Wir danken Deborah Studer für die Hilfe bei der bioprinter. Die Arbeit wurde von der Europäischen Union Siebten Rahmenprogramms (FP7/2007-2013) unter Finanzhilfevereinbarung Nr. NMP4-SL-2009-229292 finanziert.

1. Vorbereitung des Poloxamer 407 Lösung Falls vorhanden, führen Sie die Vorbereitung des Poloxamers Lösung in einem kalten Raum (4 ° C). Wenn nicht vorhanden, legen Sie eine Glasflasche in einem Becherglas mit eiskaltem Wasser gefüllt. Bei höheren Temperaturen wird die Poloxamers oberhalb des Gels Punkt und wird nicht richtig auflösen. <ol><li> 60 ml eiskaltem PBS Lösung in einer Glasflasche und rühren kräftig mit einem Magnetrührer. </li><li> Wiegen 24,5 Gramm Poloxamer und fügen Sie ihn in kleinen Mengen, um die kalte PBS. Warten Sie, bis das Poloxamer hat teilweise, bevor Sie mehr aufgelöst. </li><li> Rühren Sie die Lösung bis alle Poloxamers aufgelöst hat. </li><li> In kaltem PBS bis zu einer endgültigen Volumen von 100 ml erreicht ist. Die Endkonzentration 24,5% w / v. sein </li><li> Stoppen Sie die Lösung gerührt und ruhen lassen bei 4 ° C bis Blasen und Schaum in der Lösung sind verschwunden. Blasen, die in dem Gel eingeschlossen sind, werden die p übertragen werdenrinter Patrone und wird, um Defekte in der gedruckten Opfer Formen führen. </li><li> Filter (0,22 um-Filter) die Lösung direkt in die Druckkassette, um unerwünschte Partikel, die die Nadel verstopfen könnten, zu entfernen. Die Filterung Schritt sollte in einem kalten Raum durchgeführt werden (oder falls nicht vorhanden mit gekühlten Tipps, Filter usw.), um ein Gelieren des Poloxamers im Filter zu vermeiden. Halten Sie die geladenen Patrone bei 4 ° C bis 30 min vor dem Experiment. </li></ol> 2. Vorbereitung der 3D-Drucker Der 3D-Drucker in dieser Arbeit verwendet wurde, war die &quot;BioFactory&quot; von regenHU. Die Extrusion Teil des Systems besteht aus mehreren Teilen. Eine Patrone unter Druck an der Oberseite ist mit einem Verbinder über eine Luer-Lock-Adapter angeschlossen ist. Der Verbinder überbrückt den Raum zwischen dem Auslass der Kartusche und dem Einlass eines Magnetventils. Am Ausgang des Magnetventils kann Nadeln mit unterschiedlichen Durchmessern verwendet werden. Das Material ist auf einer sub extrudiertenStrate das ist an einem beweglichen Bühne von Vakuum gehalten. Die wesentlichen Teile des Systems sind in Abbildung 1 dargestellt. Andere Extrusion basierte Systeme für den Druckvorgang verwendet werden, und die Optimierung muss für jedes System erfolgen. <ol><li> Legen Sie das Magnetventil (Düsendurchmesser 0,3 mm) und die Nadel (Innendurchmesser 0,15 mm) in separaten 1,5 ml Röhrchen mit hochreinem Wasser gefüllt und legen Sie sie in einem beheizten Ultraschallbad für 30 min reinigen. Spülen Sie die Ventile gereinigt mit Ethanol und trocknen Sie sie mit einem Stickstoff-gun. </li><li> Installieren Sie das Ventil und die Nadel in den Drucker sowie ein leeres, sauberes Patrone. </li><li> Bewerben 3 bar Druck auf das System und ausblasen alle restlichen Flüssigkeiten aus dem Ventil installiert und Nadel mit Druckluft. Für kleine Nadeldurchmesser, ist es empfehlenswert, einen Filter (common Spritzenfilter, 0,45 um Porengröße) am Austritt der Druckluft eingebaut, um den Eintritt von kleinen Teilchen, die die Nadel verstopfen könnten zu vermeiden. </li&gt; <li> Drehen Sie den Druck aus und installieren Sie die Patrone mit dem Poloxamers geladen. Die Patrone sollte aus dem Kühlschrank genommen werden ca. 30 min vor der Montage die Patrone so das Poloxamer Raumtemperatur und Gel erreichen können. </li><li> Anwenden 3 bar Druck auf das System und verzichten Poloxamer, bis er die Nadelspitze erreicht und wird in einem kontinuierlichen Strang extrudiert. </li></ol> 3. Optimierung der Parameter Druck Um eine genaue 3D-Strukturen zu schaffen, hat der Druckvorgang für das ausgewählte Material und Konzentration optimiert werden. Abhängig von der Viskosität und der 3D-Druck-System jedes Material ergibt eine spezifische Abgabe Volumen und Strichstärke für einen festen Satz von Parametern. <ol><li> Mit einer geeigneten CAD-Software (in der Lage, ISO-Dateien aus den Zeichnungen zu erstellen), ziehen eine einzige Zeile über die gleiche Länge wie die Struktur, die Sie drucken möchten. </li><li> Legen Sie ein Mikroskop Objektträger aus Glas 25 mm x 75 mm x 1mm oder andere Substrat in den Drucker einsetzen und mit dem Einschalten des Vakuums. </li><li> In der Druckersoftware, setzen Sie das Magnetventil zu einer hohen Frequenz von 50 Hz und stellen einen hohen Druck von 3 bar. </li><li> Drucken einer Schicht aus einer einzigen Zeile mit