Name: analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix
Uploaded: 2014-10-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
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This work was supported by the Fritz-Bender-Foundation, Munich, Germany

1. Vorbereitung der Migration Chambers <ol><li> Bereiten Sie eine Paraffinwachs / Vaseline (1: 1)-Mix und Hitze, bis die Mischung geschmolzen ist. Mit Hilfe eines Pinsel und ziehen 2-3 Schichten der Paraffinwachs / Vaseline (1: 1) mischen in der Mitte der Glasträger in Übereinstimmung mit den 1B-1D. HINWEIS: Wir sind mit gemeinsamen Glasobjektträger (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (B / T / H)) </li><li> Gelten die geschmolzene Paraffin / Vaseline Mischung schnell auf dem Objektträger zu vermeiden, um eine Verfestigung während des Zeichnens. Sicherstellen, dass das Paraffinwachs / Vaseline-Schicht ist etwa 2-2,5 cm lang und 0,3-0,5 cm in der Breite. Die Dicke der Paraffinwachs / Vaseline-Schicht sollte etwa 0,1-0,15 cm. </li><li> Fügen Sie ein Deckglas auf dem erstarrten Paraffin / Vaseline-Mix und verschließen Sie diese mit zwei zu drei Lagen Paraffinwachs / Vaseline-Mix (1E, 1F). Verwenden Sie 4-8 Migrationskammern für eine gemeinsame Zellmigration Experiment. Ort Migrationskammern in eine aufrechte Position in einem Rack. </li></ol> 2. Herstellung der Kollagensuspension Zell Mix <ol><li> Ernte (zB mit 0,25% Trypsin / EDTA) und zählen Zellen von Interesse. Resuspendieren der Zellen in Komplettmedium, das fötales Kälberserum (FCS), Antibiotika und empfohlenen Ergänzungsmittel. Vorbereitung 4-8 1,5 ml Reaktionsgefäße und 20 ul Zellsuspension, die 4-6 × 10 4 Zellen (die Gesamtzahl der Zellen von den Zelltyp zu analysieren) und füllen bis zu 50 ul mit komplettem Medium. HINWEIS: Zusätzliche Verbindungen (zB Wachstumsfaktoren, Chemokine, Inhibitoren, etc.) zu der Zellsuspension gegeben. Verwenden Sie geeignete Lager-Lösungen, so dass das endgültige Volumen der Zellsuspension 50 ul nicht überschreiten. </li><li> Bereiten Sie eine Gesamtmenge von 452 ul endgültige Kollagensuspension für vier Zellmigration Experimenten. Dann werden 50 ul 10x MEM (pH 5,1-5,5) und 27 ul 7,5% iger Natriumhydrogencarbonatlösung (pH 9,0-9,5) In ein 1,5 ml Reaktionsgefäß und gründlich mischen. Beachten Sie die Farbe der Lösung wiederum von gelb-orange bis intensiv violett (pH-Wert 9,0-9,5). Fügen Sie 375 ul Flüssigkeit Kollagensuspension auf die 10x MEM / Natriumhydrogencarbonat-Lösung und gründlich mischen. Der pH-Wert des fertigen Kollagen Suspension sollte über 7,5 liegen (von einer Licht lila Farbe angegeben). Hinweis: Prüfen Sie den pH-Wert der 7,5% Natriumhydrogencarbonat-Lösung. Wenn der pH-Wert etwa 7,5 Ort die Natriumbicarbonatlösung mit offenem Deckel in einem Inkubator (37 ° C, 5% CO 2), mit CO 2 gesättigt und der pH-Wert (etwa 9,0 bis 9,5) zu erhöhen. Der pH-Wert der Kollagensuspension Zellmischung ist von entscheidender Bedeutung für die Stabilität des Kollagen-Netzwerk. Wenn sie zu niedrig ist Kollagengitter während der Zellmigration Experiment kollabieren. HINWEIS: Für dieses Protokoll verwenden flüssigen Kollagen (pH-Wert 1,9-2,2) aus Rinderhinter (2,9-3,3 mg / ml Kollagen, 95% Kollagen Typ I, 5% Kollagen Typ IV). Beispiele für weitere Kollagengitter Vorbereitung Protokolle mitKollagen Typ I aus anderen Quellen, wie beispielsweise Schweine-oder Ratten, sind in 32,33 gegeben. Die Volumina der eingesetzten Lösungen nicht verändern, da dies die ultimative Kollagen-Konzentration von 1,67 mg / ml des Gitters verändern. Eine höhere oder niedrigere Kollagenkonzentration einen Einfluss auf die Dichte der Collagenfasern und