Unser Protokoll ist von Bedeutung, da es die Entstehung von Krankheiten in Hydrogelen ermöglicht, die der Natur des Knorpelgewebes sehr ähnlich sind. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, Krankheiten in Hydrogelen mit offensichtlicher biologischer Aktivität in der räumlichen Struktur, geringer Immunogenität und biologischer industrieller Funktion hervorzurufen. Zu Beginn schneidest du den gesammelten Knorpel mit einem Skalpell in ein bis zwei Kubikmillimeter große Stücke.
In einem 50-Millimeter-Zentrifugenröhrchen werden 20 Gramm des gehackten Knorpels in 20 Milliliter hypotonen Trishydrochlorid-Puffer getaucht. Stellen Sie das Rohr für drei Stunden bei 80 Grad Celsius und dann für drei Stunden bei 37 Grad Celsius in den Ofen. Das Zentrifugenröhrchen 30 Sekunden lang mit 1000 U/min vortexen.
Anschließend wird der dezellularisierte Knorpel mit einem Kunststoffsieb auf einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen filtriert. Waschen Sie den Knorpel dreimal mit sterilem PBS, bevor Sie ihn sammeln. Geben Sie 10 Milliliter Trypsinlösung in den gesammelten Knorpel und inkubieren Sie ihn 24 Stunden lang auf einem Schüttler bei 37 Grad Celsius, wobei das Trypsin alle vier Stunden ausgetauscht wird.
Nach dem Filtern der Suspension wird der trypsinisierte Knorpel mit hypertonem Puffer gewaschen. Sobald der Knorpel erhalten ist, fügen Sie 10 Milliliter Nukleaselösung hinzu und legen Sie sie vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius auf einen Schüttler. Nach dem Waschen mit sterilem PBS wird hypertone Trishydrochloridlösung in den Knorpel gegeben und wie gezeigt auf den Schüttler gelegt.
Nach dem Waschen mit sterilem PBS wird das Gewebe 24 Stunden lang in 1%Triton X-100-Lösung getaucht. Nach dem Entfernen des Triton X-100 spülen Sie den dezellularisierten Knorpel drei Tage lang mit destilliertem Wasser ab und wechseln das Wasser alle 12 Stunden. Geben Sie nach drei Tagen Peressigsäurelösung in den Knorpel und weichen Sie ihn vier Stunden lang ein.
Nach dem Waschen mit PBS sammeln Sie den Knorpel mit einem Plastiksieb, wie zuvor gezeigt. Bereiten Sie mit flüssigem Stickstoff dezellularisiertes Knorpelpulver zu. Geben Sie 80 Milliliter 0,5 molare Essigsäure und 20 Milligramm Pepsin in zwei Gramm Knorpelpulver und verdauen Sie die Mischung 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.
Nach dem Aufschluss zentrifugieren Sie die Suspension 10 Minuten lang bei 400 G und sammeln den Überstand, der jetzt als DC-ECM-Lösung bezeichnet wird Zur Lagerung der DC-ECM-Lösung geben Sie einen Milliliter der Lösung in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte und geben Sie sie in einen Gefriertrockner. Sobald die Lösung gefriergetrocknet ist, geben Sie sie in ein Zentrifugenröhrchen. Um ein Hydrogel zu bilden, lösen Sie 20 Milligramm gefriergetrocknete DC-ECM-Lösung in einem Milliliter sterilem destilliertem Wasser auf.
Nach dem Wirbel ein Milligramm Vitamin B2 in die DC-ECM-Lösung geben. Bestrahlen Sie es nach der Inkubation drei Minuten lang mit UV-Licht. Puffer GTL und Proteinase K zu 20 Milligramm DC-ECM-Knorpelpulver geben und gründlich mit Vortex-Oszillation mischen.
Für eine vollständige Knorpelauflösung inkubieren Sie die Mischung vier Stunden lang bei 56 Grad Celsius. Nach dem Wirbeln 200 Mikroliter Puffer GTL gefolgt von wasserfreiem Ethanol hinzufügen. Nach dem Wirbeln zentrifugiert man die Probe bei 6000 G für eine Minute bei vier Grad Celsius.
Sammeln und quantifizieren Sie dann die DNA, wie im Manuskript beschrieben. Für die Analyse von Kollagen werden fünf Milligramm DC-ECM-Pulver in Salzsäure bei 100 Grad Celsius für 20 Minuten angesäuert. Anschließend neutralisieren Sie es mit fünf Millilitern sechsmoliger Natronlauge.
Berechnen Sie den Hydroxyprolingehalt der neutralisierten Probe unter Verwendung der Absorption bei 570 Nanometern gegenüber dem Hydroxyprolinstandard. Nach dem Mischen werden 500 Mikroliter Reagenz A zu 200 Milligramm DC-ECM-Pulver gegeben. Inkubieren Sie die Probe 16 Stunden lang bei vier Grad Celsius.
Nach der Zentrifugation werden 50 Mikroliter Probenlösung entnommen und 50 Mikroliter Reagenz B hinzugefügt, gefolgt von Reagenz C. Nach 10-minütiger Inkubation der Probe 750 Mikroliter Reagenz D zugeben und 30 Minuten lang im Dunkeln inkubieren. Nach der Zentrifugation einen Mikroliter Reagenz E in das Pellet geben und vor dem Zentrifugieren gut mischen. Dissoziieren Sie dann die Probe vor der Messung des GAG-Gehalts.
Im präparierten DC-ECM-Knorpel wurde der DNA-Gehalt signifikant eliminiert. Der Kollagen- und GAG-Gehalt blieb jedoch im Vergleich zum nativen Knorpel erhalten. Die REM- und TEM-Analyse demonstrierte die Ultrastruktur des präparierten DC-ECM.
Das vorbereitete Hydrogel in der umgekehrten Tube floss nicht nach unten, wodurch eine Gelierung nachgewiesen wurde. Darüber hinaus reduzierte die Zugabe von Vitamin B2 im Vergleich zur reinen DC-ECM-Lösung die Gelierzeit aufgrund der induzierten Vernetzung während der DC-ECM-Hydrogelbildung. Die DC-ECM-Hydrogelviskosität war höher als die Viskosität der Lösung, und erhöhte Scherraten verringerten die Viskosität der Lösung.
Darüber hinaus deutete der hohe Speichermodul der DC-ECM-Lösung und des Hydrogels darauf hin, dass beide eher gel- als flüssige Eigenschaften aufwiesen. Die REM-Analyse zeigte, dass die Porengröße der DC-ECM-Lösung in Hydrogelform nach Vernetzung und Gefriertrocknung signifikant verringert war. Das Protokoll beinhaltet eine Kombination aus physikalischer und chemischer Störung und enzymatischer Verdauung, um zelluläres Material zu entfernen und gleichzeitig die Struktur und die Konversation der EZM zu erhalten.