einer Phase von 300 mm / min. </li><li> Reduzieren Sie den Druck, bis die gewünschte Linienbreite erreicht ist. Sie können auch die Lautstärke regeln, die extrudierten über die Öffnung des Ventils ist. </li><li> Reduzieren der Frequenz des Ventils, bis keine durchgehende Linie nicht mehr bedruckt werden. Wählen Sie eine Frequenz oberhalb dieses Wertes. </li></ol> Hinweis: Wenn die gewünschte Linienbreite und durchgezogenen Linien erzielt werden, die optimale Phase Geschwindigkeit und Dicke, dh der Hub der Nadel nach einer bedruckten Schicht. <ol start="7"><li> Drucken Sie mehrere Schichten auf der jeweils anderen und sehen, ob die Nadel in der richtigen Position über dem vorherigen Schicht nach mehreren gedruckten Schichten. Stellen Sie die Schichtdicke (Nadelhubsensor), So daß jede Schicht auf der Oberseite des nächsten (3) gedruckt wird. </li><li> Verringern der Drehzahl einer von der Stufe von 300 mm / min stufenweise so dass extrudierten Schichten beginnen und enden an den gleichen Positionen wie die vorherigen (Abbildung 4). Zu hohe Geschwindigkeiten Stadium verursachen die Bühne zu bewegen, bevor das extrudierte Material der vorherigen Schicht berührt hat. </li><li> Für den Druck der Säule Strukturen folgen Schritte 3.1.-3.8., Sondern zeichnen, nicht einen Linie zeichnen einen einzigen Punkt. Die Parameter, die den Schwerpunkt auf die beim Drucken die Säulen sind der Druck (regelt Schichtdicke und Säule Durchmesser Poloxamers), die Öffnungszeit des Ventils (extrudierte Volumen) und die Verweilzeit des Druckkopfes an der Stelle, wo die Säule aufgebracht werden sollten . </li><li> Wenn die Parameter optimiert werden sollte Druck mehrerer Schichten einer Linie in einer festen Wand, oder im Falle der Punkte, eine Säule führen. Speichern Sie die Parameter für die spätere Verwendung. </li></ol> Verwenden Sie die Parameter bei der Optimierung Prozedur ab diesem Zeitpunkt gefunden. <ol><li> Drucken Sie die innere Struktur (hier ist eine Säule Array) auf einem Glas-Objektträger und lassen Sie es über Nacht trocknen. Diese a) reduziert die Größe und die Dicke der Strukturen und b) eine bessere Haftung zwischen der Struktur und dem Substrat, so dass ein Abheben beim Verfüllen vermieden werden. </li><li> Mit der CAD-Software, ziehen Sie eine Struktur, die aus einer äußeren Mauer, die die Struktur, die Sie wollen weg eluiert haben und füllte besteht. Drucken Sie die Struktur mit Poloxamers. Der Druck von der Wand dauert 6 min. </li></ol> Achtung: Die Wand hat, die gedruckt mindestens 3,5 mm werden von der inneren Struktur aufgrund der Abmessungen der Nadel. Andernfalls wird der Druck von der äußeren Wand zur Zerstörung der inneren Struktur <ol start="3"><li> Bereiten Sie die Lösung, die Sie wollen Ihre sacr verfüllenificial Form mit (hier 1% Agarose in entionisiertem Wasser). Die Agarose-Lösung sollte eine Temperatur zwischen 35 ° C und 45 ° C. Unterhalb dieser Temperatur wird die Agarose zu schnell verfestigen; oberhalb dieser Temperatur, könnte es die gedruckten Säulen zu zerstören, weil die Struktur Poloxamers erweichen. </li><li> Langsam füllen die Opfer-Form mit der Verfüllung Lösung mit einer Pipette. Dies sollte langsam erfolgen, um Zerstörung der Struktur in der Wand zu vermeiden. </li><li> Lassen Sie die Lösung verfüllten Gel oder vernetzen sie in Abhängigkeit von dem verwendeten Polymer. Im Falle von Agarose die Verfestigung erfolgte bei 4 ° C für 10 min. </li><li> Setzen Sie den verfüllten Opfer Form in einem Eisbad für 10 min, um die Struktur Poloxamers eluieren. </li><li> Tupfen Sie die verfüllten Struktur mit einem Papiertuch und legen Sie es auf eine neue Glasobjektträger. Drücken Sie die Struktur vorsichtig auf den Objektträger, um eine Leckage des dritten Hydrogel aus dem Hohlraum in den Raum zwischen vermeidendie verfüllten Struktur und das Glas Objektträger. </li></ol> 5. Füllung der Hohlräume <ol><li> Um die Hohlräume von der eluierten Poloxamer zu füllen, Füllen der beabsichtigten Polymer-Lösung in eine Spritze mit einer 30 G Nadel ausgestattet. In diesem Beispiel wurde eine 1% ige Alginatlösung Methacrylat in 0,15 M NaCl-Lösung mit Zusatz von 0,05% w / v Lithium phenyl-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) und 2,5% v / v von Alexa-488 konjugiert Fibrinogen . Der Alexa-488-konjugierten Fibrinogen wurde zur Visualisierung hinzugefügt. </li><li> Photopolymerisation das Polymer mit einer hohen Intensität UV-Lampe (100 Watt, 365 nm, Entfernung vom Substrat war 3,5 cm) für 5 min und Bild das Konstrukt unter Verwendung eines Epi-Fluoreszenz oder konfokalen Mikroskop. </li></ol>

