Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von dreidimensionalem vaskularisiertem und funktionellem thermogenem Fett aus mikrovaskulären Fragmenten (MVFs). Aktuelle Strategien zur Herstellung von thermogenem Fettgewebe sind komplex und bilden seine multizellulären und funktionellen Eigenschaften nicht vollständig ab. MVFs sind eine einzige Quelle von Zellen, die die Vaskularisierung und die Bildung von Fettgewebe ermöglichen.
Da es sich um eine einfache Methode zur Herstellung biologischer Imitationen von beigem Fett handelt, bergen MVFs ein erhebliches Potenzial für die Förderung des Verständnisses oder der Entwicklung von Behandlungen für Fettleibigkeit und Stoffwechselerkrankungen. Legen Sie das entsprechend rasierte und euthanasierte Tier, das mit 70%igem Ethanol behandelt wurde, in Rückenlage und beginnen Sie mit der Isolierung des Leistenfetts. Heben Sie die Haut unter dem Penis mit einer Schere an und führen Sie den Schnitt durch, beginnend in der Mitte und seitlich schneidend, um eine V-Form zu bilden, bevor Sie sich zum Hinterteil des Tieres schlängeln, um an die gesamte Fettdepot zu gelangen.
Achten Sie beim Schneiden auf die Trennung der Haut vom Fett, indem Sie das miteinander verbundene Fasziengewebe durchtrennen. Sobald die Faszie richtig geschnitten ist, stellen Sie sicher, dass das Leistenfett von beiden Seiten, das sich von der Leiste nach hinten erstreckt, sichtbar ist. Als nächstes entfernen Sie das Fett von beiden Seiten in separaten konischen Röhrchen, die 10 Milliliter BSA in PBS mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter enthalten.
Um das Nebenhodenfett zu gewinnen, schneiden Sie durch die Bauchhaut und anschließend vorsichtig durch die dünne Schicht, die die Hoden umgibt. Ziehen Sie das Fettgewebe vorsichtig mit einer Pinzette und schneiden Sie es mit einer Schere heraus, während Sie die Sektion der wichtigsten sichtbaren Blutgefäße vermeiden. Geben Sie nun das entfernte Fett in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, das 10 Milliliter eines Milligramms pro Milliliter BSA in PBS enthält.
Um das hintere Unterhautfett zu isolieren, drehen Sie die Ratte auf den Bauch und schneiden Sie mit einer großen Schere die dicke Haut des Rückens bis zur Kopfhaut ab, wobei Sie darauf achten müssen, nicht zu tief unter die Haut zu schneiden. Schneiden Sie die Faszien durch, die die Haut mit dem Gewebe verbinden. Unterscheiden Sie das subkutane Fett, das sich in der intrascapularen Region befindet, von dem braunen Fett, das sich näher an der Wirbelsäule befindet, bevor Sie das subkutane Fett isolieren und in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen geben, das 10 Milliliter eines Milligramms pro Milliliter BSA in PBS enthält.
Während Sie in einer Biohaube arbeiten, verwenden Sie eine Pinzette, um das herausgeschnittene Fett in eine Standard-100-Milliliter-Petrischale zu geben, die 0,5 Milliliter eines Milligramms pro Milliliter BSA in PBS enthält. Entfernen Sie alle sichtbaren Blutgefäße, Muskeln oder Fremdgewebe aus dem Fett. Hacken Sie das Fett mit einer Schere 10 Minuten lang und prüfen Sie, ob Klumpen vorhanden sind, indem Sie etwas mehr BSA hinzufügen.
Zerkleinern Sie bei Bedarf weiter, bevor Sie die Hackfettsuspension mit einer 10-Milliliter-Pipette in einen sterilen 250-Milliliter-Kolben überführen. Stellen Sie das Volumen im Kolben auf 20 Milliliter her, indem Sie genügend BSA in PBS hinzufügen. Fügen Sie nun BSA in PBS zur Kollagenase hinzu und homogenisieren Sie die Lösung, indem Sie sie vorsichtig schütteln, bevor Sie sie steril durch einen 0,22-Mikron-Nylon-Netzfilter filtern.
Geben Sie sofort die erforderliche Menge Kollagenaselösung in die Hackfettsuspension und verdauen Sie das Fett, indem Sie den Kolben in kreisenden Bewegungen in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für die entsprechende Zeit schütteln. Übertragen Sie das verdaute Fett in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, das als verdautes Fett oder Hackfett gekennzeichnet ist. Zentrifugieren Sie das Röhrchen vier Minuten lang bei 400 G, um die mikrovaskulären Fragmente (MVFs) zu einem roten Pellet zu schleudern.
Dekantieren Sie den Überstand vorsichtig in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, das mit Abfall beschriftet ist, ohne das Pellet zu stören. Als nächstes geben Sie 10 Milliliter eines Milligramms pro Milliliter BSA in PBS in das Röhrchen mit dem Pellet und mischen Sie die Pelletsuspension, indem Sie sie zweimal vorsichtig auf und ab pipettieren, ohne die Fragmente zu zerstören. Nehmen Sie nun das 500-Mikron-Sieb, das in einer sterilen Petrischale mit fünf Millilitern eines Milligramms pro Milliliter BSA in PBS vorgetränkt ist, und legen Sie es über den Kunststoffsiebhalter, der auf einer neuen Petrischale aufbewahrt wird.
