amplituden-Sweep-Test ein, der dehnungsgesteuert bei 0,01 bis 500 % bei einer konstanten Frequenz von einem Hertz ist.
Analysieren Sie nach Abschluss des Tests die Spektren, um den linearen viskoelastischen Bereich zu bestimmen. Laden Sie eine neue Probe auf das Rheometer und lassen Sie sie gelieren. Wählen Sie dann einen Oszillationstest aus den Benutzeroptionen aus.
Wählen Sie Frequenztest- und Eingangsfrequenzparameter zwischen 0,01 und 10 Hertz und eine Dehnung innerhalb des linearen viskoelastischen Bereichs der Spektren, die aus den zuvor erhaltenen Amplituden-Sweep-Daten bestimmt wurden. Um die CAD-Software zu starten und die Erstellung eines CAD-Modells zu starten, wählen Sie die Option Werkzeuge und klicken Sie dann in der CAD-Software auf Materialien, um die Druckparameter für die ausgewählte Biotinte zu definieren. Geben Sie den geschätzten Filamentdurchmesser in die Registerkarte Dicke ein, um die Z-Dicke jeder Schicht zu bestimmen.
Um die Struktur Schicht für Schicht zu entwerfen, verwenden Sie die Registerkarten "Layer" in der Software, gruppieren Sie die Layer auf der Registerkarte "Gruppieren" und weisen Sie jeden Layer auf der Registerkarte "Ebene" einer Ebene auf der Z-Ebene zu. Erzeugen Sie eine Gitterstruktur, indem Sie eine Schicht mit den Filamenten entlang der x-Achse und eine zweite Schicht entlang der y-Achse erstellen und beide einer separaten Ebene zuweisen. Bestimmen Sie auf der Registerkarte Gruppe die Bauhöhe, indem Sie die Anzahl der sich wiederholenden Einheiten in der Struktur auswählen.
Klicken Sie dann auf das Werkzeug Generieren, um einen G-Code für den Entwurf zu erstellen und ein 3D-Rendering der Struktur anzuzeigen. Aliquotieren Sie im Bioprinter die Biotinte in die Druckpatrone und schrauben sie in den Druckkopf über dem Mikroventil. Klicken Sie dann auf die Nadellängenmessfunktion, um den Druckkopf zu kalibrieren.
Schließen Sie anschließend den montierten Druckkopf an das pneumatische Drucksystem an und laden Sie das Kulturgefäß auf die Druckplattform. Sobald ein geeigneter Druck ausgewählt wurde, öffnen Sie den zuvor generierten G-Code und klicken Sie auf Ausführen, um den Druckvorgang zu starten. Sobald der Druck der Halsschlagader abgeschlossen ist, injizieren Sie mit einer Spritze und einer Nadel zwei Milliliter 200 Millimolar Calciumchlorid-Dihydrat um das Konstrukt herum.
Entfernen Sie nach mindestens drei Stunden das flüssige Gel-Stützbett um das Konstrukt herum und waschen Sie es vorsichtig in PBS. Anschließend wird das Konstrukt mit einem Spatel aus dem Stützbad genommen. Die Anpassung der Druckauflösung von Alginat- und Kollagengittern in Abhängigkeit vom Filamentdurchmesser durch Extrusion bei 30, 60 und 120 Kilopascal wurde beobachtet und die Ergebnisse zeigten, dass die Auflösung direkt mit den Änderungen des Extrusionsdrucks abgestimmt werden konnte.
Um einen Gradienten der mechanischen Eigenschaften zu erreichen, der denen der Haut ähnelt, wurden unterschiedliche Anteile von Pektin und Kollagen in der Haut- und Unterhautschicht verwendet, was zu einer Struktur ohne Anzeichen von Delamination führte. Nach 14 Tagen Kultur, in denen sich die Materialien versteiften, wurde in der gesamten Struktur ein hohes Maß an Zellviabilität beobachtet, was auf einen Umbau des Materials hindeutet. Für die Rheologie ist es wichtig, dass die Probe korrekt geladen wird, um reproduzierbare Daten zu gewährleisten, und für das Bioprinting ist es wichtig, dass die Struktur vollständig vernetzt ist, bevor sie aus dem Stützbett entfernt wird.
Die Kultivierung großflächiger Gewebekonstrukte über einen längeren Zeitraum hilft dabei, die Reaktion der eingebetteten Zellen auf physikalische und chemische Reize zu erforschen.