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Sci. 290, 1575-1582 (2012).</li><li>Pescosolido, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+Acid+and+Dextran-Based+Semi-IPN+Hydrogels+as+Biomaterials+for+Bioprinting.">Hyaluronic Acid and Dextran-Based Semi-IPN Hydrogels as Biomaterials for Bioprinting.</a> Biomacromolecules. 12, 1831-1838 (2011).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+of+collagen/chondroitin+sulfate/hyaluronan+interpenetrating+polymer+network+for+cartilage+tissue+engineering.">Hydrogels of collagen/chondroitin sulfate/hyaluronan interpenetrating polymer network for cartilage tissue engineering.</a> J. Mater. Sci-Mater. M. 23, 2267-2279 (2012).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verzollen.

Hier stellen wir zum ersten Mal die Verwendung eines thermosensitiven Polymeren nach einem Opfer-Form, die sich schnell in kaltem Wasser kann durch die Gel-Sol-Übergang von Poloxamer von ~ 20 ° C eluiert Die Geschwindigkeit des gesamten Prozesses macht Poloxamers interessant für die schnelle Erstellung von Biopolymer Strukturen, die nicht mit ausreichender Auflösung gedruckt werden kann. Die hier beschriebene Technik kann zur Strukturierung eines Hydrogels in einem anderen Hydrogel oder für die Erstellung von mikro...