dem durchschnittlichen Abstand zwischen ihnen gleichzeitig mit den Zellen Zugverhalten 34. </li><li> 100 l des fertigen Kollagen Suspension auf 50 ul Zellsuspension und mischen thoroughly.The endgültige Kollagensuspension (1,67 mg / ml Kollagen) ist etwas zähflüssig. Um die richtige Menge (100 ul) zu übertragen, Pipette die endgültige Kollagenlösung einmal nach oben und unten vor der Übertragung auf der Zellsuspension. Hinweis: Wenn der Kollagensuspension Zellmischung ist mit der 10x MEM / Natriumhydrogencarbonat-Lösung und der pH-Wert auf 7,5 geändert kombiniert die Kollagenfasern sofort zu polymerisieren. </li><li> Die Abschlusskollagensuspension Zelle Mix aus the Reaktionsrohre zu den Migrationskammern. Klopfen Sie leicht die Migration Kammer gleichmäßig verteilen die Kollagensuspension Zellmischung auf dem Boden der Migrationskammer (1H). Zeigen die Migrationskammern in einer aufrechten Position in einem Gestell und Inkubation für 30 min (37 ° C, 5% CO 2), um die Polymerisation der Kollagenfasern erlauben. </li><li> Beachten Sie, dass die polymerisierte Kollagengitter ist leicht trüb, aber immer noch hell lila Farbe. Füllen die Kammern mit Migrationsvollmedium oder Komplettmedium mit Ergänzungen von Interesse und versiegeln die Migration Kammer mit Paraffinwachs / Vaseline-Mix (Figuren 1I, 1J). </li></ol> 3. Aufnahme und Analyse der Zellmigration Dieser Abschnitt beschreibt die Aufnahme der Zellmigration durch Zeitraffer-Videomikroskopie und Analyse der Zellmigration durch manuelle Zellverfolgung. <ol><li> Schalten Sie das Mikroskop und den Mikroskoptisch heater. Einstellen der Temperatur auf 37 ° C. Verwenden Sie einen 10X-Objektiv. Zeigen Migrationskammer unter dem Mikroskop und konzentrieren sich etwa 50 Zellen oder mehr in das Blickfeld. </li><li> Rekordzellmigration im Zeitraffer-Modus mit einer Multi-Kamera-Videoüberwachungs-Software-Anwendung. Sparen Zellmigration Filme in einem geeigneten Format, zB &quot;AVI&quot; oder &quot;MOV&quot;. Verbinden die Zellmigration Film-Dateien auf einer Datenbank, die unterstützende Informationen, wie Zelltyp und Versuchsbedingungen. HINWEIS: Wir verzeichnen Lymphozyten und HSPCs für bis zu 2 Stunden mit einem Zeitraffer-Faktor von 1:80, was bedeutet, dass 0,75 sec im Zeitraffer gleich 1 min in Echtzeit ist. Tumorzellen sind langsam bewegenden Zellen und somit für mindestens 16 h unter Verwendung einer Zeitrafferfaktor 1 aufgezeichnet: 1,800 (0,5 sec in Zeitraffer gleich 15 min in Echtzeit). </li><li> Analyse der Zellmigration Filme mit einer geeigneten Zell Tracking-Software-Anwendung, wie ImageJ Software Plugins(Eine Übersicht findet sich in 18 angegeben). Für eine unvoreingenommene Analyse ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Zellen nach dem Zufallsprinzip, ohne das Wissen ausgewählt werden, ob die Zellen sind wandernde aktiv ist oder nicht. HINWEIS: Wir sind mit einem selbst entwickelten Software-Anwendung, um die Wege von mindestens 30 Zellen pro Experiment, indem Sie die beweglichen Zellen genau mit dem Maus-Cursor (die in den Zellkern positioniert ist) manuell zu verfolgen. Während Tracking werden die xy-Koordinaten der Zellen verfolgt automatisch in Übereinstimmung mit der verwendeten Zeitraffermodus bestimmt. Für Lymphozyten / HSPCs xy-Koordinaten bestimmt jede 0,75 sec (gleich 1 Echtzeit-min), während für die Tumorzellen xy-Koordinaten werden jeweils 0,5 sec (entspricht in Echtzeit 15 min) bestimmt. </li><li> Bestimmen Sie insgesamt 60 xy-Koordinaten pro Zelle für eine typische Zellmigration Experiment. Dies ist gleich 1 h in Echtzeit für Lymphozyten / HSPCs und 15 h in Echtzeit für die Tumorzellen. A &quot;,&quot; zeigt