Pipettieren Sie 10 Milliliter Suspension aus dem aufgeschlossenen Pelletröhrchen in konzentrischen Kreisen auf das Sieb. Waschen Sie den Filter mit weiteren fünf Millilitern eines Milligramms pro Milliliter BSA in PBS und entsorgen Sie ihn, während das Filtrat in der Petrischale verbleibt. Legen Sie dann das vorgetränkte 37-Mikron-Sieb über dem Kunststoff-Siebhalter auf eine neue Petrischale.
Mit einer frischen Pipette das Filtrat aus der ersten Filtration in konzentrischen Kreisen auf das Sieb übertragen. Wie zuvor beschrieben, waschen Sie das Sieb mit BSA in PBS und verwerfen Sie dieses Mal das Filtrat, während Sie das 37-Mikron-Sieb beibehalten. Schieben Sie das 37-Mikrometer-Sieb in eine neue Petrischale, die fünf Milliliter eines Milligramms pro Milliliter BSA in PBS enthält.
Entfernen Sie die Fragmente, indem Sie die Schale vorsichtig gegen einen konischen Halter klopfen, ohne Flüssigkeit zu verschütten. Spülen Sie den Filter mit zusätzlichen fünf Millilitern BSA in PBS aus. Als nächstes füllen Sie die Flüssigkeit aus der Petrischale in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen.
Spülen Sie das 37-Mikron-Sieb noch einige Male aus und geben Sie die Wäsche in das konische Röhrchen, bis das gesammelte Gesamtvolumen 15 bis 20 Milliliter beträgt. Entsorgen Sie das Sieb nach dem letzten Spülen. Schneiden Sie das Ende einer 20-Mikroliter-Pipettenspitze mit einer Schere ab.
Schütteln Sie das Röhrchen mit der Flüssigkeit vorsichtig, bevor Sie mit der abgeschnittenen Pipettenspitze zwei Aliquots von 20 Mikrolitern entnehmen, und pipettieren Sie jedes der Aliquots in eine saubere 35-Millimeter-Petrischale. Zählen Sie die Anzahl der Fragmente in der Probe in jeder Petrischale mit einem Standard-Lichtmikroskop und erhalten Sie mit der im Manuskript genannten Formel die Gesamtzahl der isolierten mikrovaskulären Fragmente. Schleudern Sie die restliche Flüssigkeit im konischen 50-Milliliter-Röhrchen bei 400 G vier Minuten lang, um den MVF aufzufangen.
Nach dem Schleudern den größten Teil des Überstands aus dem konischen Röhrchen umfüllen und mit einer Pipette das kleine Flüssigkeitsvolumen entfernen, das am Rand des Röhrchens verbleibt. Als nächstes geben Sie Thrombin in die Vertiefungen, die für das Gießen von Gelen vorgesehen sind. Schneiden Sie das Ende einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze ab und resuspendieren Sie damit vorsichtig die MVFs in Fibrinogen, um die gewünschte Enddichte zu erreichen.
Pipettieren Sie die Suspension in die Thrombinlösung in der Vertiefung und homogenisieren Sie die Mischung schnell durch Auf- und Abpipettieren. Sobald alle Gele gegossen sind, legen Sie die Wellplatte für etwa 15 Minuten in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, um eine Gelvernetzung zu ermöglichen. Die Lipide und die differenzierten Adipozyten wurden durch konfokale mikroskopische Bildgebung der Hydrogele unter Verwendung von BODIPY als Lipidfärbung beobachtet.
Die Kultivierung von nicht-vaskularisiertem Fettgewebe unter Verwendung von weißem adipogenem oder beigem adipogenem Medium führte zur Bildung von nicht-vaskularisiertem weißem bzw. beigefarbenem Fettgewebe sowohl aus mageren als auch aus diabetischen Nagetier-MVFs. In ähnlicher Weise führte die Kultivierung von vaskularisiertem Fettgewebe unter Verwendung von weißem adipogenem oder beigem adipogenem Medium zur Bildung von vaskularisiertem weißem bzw. beigem Fettgewebe aus den von Nagetieren stammenden MVFs. Nicht-vaskularisiertes weißes und beiges Fettgewebe, das aus humanen MVFs gewonnen wurde, wurde ebenfalls durch konfokale Mikroskopie beobachtet.
Die Fähigkeit von MVFs, sich in beiges Fettgewebe zu differenzieren, wurde mittels RT-qPCR genetisch bestätigt. Magere und diabetische MVFs von Nagetieren, die direkt bei weißen adipogenen oder beigen adipogenen Medien exponiert wurden, wurden auf Adipogenese, Thermogenese und Angiogenese untersucht. Die Expression des Entkopplungsproteins 1 war erwartungsgemäß im beigen adipogenen Gewebe signifikant höher.
Ein ähnlicher Trend wurde bei Nagetier-MVFs beobachtet, die indirekten weißen adipogenen oder beigen adipogenen Medien ausgesetzt waren, sowie bei menschlichen MVFs, die direkt weißen adipogenen oder beigen adipogenen Medien ausgesetzt waren. Schließlich zeigte sich aus der mitochondrialen Bioenergetik, dass das beige Fettgewebe funktionell in allen Fällen eine charakteristisch höhere Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) aufwies. Die enzymatische Verdauung des Fettgewebes sollte optimiert werden, um MVFs ähnlicher Größe und Qualität konsistent zu reproduzieren.
Nach dem Aufschluss sollten MVFs vorsichtig und mit besonderer Sorgfalt behandelt werden, um ein weiteres Aufbrechen der Fragmente zu vermeiden. Diese Technik trug dazu bei, das Gleichgewicht zwischen Gefäßwachstum und Adipozytendifferenzierung zu fördern, was nachweislich von den eingebrachten Faktoren abhängt.