Tissue Engineering Ansätze haben große Fortschritte in den letzten Jahren in Bezug auf Regeneration von menschlichen Geweben und Organen 19,20. Doch bis jetzt hat sich der Schwerpunkt des Tissue Engineering wurden oft zu den Geweben, die eine einfache Struktur oder kleinen Abmessungen wie die Blase 21,22 oder der Haut haben 23-25 ​​begrenzt. Der menschliche Körper enthält jedoch viele komplexe dreidimensionale Gewebe, wo Zellen und der extrazellulären Matrix in einem räumlich definierten Weise angeordnet sind. Um diese Gewebe herzustellen, ist eine Technik erforderlich, die Zellen und der extrazellulären Matrix Gerüst in einer dreidimensionalen Konstrukt an bestimmten Stellen zu platzieren. Bioprinting hat das Potential, ein solches Verfahren, bei dem die Vision Herstellung komplexer dreidimensionaler Gewebe 10,11,26-28 realisiert werden kann. Bioprinting wird als &quot;der Verwendung von Material Transfer-Prozesse zur Strukturierung definiert und Montage biologisch relvanten Materialien - Moleküle, Zellen, Gewebe und biologisch abbaubaren Biomaterialien -. einem vorgeschriebenen Organisation an einen oder mehrere biologische Funktionen &quot;4 erreichen Sie umfasst verschiedene Techniken, die Arbeit in verschiedenen Auflösungen und Längenskalen, von der Sub-Mikrometer-Auflösung von zwei -Photonen-Polymerisation 29 mit einer Auflösung von 150 bis 420 um für die Extrusion Druck 1,12,30. Nicht ein einziges Material oder Material-Kombination wird den Anforderungen der jeweiligen Methode 31 zu erfüllen. Für Extrusion Druck, sind die wichtigsten Parameter Viskosität und Gelierdauer 32, wo eine hohe Viskosität und eine schnelle Gelierung wünschenswert. 3D-Druck ist eine Technik, die die einfache Erstellung von Opfer-Formen für die Erstellung von komplexen Geometrien erlaubt 30,33,34. Dieses Verfahren beruht auf der Konstruktion einer Form unter Verwendung einer Rapid Prototyping Technik, wie eine Extrusion bioprinter basiert. Die erstellte Opfer Form verwendet wird, komplexe Strukturen aus Materialien, die schwer zu aufgrund ihrer niedrigen Viskosität und Gelierzeit langsam gedruckt sind bilden. Das hier vorgestellte Verfahren betrifft die Schaffung eines Opfer-Form, die aus einem Material, das schnell löst bei niedriger Temperatur und extrudiert werden kann, genau. Das Block-Copolymer Poly (ethylenglycol) 99-Poly (Propylenglykol) 67-Poly (ethylenglykol) 99 (auch als Pluronic F127 oder Poloxamer 407 bekannt) erfüllt diese Anforderungen. Es wurde bereits in einer modifizierten Version der Extrusion Druck 1 verwendet worden, aber nach unserem Wissen, hat noch nie für den Druck in ihrer unmodifizierten Fassung aufgrund seiner Instabilität in flüssigen Umgebungen eingesetzt. Poloxamer 407 zeigt ebenfalls eine inverse thermische Ansprechverhalten 18 also Änderungen von einem Gel zu einem Sol nach dem Abkühlen. Vor allem aber können sie in komplexe beliebig gekrümmte Strukturen mit sehr hoher Genauigkeit gedruckt werden. Dies ermöglicht die Schaffung eines strukturierten Hydrogel aus einemMaterialien mit niedriger Viskosität in diesem Fall langsam gelierende Agarose durch Pipettieren der Lösung in der gedruckten Form Opferschicht. Die Kombination aus dem Drucken des Opfer-Form mit hoher Wiedergabetreue und ihre praktischen Elution aus dem gegossenen strukturierten Hydrogels ermöglicht eine schnelle und flexible Verfahren zur Herstellung von Formen mit unterschiedlichen Geometrien ohne die Verwendung einer Maske oder eines Stempels, wie es oft in lithographischen Verfahren erforderlich erstellen. Die gegossenen strukturierten Hydrogel weiter mit einem anderen Material, das nicht für die Extrusion geeignet Druck aufgrund seiner niedrigen Viskosität gefüllt werden. Dies ist in unserem Fall eine niedrige Viskosität Alginat Methacrylat Lösung. Hier präsentieren wir die Methode des Reverse thermoresponsive Opfer Formen für Hydrogel Strukturierung am Beispiel einer Säule Array.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poloxamer (Pluronic F127)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P2443</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=10010015" target="_blank">10010-015</a></td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CAD software</td>
 <td>regenHU</td>
 <td>BioCAD</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alginate methacrylate</td>
 <td>Innovent e.V Technologieentwicklung Jena</td>
 <td></td>
 <td >Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F13191</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
 <td>Innovent e.V Technologieentwicklung Jena</td>
 <td></td>
 <td >Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>50004</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bioprinter</td>
 <td>regenHU</td>
 <td>Biofactory</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Valve</td>
 <td>regenHU</td>
 <td>300 &mu;m Nozzel Diameter</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle</td>
 <td>regenHU</td>
 <td>150 &mu;m Inner Diameter</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Zeiss Axioobserver with ApoTome</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td></td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UV Light Source</td>
 <td>UVP</td>
 <td>Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp</td>
 <td>100 W</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

