Mit unserem Protokoll fördert die Multilayering der flüssigkeitsähnlichen Bioinkverdünnungen nicht nur eine homogene Dispergität der verkapselten Zellen, sondern sorgt auch für eine zelltaugliche Bioinkumgebung. Wir verwenden die Grenzflächenspannung, um die Sedimentation der verkapselten Zellen innerhalb des Bioink-Reservoirs zu stoppen und die hohe Scherbelastung der Zellen während des Extrusionsdrucks zu vermeiden. Mit dieser Technologie können wir 3D-Gewebekonstrukte mit einer homogenen Zellverteilung erzeugen, die eine funktionelle In-vitro-Gewebeform für den Einsatz in Arzneimittelscreenings und Regenerationsmedizinstudien bereitstellt.
Bei der Herstellung des Bioinks ist es wichtig, auf die Versuchstemperatur und das Hygrogel-Ladeverfahren zu achten, da diese Faktoren die Qualität der Tinte beeinflussen können. Vor Beginn der Zubereitung verwenden Sie 0,22-Mikrometer-Spritzenfiltereinheiten, um alle Materialien zu sterilisieren, und lösen Sie Gelatine in einer Endkonzentration von 10 % in 50-Grad-Celsius-PBS in einem biologischen Sicherheitsschrank auf. Methacrylanhydrid in einem Gewichtsverhältnis von 0,6 zu 1 mit langsamem Rühren für mindestens eine Stunde bei 50 Grad Celsius in die Gelatinelösung geben.
Am Ende der Inkubation die Mischlösung in ein steriles 50-Milliliter-Rohr geben und die Lösung durch Zentrifugation in Schichten trennen. Sammeln Sie die obere GelMA-Schicht und verdünnen Sie die gesammelte Lösung mit zwei Volumina von 40 bis 50 Grad Celsius entionisiertem Wasser. Dialyze die GelMA-Lösung mit einer 12 bis 14 Kilodalton Molekulargewichts-Cutoff-Dialysemembran gegen deionisiertes Wasser für fünf bis sieben Tage bei 40 bis 50 Grad Celsius und wechsele das Wasser zweimal täglich.
Am Ende der Dialyse, frieren Sie die GelMA-Lösung bei minus 80 Grad Celsius über Nacht. Als nächstes lyophilisieren Die GelMA-Lösung für drei bis fünf Tage in einem Gefriertrockner bei minus 45 Grad Celsius und 0,2 Millibar Druck. Dann lösen Sie das lyophilisierte GelMA in PBS, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, 25 Millimolar HEPES und 0,5% Photoinitiator.
Um die Seidenfibroin-GelMA-Bioinks zu erhalten, mischen Sie die GelMA-Lösung mit verschiedenen Volumina der anfänglichen Seidenfibroinlösung und verschiedenen PBS-Volumen, wie in der Tabelle vorgeschlagen. Wenn alle Biotinten vorbereitet sind, beschallen Sie die Lösung für 10 bis 20 Minuten. Während die Tinten beschallt werden, sammeln Sie die Zellen aus einer 80%konfluenten NIH/3T3-Zellkultur in einem 15-Milliliter konischen Rohr pro Bioinklösung und pellet die Zellen durch Zentrifugation.
Dann die Überstande vorsichtig ansaugen und die Zellen in jeder Röhre mit zwei Milliliterbioink mit einem Mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter Bioinklösungskonzentration wieder aufsetzen. Um den Bioink zum Drucken zu laden, fügen Sie 400 Mikroliter zellbeladenes Seidenfibroin 0,5 GelMA in die untere Schicht einer Zwei-Milliliter-Spritze ein. Legen Sie die Spritze für fünf Minuten in ein Null-Grad-Celsius-Eiswasserbad, um die Bioink der unteren Schicht in einen Gelzustand zu verwandeln, bevor Sie 400 Mikroliter zellbeladenes Seidenfibroin 0,75 GelMA-Bioink über die Schicht aus Seidenfibroin 0,5 GelMA laden.
Dann geben Sie die Spritze für fünf Minuten ins Eisbad zurück, wobei Sie weiterhin jede zusätzliche Konzentration von zellbeladenem Bioink auf die gleiche Weise in die Spritze aufnehmen. Wenn ein mehrschichtiges Bioinksystem mit unterschiedlichen Konzentrationen von Seidenfibroin innerhalb der verschiedenen Schichten erreicht wurde, erhitzen Sie den Bioink in einem 37-Grad-Celsius-Inkubator für 30 Minuten. Laden Sie am Ende der Inkubation eine 27-Spur-Druckdüse auf die Spritze und stellen Sie die Durchflussgeschwindigkeit auf 50 Mikroliter pro Minute, die Bewegungsgeschwindigkeit der Düse auf zwei Milliliter pro Sekunde und die Höhe der Düse auf einen Millimeter ein.
Als nächstes drucken Sie das Gewebekonstrukt in extrusionsorientierter Weise mit einem maßgeschneiderten Bioprinter bei Raumtemperatur und vernetzen Sie das biogedruckte Gewebekonstrukt mit 365 Nanometern ultraviolettem Licht für 40 Sekunden bei 800 Milliwatt. Dann Kultur das vernetzte Gewebekonstrukt in DMEM ergänzt mit 10%fetalem Rinderserum und 1%penicillin-streptomycin in einem Zellkultur-Inkubator, das Medium alle acht Stunden während der ersten zwei Tage und alle zwei bis drei Tage danach ändern. In dieser repräsentativen Analyse, im Verlauf des Bioprinting-Verfahrens, nahm die Dichte der Zellen in den Zielbrunnen in allen Gruppen ab.
In der Seidenfibroin-Null-GelMA-Gruppe wurden etwa 70% der Zellen in der unteren Schicht abgelagert. In der Seidenfibroin-Gruppe wurde eine GelMA-Gruppe von etwa 40% der Zellen in der unteren Schicht abgelagert, und etwa 5% der Zellen wurden in der oberen Schicht abgelagert. In der Seidenfibroin-Mehrschicht-GelMA-Gruppe war die Ablagerung von verkapselten Zellen homogener als die der Kontrollgruppen.
Der kritischste Teil dieses Protokolls ist das Laden der SF-GelMA Bioink Multilayer. Dieses Protokoll kann auf andere Extrusionsbioprinting-Analysen angewendet werden, die flüssige Bioinks verwenden.