an, dass eine Zelle nicht zwischen tw verschobeno Zeitpunkten, wohingegen eine &quot;Zahlenwert&quot; gibt den Abstand in &quot;Pixel&quot; eine Zelle zwischen den Zeitpunkten 2 (2A) bewegt. Hinweis: Die manuelle Zellverfolgung erfordert Erfahrung. Besonders schnell wandernden Zellen sind schwer zu verfolgen und zu jeder Zelltyp weisen eine ausgeprägte Wanderverhalten, die ergänzt durch Faktoren ausgelöst werden könnten. Bei der Zellteilung bei der Spurhaltung, zufällig wählen Sie eine Tochterzelle für die Fortsetzung Verfolgung. Zellen, die aus dem Gesichtsfeld wandern oder sterben, während Tracking nicht vernachlässigt werden, sind aber für die Analyse berücksichtigt. </li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Analysieren Zelle Tracking-Daten unter Verwendung eines geeigneten Software-Anwendung, beispielsweise ein Tabellenkalkulationsprogramm. <ol><li> Analysieren Zelle Tracking-Daten, indem Sie die Zelle Tracking Rohdaten (2A), in einen selbst entworfenen Tabellenvorlage. Multiplizieren Summe der &quot;Zahlenwerte&quot;, wasdie Gesamtstrecke eine Zelle mit einem Korrekturfaktor, um in die &quot;um&quot; konvertieren &quot;Pixel&quot; migriert. </li><li> Bestimmen Sie zwei Zellmigration Parameter: Bewegungsaktivität und Zeit der aktiven Bewegung (2C, 2D) (das entspricht Migrationsrate ist). </li><li> Identifizieren Sie die Zellen, die weniger als 25 um (Schwellenwert, um die Zahl der falsch-positiven Zellen zu reduzieren) migriert haben als Nicht-Bewegen-Zellen. Ersetzen Sie &quot;Zahlenwerte&quot; dieser Zellen mit &quot;,&quot;. HINWEIS: Der Parameter &quot;Bewegungsaktivität&quot; (oder Migrationsrate) stellt den Prozentsatz der Zellen der Zellpopulation verfolgt, die zwischen zwei Zeitpunkten (2D) bewegt haben. A &quot;Zahlenwert&quot; als ein Bewegungs Zelle definiert, während &quot;&quot; ist als nicht bewegenden Zelle definiert. Der Parameter &quot;Zeit der aktiven Bewegung&quot; (aktiv) stellt den Prozentsatz der Gesamtzeit eine Zelle in re migriertnung auf den Zeitrahmen des Beobachtungszeitraums (Abbildung 2C). A &quot;numerischen Wert&quot; zeigt an, dass eine Zelle bewegt, während &quot;&quot; zeigt an, dass eine Zelle nicht bewegt hat. Dieser Parameter wird ferner verwendet, um die Anzahl der Zellen, die sich nicht bewegt hat bestimmen. </li></ol></li><li> Berechnen statistischer Signifikanz und Anzeigezelle Migrationsdaten. <ol><li> Berechnen Sie die statistische Signifikanz der mittleren Bewegungsaktivität der Zellen (Migrationsrate) unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Test. Betrachten p-Wert &lt;0,05 als signifikant. </li><li> Zeigen Sie die mittlere Bewegungsaktivität der Zellen als xy-Diagramm, Boxplot-Diagramm oder als Balkendiagramm. Anzeige Einzelzellbasis Daten wie Zeit der aktiven Bewegung oder Geschwindigkeit, als Balkendiagramm-Diagramm oder als Histogramm. HINWEIS: Wenn die gewählte Tabellenkalkulationssoftware Anwendung keine Boxplot Diagramm oder Histogramm-Diagramm-Tool enthält eine Online-Suche sollte für die Suche nach geeigneten tu durchgeführt werdentorials. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Die Fähigkeit zur Migration ist ein Markenzeichen von Tumorzellen 4. Ohne die Fähigkeit, aus dem Primärtumor zu lösen und durch die umgebende Bindegewebe Tumorzellen wandern können keine Sekundärläsionen, die die Hauptursache für Tod fast aller Krebspatienten zu beimpfen. Wegen dieser Beziehung viele Studien konzentrieren sich auf die Krebszellmigration. Das Ziel dieser Studien ist die Identifizierung neuer Zielmoleküle und die Zielwege, die effektiv blockieren Tumorzellmigration, wodurch Beeinträch...