printing thermoresponsive reverse molds for the creation of patterned two-component hydrogels for 3d cell culture

Bioprinting ist eine neue Technologie, die ihre Ursprünge in der Rapid-Prototyping-Branche hat. Die verschiedenen Druckverfahren in Kontakt Bioprinting 1-4 (Extrusion, Dip-Pen und weiche Lithographie), kontaktlose Bioprinting 5-7 (Vorwärtstransfer Laser-, Tintenstrahl-Abscheidung) und Laser-basierte Techniken wie Zwei-Photonen Photopolymerisation 8 aufgeteilt werden. Es kann für viele Anwendungen wie Tissue Engineering 9-13, 14-16 und Biosensor microfabrication als Instrument genutzt werden, um grundlegende biologische Fragen, wie Einflüsse von Co-Kultivierung verschiedener Zelltypen 17 beantworten. Anders als bei herkömmlichen Photolithographie oder Soft-lithographischen Methoden, hat Extrusion Bioprinting den Vorteil, dass es nicht erforderlich, eine separate Maske oder Stempel. CAD-Software verwenden, kann das Design der Struktur schnell verändert und entsprechend den Anforderungen des Betreibers eingestellt werden kann. Dies macht Bioprinting flexibler als Lithographie-basiertenAnsätze. Hier zeigen wir, das Drucken eines Opfer-Form, um ein Multi-Material-3D-Struktur mit einer Reihe von Säulen in einem Hydrogel als Beispiel zu erstellen. Diese Säulen konnte hohlen Strukturen für eine vaskuläre Netzwerk oder die Rohre innerhalb eines Nervenleitschiene Leitung zu vertreten. Das Material für die Opferschicht Form gewählt wurde, Poloxamer 407, ein thermoresponsive Polymer mit hervorragenden Druckeigenschaften, die flüssig ist bei 4 ° C und eine feste oberhalb ihrer Geliertemperatur ~ 20 ° C 24,5% w / v Lösung 18. Diese Eigenschaft ermöglicht die Poloxamer-basierte Opferschicht Form auf Verlangen eluiert und hat Vorteile gegenüber der langsamen Auflösung eines festen Materials besonders bei schmalen Geometrien. Poloxamer wurde am Mikroskop Glasträger gedruckt, um die Opfer-Form zu erstellen. Agarose wurde in die Form pipettiert und abgekühlt, bis die Gelierung. Nach der Elution der Poloxamer in eiskaltem Wasser wurden die Hohlräume in der Form mit Alginat Agarose Methacrylat sp gefülltiked mit FITC markiertes Fibrinogen. Die gefüllten Hohlräume wurden dann mit UV-vernetzt und das Konstrukt wurde mit einem Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskop abgebildet.

Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass die Rückform Technik (dargestellt in Abbildung 2) wird eine strukturierte Gel, das mit einem zweiten Material gefüllt werden können. Zu Beginn eines jeden Druckvorgang die Druckparameter werden zunächst optimiert. Stufenweise Anpassung der Parameter werden in gedruckter vielschichtigen Konstrukte in Abbildung 3 und Abbildung 4, wenn einzelne Zeilen gedruckt dargestellt führen. Wenn die Schichtdicke (die Nadelhub nach ein...