Wie Zellfusion (für eine Übersicht siehe 1,2) Zellmigration ist ein weiteres biologisches Phänomen, das in einer Vielzahl von physiologischen Prozessen einschließlich der Embryonalentwicklung, Wundheilung und Immunreaktionen (für eine Übersicht siehe 3) beteiligt ist. Jedoch ist die Fähigkeit zur Migration auch eine Voraussetzung für die Tumorzellen zu metastasieren (für einen Überblick siehe 3,4). Die Zellmigration ist ein komplexer, noch nicht vollständig verstanden Prozess, der durch das Zusammenspiel mehrerer Signaltransduktionswege durch verschiedene Liganden (zB Cytokine, Chemokine, Wachstumsfaktoren, Hormone, extrazelluläre Matrixkomponenten)-Rezeptor (zB Rezeptor-Tyrosin-Kinasen initiiert gerichtet ist, Chemokin-Rezeptoren, Integrine) Wechselwirkungen 5 wodurch letztlich die Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts gleichzeitig mit De- und Remontage von focal adhesion Komplexe und Integrin-vermittelten Signal 6. in-vitro-und in vivo-Zellmigrationsassays analysiert haben in den vergangenen Jahrzehnten entwickelt worden, einschließlich der Boyden-Kammer / Transwell-Assay 7, Kratztest / Wundheilungs Test 8-10, dreidimensionale ( 3D) Kollagen-Matrix Migrationsassay 11 sowie Intravital Imaging / Mikroskopie (für eine Übersicht siehe 12). Jeder dieser Zellmigrationsassays hat Vor-und Nachteile, zB über Kosten und Notwendigkeit der Ausrüstung, Handhabung oder Zuverlässigkeit der gewonnenen Daten. Sowohl der Boyden-Kammer / Transwell-Assay und die Kratztest / Wundheilungstest sind einfach, preiswert und gut entwickelten Assays zur Zellmigration in vitro 7-10 messen. Der so genannten oberen Fach 7 - in der Boyden-Kammer / Transwell-Assay Zellen sind auf der Oberseite eines Einsatzes enthalten Poren (etwa 8 um Durchmesser) ausgesät. Optional könnte der Einsatz mit extrazellulären m beschichtet werdenatrix Komponenten, zB Fibronektin, Kollagen etc. nachahmen eine physiologische Umgebung. Ebenso könnte Endothelzellen auf der Oberseite des Einsatzes gehalten werden, wodurch eine endotheliale Zellbarriere 13 nachahmt. Jene Zellen, die durch die Poren in einem definierten Zeitintervall in das untere Kompartiment beherbergen, Medien und Ergänzungen, wie Wachstumsfaktoren und Chemokine durchlaufen haben, werden als Auslese verwendet, um die Zellmigration (oder Extravasation) quantifizieren. Der Kratztest / Wundheilungs Assay Zellen werden in Platten ausgesät und bis zur Konfluenz 10 gewachsen. In Abhängigkeit von den experimentellen Aufbau konnte Platten mit extrazellulären Matrixkomponenten, wie Fibronectin vorbeschichtet werden. Nach dem Erstellen eines Kratzer / durch Abkratzen der Zellmonoschicht einzelne Zellen von jeder Seite der Kratzwund / Wunde kann in die Lücke wandern, wodurch Füllen / Heil es 10. Der Abstand zwischen den beiden Seiten der Ritz / Wunden bestimmtin Abhängigkeit von der Zeit und als Auslesung der Migrationsaktivität der Zellen 10 verwendet. Jedoch zwischen Zellproliferation und Zellmigration zu unterscheiden (die auch bei der Abfüllung / Heilung der Kratzer / Wunde führen kann), wird empfohlen, den Test mit Zeitraffer-Videomikroskopie und Einzelzellverfolgung 10 zu kombinieren. Jedoch sowohl die Boyden-Kammer / Transwell-Assay und Kratztest / Wundheilungs Assay, sind eher unvollkommen über physiologische artigen zellulären