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Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture

Ein bioprinter wurde verwendet, um strukturierte Hydrogele auf einem Opfer-Form zu erstellen. Das Poloxamer Form wurde mit einem zweiten Hydrogel verfüllt und dann eluiert, so dass Hohlräume, die mit einem dritten Hydrogel gefüllt wurden. Diese Methode verwendet schnelle Elution und gute Bedruckbarkeit von Poloxamers zu komplexen Architekturen aus Biopolymeren zu generieren.

Drucken Thermoresponsive Reverse-Formen für die Erstellung von Gemusterte Zweikomponenten-Hydrogele für 3D Zellkultur

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact ...

printing-thermoresponsive-reverse-molds-for-creation-patterned-two

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.0K Aufrufe.  Cartilage Engineering & Regeneration. Ein bioprinter wurde verwendet, um strukturierte Hydrogele auf einem Opfer-Form zu erstellen. Das Poloxamer Form wurde mit einem zweiten Hydrogel verfüllt und dann eluiert, so dass Hohlräume, die mit einem dritten Hydrogel gefüllt wurden. Diese Methode verwendet schnelle Elution und gute Bedruckbarkeit von Poloxamers zu komplexen Architekturen aus Biopolymeren zu generieren.

Serie: Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Nachweis von infektiösen Viren aus Field-gesammelt Moskitos von Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent reactivation events that ensure transmission and contribute to clinical disease. Current antivirals do not impact the latent reservoir and there are no vaccines. While the molecular details of lytic replication are well-characterized, mechanisms controlling latency in neurons remain elusive. Our present understanding of latency is derived from in vivo studies using small animal models, which have been indispensable for defining viral gene requirements and the role of immune responses. However, it is impossible to distinguish specific effects on the virus-neuron relationship from more general consequences of infection mediated by immune or non-neuronal support cells in live animals. In addition, animal experimentation is costly, time-consuming, and limited in terms of available options for manipulating host processes. To overcome these limitations, a neuron-only system is desperately needed that reproduces the in vivo characteristics of latency and reactivation but offers the benefits of tissue culture in terms of homogeneity and accessibility.
Here we present an in vitro model utilizing cultured primary sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG) (Figure 1) to study HSV-1 latency and reactivation that fits most if not all of the desired criteria. After eliminating non-neuronal cells, near-homogeneous TrkA+ neuron cultures are infected with HSV-1 in the presence of acyclovir (ACV) to suppress lytic replication. Following ACV removal, non-productive HSV-1 infections that faithfully exhibit accepted hallmarks of latency are efficiently established. Notably, lytic mRNAs, proteins, and infectious virus become undetectable, even in the absence of selection, but latency-associated transcript (LAT) expression persists in neuronal nuclei. Viral genomes are maintained at an average copy number of 25 per neuron and can be induced to productively replicate by interfering with PI3-Kinase / Akt signaling or the simple withdrawal of nerve growth factor1. A recombinant HSV-1 encoding EGFP fused to the viral lytic protein Us11 provides a functional, real-time marker for replication resulting from reactivation that is readily quantified. In addition to chemical treatments, genetic methodologies such as RNA-interference or gene delivery via lentiviral vectors can be successfully applied to the system permitting mechanistic studies that are very difficult, if not impossible, in animals. In summary, the SCG-based HSV-1 latency / reactivation system provides a powerful, necessary tool to unravel the molecular mechanisms controlling HSV1 latency and reactivation in neurons, a long standing puzzle in virology whose solution may offer fresh insights into developing new therapies that target the latent herpesvirus reservoir.

The protocol describes an efficient and reproducible model system to study herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latency and reactivation. The assay employs homogenous sympathetic neuron cultures and allows for the molecular dissection of virus-neuron interactions using a variety of tools including RNA interference and expression of recombinant proteins.

Eine primäre Neuron Culture System zur Erforschung des Herpes Simplex Virus Latenz und Reaktivierung

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

Überwachung dendritische Zellen mit Migration<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Lymphocyte Isolierung von menschlicher Haut für phänotypische Analyse und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Zellkultur

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Organoide als Modell für Infektionskrankheiten: Kultur von humanen und murinen Magen Organoide und Mikroinjektion von Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

A simple and reliable method is described here to analyze a set of NK cell functions such as degranulation, cytokine and chemokine production within different NK cell subsets.