Umgebung. In der Boyden-Kammer / Transwell-Testzellen haben, um durch eine Kunststoffporen wandern, während der Kratztest / Wundheilungs Assay Zellen werden auf einer zweidimensionalen vorbeschichtete Kunststoff-Platte ausgesät. Ebenso ist es allgemein bekannt, dass das Migrationsverhalten unterscheidet sich deutlich zwischen einer zweidimensionalen und 3D Umgebung 3. Zum Beispiel dreidimensionale Matrix Verwachsungen von Fibroblasten unterscheiden Brenn und fibrilläre Adhäsionen gekennzeichnet, daß auf beidendimensionalen Substraten in ihrem Inhalt und α5β1 avb3 Integrine, Paxillin, anderen Zytoskelett-Komponenten und Tyrosin-Phosphorylierung von Focal Adhesion Kinase 14. Ebenso angezeigt Zellen innerhalb einer 3D-Umgebung eingebettet auch ein verändertes Zugverhalten 15. Somit Zellmigration genauer analysieren Migrationsassay wird empfohlen ermöglicht die Migration der einzelnen Zellen in einem 3D-physiologische oder physiologisch-ähnliche Umgebung zu messen. Intravital Imaging / Mikroskopie ist die Gold-Standard für die Messung der Zellmigration in einer 3D-physiologischen Kontext. Dies gilt nicht nur gehören extrazelluläre Matrix-Zell-Wechselwirkungen, sondern auch die Interaktionen zwischen verschiedenen Zelltypen, wie beispielsweise Tumorzellen und Endothelzellen während Extravasation 16 oder Lymphozyten-innerhalb des Lymphknotens 17, welche bis zum heutigen Tag ist möglich durch verbesserte Fluoreszenzmikroskopietechniken, wie beispielsweise 2-PhotonenKonfokale Laser-Scanning-Mikroskopie wird die Verwendung von lebensFluoreszenzFarbstoffe und transgenen Mausstämme, die fluoreszierende Proteine ​​Derivate 12,16,17. Zusätzlich könnten Intravital Imaging / Mikroskopie mit manuellen und automatisierten Zellverfolgung 18 kombiniert werden. Wegen der Notwendigkeit einer 2-Photonen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie sowie Tiere (und entsprechende transgene Tiermodelle) intravitalen Imaging / Mikroskopie ist jedoch ein recht kostenintensiven Technik. Um die Einschränkungen der Boyden-Kammer / Transwell-Assay und der Kratztest / Wundheilungs Assay zu überwinden und die Migration von verschiedenen Zelltypen innerhalb einer 3D-Umgebung die 3D-Kollagen-Matrix-Migration-Assay wurde entwickelt 11,19 analysieren. Dadurch wandern Zellen in einer 3D Kollagenfasernetzwerk, das mehrere ähnelt der Situation in vivo eingebettet. Gemeinsam, durch Zeitraffer-Videomikroskopie echten Zellmigration gemessen werden, wodurch die BestimNation von mehreren Migrationsparameter sowie deren Veränderungen in Reaktion auf pro-Migrationsfaktoren oder Inhibitoren. Verschiedene Zelltypen können unter Verwendung dieser Technik, einschließlich Lymphozyten und Leukozyten 11,20, hämatopoetische Stammzellen / Vorläuferzellen 21-24, und Tumorzellen 5,25-29 analysiert werden. Neben den einzelnen Zellen auch Cluster Zelle oder Sphäroiden konnte innerhalb der Kollagenmatrix gleichzeitig mit Analyse der Auswanderung von Einzelzellen aus dem Zellverband / Sphäroid in die Kollagen eingebettet Gitter 30,31 werden. Dieses Protokoll bietet einen Überblick über eine einfache, aber leistungsfähige Technik, um das Migrationsverhalten von verschiedenen Zelltypen innerhalb einer 3D-Umgebung zu analysieren - ein in vitro-Verfahren ergibt in den Ergebnissen, die in der Nähe der in vivo Situation.