Durchflusszytometrie-basierte Assay zur Überwachung von NK-Zell-Funktionen

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and migration. One critical limitation of such assays, however, is their homogenous assortment of cellular types. Repair is a complex process which demands the interaction of several cell types. Therefore, to study a culture devoid of cellular subtypes, is a concern that must be overcome if we are to understand the repair process. The gastric organoid model may alleviate this issue whereby the heterogeneous collection of cell types closely reflects that of the gastric epithelium or other native tissues in vivo. Demonstrated here is a novel, in vitro scratch-wound assay derived from human or mouse 3-dimensional organoids which can then be transferred to a gastric epithelial monolayer as either intact organoids or as a single cell suspension of dissociated organoids. The goal of the protocol is to establish organoid-derived gastric epithelial monolayers that can be used in a novel scratch-wound assay system to study gastric regeneration.

Here we describe a protocol for establishing and culturing human- and mouse-derived 3-dimensional (3D) gastric organoids, and the method for the transfer of 3D organoids to a 2-dimensional monolayer. The use of the gastric epithelial monolayer as a novel scratch-wound assay for regeneration studies is also described.

Abgeleitet von Maus und Mensch primäre gastrische Epithelzellen Monolayer Kultur for the Study of Regeneration

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for understanding the function of bacterial cells in the natural environment. Because of technological advances, various bacterial cell functions can be revealed at the single-cell level inside a confined space. GVs are spherical micro-sized compartments composed of amphiphilic lipid molecules and can hold various materials, including cells. In this study, a single bacterial cell was encapsulated into 10&#8211;30 &#956;m GVs by the droplet transfer method and the GVs containing bacterial cells were immobilized on a supported membrane on a glass substrate. Our method is useful for observing the real-time growth of single bacteria inside GVs. We cultured Escherichia coli (E. coli) cells as a model inside GVs, but this method can be adapted to other cell types. Our method can be used in the science and industrial fields of microbiology, biology, biotechnology, and synthetic biology.

We demonstrate single-cell culture of bacteria inside giant vesicles (GVs). GVs containing bacterial cells were prepared by the droplet transfer method and were immobilized on a supported membrane on a glass substrate for direct observation of bacterial growth. This approach may also be adaptable to other cells.

Bakterielle Zellkultur auf der Einzelzellebene im Riesenvesikel

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus

Tilapia lake virus disease (TiLVD), an emerging viral disease in tilapia caused by the tilapia lake virus (TiLV), is a persistent challenge in the aquaculture industry that has resulted in the mass morbidity and mortality of tilapia in many parts of the world. An effective, rapid, and accurate diagnostic assay for TiLV infection is therefore necessary to detect the initial infection and to prevent the spread of the disease in aquaculture farming. In this study, a highly sensitive and practical reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) method is presented to detect tilapia lake virus in fish tissue. A comparison of the RT-qPCR and RT-LAMP assays of infected samples revealed positive results in 63 (100%) and 51 (80.95%) samples, respectively. Moreover, an analysis of uninfected samples showed that all 63 uninfected tissues yielded negative results for both the RT-qPCR and RT-LAMP assays. The cross-reactivity with five pathogens in tilapia was evaluated using RT-LAMP, and all the tests showed negative results. Both the liver and mucus samples obtained from infected fish showed comparable results using the RT-LAMP method, suggesting that mucus can be used in RT-LAMP as a nonlethal assay to avoid killing fish. In conclusion, the results demonstrated that the presented RT-LAMP assay provides an effective method for TiLV detection in tilapia tissue within 1 h. The method is therefore recommended as a screening tool on farms for the rapid diagnosis of TiLV.

Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus

We present an RT-LAMP assay for the detection of TiLV in tilapia fish using simple instruments over a relatively short period of time compared to conventional RT-PCR techniques. This protocol may help control the epidemic spread of TiLVD, especially in developing countries.

Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay für die spezifische und schnelle Detektion von Tilapia Lake Virus

Tilapia lake virus disease (TiLVD), an emerging viral disease in tilapia caused by the tilapia lake virus (TiLV), is a persistent challenge in the ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

P. aeruginosa Infizierte 3D-Co-Kultur von Bronchialepithelzellen und Makrophagen an der Luft-Flüssig-Schnittstelle zur präklinischen Bewertung von Anti-Infektivika

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...