<table><tbody><tr><td>Leica DM IL inverted microscope</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope stage heater</td><td>Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JVC C1431 video camera</td><td>JVC, Bad Vilbel, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axis 241Q video server</td><td>Axis communication GmbH, Ismaning, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mac G5 Computer</td><td>Apple Macintosh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMac</td><td>Apple Macintosh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FileMaker Pro</td><td>FileMaker GmbH, Unterschlei&amp;szlig;heim, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multi-camera video surveillance software(Security Spy)</td><td>Bensoftware, London, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Runtime Revolution Media 2.9.0</td><td>RunRev Ltd., Edinburgh, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Applichem GmbH, Darmstadt, Germany</td><td>A4264</td><td></td></tr><tr><td>Petroleum jelly</td><td>local drug store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purecol (liquid collagen)</td><td>Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands</td><td></td><td>contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)</td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>M0275</td><td></td></tr><tr><td>7.5% sodium bicarbonate solution</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>U73122</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td><td>662035</td><td>dissolve first in CHCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;; reconstitute in DMSO just prior to use</td></tr></tbody></table>

analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix

Die Fähigkeit zur Migration ist ein Markenzeichen von verschiedenen Zelltypen spielt eine entscheidende Rolle bei verschiedenen physiologischen Prozessen, einschließlich der embryonalen Entwicklung, Wundheilung, und Immunantworten. Allerdings ist die Zellmigration auch ein wichtiger Mechanismus in der Krebs Aktivierung dieser Krebszellen aus dem Primärtumor lösen metastasiertem beginnen die Verbreitung. In den letzten Jahren wurden verschiedene Zellmigrationsassays wurden entwickelt, um das Migrationsverhalten der verschiedenen Zelltypen zu analysieren. Weil das Bewegungsverhalten von Zellen unterscheidet sich deutlich zwischen einem zweidimensionalen (2D) und dreidimensionale (3D) Umgebung angenommen werden kann, dass die Analyse der Migration von Zellen, die in einer 3D-Umgebung eingebettet wäre eine signifikante Zellmigration ergeben werden in Daten. Der Vorteil der beschriebenen 3D Kollagenmatrix-Migrationstest ist, dass Zellen in einer physiologischen 3D-Netzwerk von Kollagenfasern, die die Hauptkomponente der extrazellulären Matrix. DurchZeitraffer-Videomikroskopie echten Zellmigration wird gemessen, die die Bestimmung von mehreren Parametern Migration sowie deren Veränderungen in Reaktion auf pro-Migrationsfaktoren oder Inhibitoren. Verschiedene Zelltypen können unter Verwendung dieser Technik, einschließlich Lymphozyten / Leukozyten, Stammzellen und Tumorzellen untersucht werden. Ebenso könnte auch Zellhaufen oder Sphäroiden innerhalb der Kollagenmatrix gleichzeitig mit Analyse der Abwanderung von Einzelzellen aus dem Zellverband / Sphäroid in die Kollagengitter eingebettet werden. Wir schließen daraus, dass die 3D-Kollagen-Matrix-Migrationstest ist ein vielseitiges Verfahren, um die Migration von Zellen in einem physiologischen artigen 3D-Umgebung zu analysieren.

Das verwendete 3D-Kollagen-Matrix kombiniert mit Migrationsassay Zeitraffer-Video-Mikroskopie und computergestützte Zellverfolgung erlaubt die Bestimmung verschiedener Parameter einschließlich Zellmigration sowohl populationsbasierte Parameter (zB bedeuten, Bewegungsaktivität) und Einzelzellbasis Parameter (zB Zeit der aktiven Bewegung, Geschwindigkeit, Entfernung migriert). Ein Beispiel der erhaltenen Zellverfolgungsdatensätze, Datenverarbeitung und Datendarstellung in Figur 2 wiedergegebe...

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Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Die Zellmigration ist ein biologisches Phänomen, das in einer Vielzahl von physiologischen beteiligt ist, wie der Wundheilung und Immunreaktionen und pathophysiologischen Prozessen, wie Krebs. Die 3D-Kollagen-Matrix Migrationstest ist ein vielseitiges Werkzeug, um die Migrationseigenschaften der verschiedenen Zelltypen innerhalb in einer 3D-physiologischen Umgebung wie zu analysieren.

Analyse der Zellmigration in eine dreidimensionale Kollagenmatrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.6K Aufrufe.  Witten/Herdecke University.  Die Zellmigration ist ein biologisches Phänomen, das in einer Vielzahl von physiologischen beteiligt ist, wie der Wundheilung und Immunreaktionen und pathophysiologischen Prozessen, wie Krebs. Die 3D-Kollagen-Matrix Migrationstest ist ein vielseitiges Werkzeug, um die Migrationseigenschaften der verschiedenen Zelltypen innerhalb in einer 3D-physiologischen Umgebung wie zu analysieren. 

Serie: Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotypische Collagen I Assay: A Temperguss Platform to Cell Verhalten in 3-Dimensional Kontext beurteilen

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Forschung

Biotechnik

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Live-Cell-Imaging von wandernden Zellen mit dem Ausdruck Fluoreszenz-markierten Proteinen in einer dreidimensionalen Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

Studium der Zellmigration in Microfabricated Kanäle

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration in more appropriate 3D environments, which better resemble the dimensionality of the physiological processes in question. Migratory cells can substantially differ in their morphology and mode of migration depending on whether they are moving on 2D or 3D substrates. Due to technical difficulties and incompatibilities with most standard protocols, structural and functional analysis of cells embedded within 3D matrices still remains uncommon. This article describes methods for preparation and imaging of 3D cancer cell cultures, either as single cells or spheroids. As an appropriate ECM substrate for cancer cell migration, we use nonpepsinized rat tail collagen I polymerized at room-temperature and fluorescently labeled to facilitate visualization using standard confocal microscopes. This work also includes a protocol for 3D immunofluorescent labeling of endogenous cell cytoskeleton. Using these protocols we hope to contribute to a better description of the molecular composition, localization, and functions of cellular structures in 3D.

This article presents a method to fluorescently label collagen that can be further used for both fix and live imaging of 3D cell cultures. We also provide an optimized protocol to visualize endogenous cytoskeletal proteins of cells cultured in 3D environments.

Enthüllung des Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

Medizin

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

Concentric Gel-System, um die biophysikalische Rolle der Matrix Mikromilieu auf 3D-Zellmigration Studieren

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Gradient Diffusionssystem, um Chemotaxis in einem 3D-Kollagen-Matrix Untersuchen

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Herstellung von 3D-Kollagen-Gel und Mikrokanäle für das Studium der 3D-Interaktionen<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor cells have to cross anatomical barriers to invade and migrate through the surrounding tissue in order to reach blood or lymphatic vessels. This requires the interaction between cells and the extracellular matrix (ECM). At the cellular level, many cells, including the majority of cancer cells, are able to form invadosomes, which are F-actin-based structures capable of degrading ECM. Invadosomes are protrusive actin structures that recruit and activate matrix metalloproteinases (MMPs). The molecular composition, density, organization, and stiffness of the ECM are crucial in regulating invadosome formation and activation. In vitro, a gelatin assay is the standard assay used to observe and quantify invadosome degradation activity. However, gelatin, which is denatured collagen I, is not a physiological matrix element. A novel assay using type I collagen fibrils was developed and used to demonstrate that this physiological matrix is a potent inducer of invadosomes. Invadosomes that form along the collagen fibrils are known as linear invadosomes due to their linear organization on the fibers. Moreover, molecular analysis of linear invadosomes showed that the discoidin domain receptor 1 (DDR1) is the receptor involved in their formation. These data clearly demonstrate the importance of using a physiologically relevant matrix in order to understand the complex interactions between cells and the ECM.

This protocol describes how to prepare a 2D mixed matrix, consisting of gelatin and collagen I, and a 3D collagen I plug to study linear invadosomes. These protocols allow for the study of linear invadosome formation, matrix degradation activity, and the invasion capabilities of primary cells and cancer cell lines.

2D- und 3D-Matrizen zur Untersuchung der linearen Invadosomenbildung und -aktivität

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

Zellwanderung in dreidimensionales In Vitro Charakterisierung Wunde Umgebungen

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Quantifying Three-Dimensional Cell Migration Within and Into Granular Hydrogel Biomaterials

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for tissue integration. This article introduces two novel approaches for quantifying cell migration within and into granular hydrogels, highlighting the distinct applications of these scaffolds. First, a cell monolayer interface assay that simulates tissue growth into granular hydrogels for integration purposes is presented. Second, a spheroid-based assay is described, designed to track cell movement within the hydrogel matrix, specifically suited for applications involving cell delivery. Both methods enable precise and controlled measurements of cell migration, providing a comprehensive toolkit for researchers utilizing granular hydrogel scaffolds. The motivation for these methods stems from the need for tailored control over cell migration within the scaffold to align with specific applications. By optimizing and standardizing these quantification techniques, researchers can iteratively refine granular hydrogel properties, ensuring their effectiveness in diverse regenerative medicine contexts. This robust set of quantitative tools offers new opportunities to enhance granular hydrogel scaffolds, advancing their use in both cell delivery and tissue integration applications.

A protocol for the quantitative evaluation of 3D cell migration within and into the interface of granular hydrogels is presented here.

Quantifizierung der dreidimensionalen Zellmigration innerhalb und in granuläre Hydrogel-Biomaterialien

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for ...