Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Biomaterialien zu beantworten, wie z. B. wie Zellmatrix-Wechselwirkungen Sulfat beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie das erste Material erzeugt, das die nativen biochemischen Mikroumgebungen des Nierenkortex genau widerspiegelt. Eine Gewebekulturhaube mit einem Unterpolster aussanstrecken.
Legen Sie einen Ein-Liter-Becher mit Rührstab, eine 150 Millimeter sterile Gewebekulturschale und die gesamte Niere in die Kapuze. Füllen Sie den Becher mit 500 Millilitern 1%SDS-Lösung. Legen Sie die Niere in die sterile Gewebekulturschale.
Entfernen Sie alle Perirenalfett durch leichte Rasur um die Nierenkapsel mit einem Skalpell. Dann machen Sie einen flachen Einschnitt von acht bis zehn Zentimetern über das obere Ende der Niere, um die Nierenkapsel aufzubrechen, ohne das darunter liegende Kortexgewebe zu beschädigen. Verwenden Sie zwei Hämostatklemmen, um die Nierenkapsel zu entfernen, indem Sie sie vom Kortexgewebe abziehen.
Bisect die Niere entlang der koronalen Ebene, indem Sie das Skalpell entlang der seitlichen Seite der Niere. Isolieren Sie Daskortegewebe aus beiden Hälften, indem Sie die Medullarregion mit dem Skalpell ausschnitzen. Dann würfeln Sie das Kortexgewebe in 0,5 Zentimeter gewürfelte Stücke und entfernen Sie alle großen, sichtbaren Gefäße.
Um die extrazelluläre Matrix aus der Niere zu isolieren, legen Sie das gewürfelte Kortexgewebe in das Becherglas, das SDS-Lösung enthält. Bedecken Sie den Becher mit autoklavierter Aluminiumfolie und legen Sie ihn auf eine Rührplatte bei ca. 400 RPM, außerhalb der Gewebekulturhaube. Nach 24 Stunden Rühren, bringen Sie den Becher in eine Gewebekultur Haube.
Fügen Sie ein 40 Mikron steriles Zellsieb aus Nylongewebe hinzu. Und dann füllen Sie einen separaten 1000 Milliliter Becher mit 200 Milliliter Bleichmittel, und legen Sie es in die Gewebekultur Haube. Entsorgen Sie die SDS-Lösung durch das Zellsieb in das Bleichbecherglas.
Pipet jede verbleibende SDS-Lösung heraus, bis nur dezellularisiertes Gewebe und das Zellsieb im Becher verbleiben. Lassen Sie das Zellsieb im Becher und fügen Sie 500 Milliliter frische SDS-Lösung hinzu. Bedecken Sie den Becher mit der gleichen Aluminiumfolie und legen Sie auf eine Rührplatte mit der gleichen Geschwindigkeit wie zuvor.
Nach der Dezellularisierung und dem Waschen, übertragen Sie das dezellularisierte Gewebe, von diesem Zeitpunkt an als Nieren-ECM bezeichnet, in ein 30 Milliliter selbststehendekonisches Rohr. Und füllen Sie es mit Zellkultur-Grade-Wasser, bis das gesamte Gewebe untergetaucht ist. Verwenden Sie zunächst einen Gewebehomogenisator, um das Nieren-ECM im konischen Rohr für zwei Minuten zu homogenisieren, bis eine undurchsichtige Lösung ohne sichtbare ECM-Stücke erhalten ist.
Dann tauchen Sie die konische Röhre, die die Niere ECM enthält, in flüssigen Stickstoff, bis das Kochen um die Röhre herum nicht mehr fortbesteht. Bewahren Sie die Niere ECM bei minus vier Grad Celsius über Nacht auf. Um das gefrorene dezellularisierte Gewebe zu lyophilisieren, lockern Sie die konische Rohrkappe leicht, um einen Gasaustausch zu ermöglichen, und legen Sie das Rohr in eine Lyophilisierungsmaschine.
Lyophilisieren Sie die Niere ECM für drei Tage, oder bis es einem feinen, weißen Pulver ähnelt. Um das Gel chemisch zu verdauen und zu löslich, fügen Sie sorgfältig gewogenes Schweinegaspepsin und 0,01 normale Salzsäure zu einem Scintillations-Abstrich hinzu, der einen Rührstab enthält. Bei ca. 500 RPM umrühren, bis sich das gesamte Pepsin aufgelöst hat.
Dann übertragen Sie die lyophilisierte Niere ECM auf die Szintillation abscheulich und lassen Sie die Lösung auf einer Rührplatte bei etwa 500 RPM für drei Tage, um die Vorrat Niere ECM Hydrogel zu machen. In einer Gewebekulturhaube, Pipetten die erforderlichen Volumen von Zellkultur-Medien, eine normale Natriumhydroxid und M199 Ergänzung, in eine sterile 30 Milliliter selbststehende konische Röhre. Mischen Sie die neutralisierende Reagenzlösung mit einem Mikrospachtel.
Verwenden Sie eine sterile Ein-Milliliter-Spritze, um das entsprechende Volumen des ECM-Hydrogels auf die neutralisierende Reagenzlösung zu übertragen. Verwenden Sie einen Mikrospachtel, um die Lösung sanft zu mischen, bis eine homogene Hydrogellösung erhalten ist. Vermeiden Sie das Einführen von Luftblasen, indem Sie langsam und sanft rühren.
Um Zellen in die Niere ECM Hydrogel zu integrieren, resuspendieren Sie dreihunderttausend Zellen in 10 Mikroliter Medium für jedes Hydrogel. Pipetten Sie 10 Mikroliter Zellsuspension in das endgültige Nieren-ECM-Gel. Rühren Sie die Lösung mit einem Mikrospachtel, bis die Zellen gleichmäßig verteilt sind.
Verwenden Sie eine 1 Milliliter Spritze, um das gewünschte Zellkulturgerät mit dem Nieren-ECM-Hydrogel zu füllen. Lassen Sie das Gel eine Stunde lang auf 37 Grad Celsius einstellen, bevor Sie die Zellen auf das Nieren-ECM im Zellkulturgerät übertragen oder plattieren. Die Analyse des dezellularisierten Kortexgewebes durch Massenspektrometrie ergab das Vorhandensein von Proteinen, die mit der Basilikumlamina assoziiert sind, wobei Kollagen-IV und Kollagen-I am stärksten vertreten sind.
Kollagen-IV-, A1- und A2-Ketten, die in allen Kellermembranen allgegenwärtig sind, wurden konserviert. Kollagen-IV-, A3- und A5-Ketten, die nur in Kellermembranen des Glomerulus vorhanden sind, wurden ebenfalls nachgewiesen. Häufige Isoformen von Lamininen und Kollagen-I wurden ebenfalls nachgewiesen.
Die auf Collagen-I, Nieren-ECM und einem 1:1-Gemischgel kultivierten peritubären mikrovaskulären endotheliale Endothelzellen oder HKMECs zeigten Unterschiede im Phänotyp. HKMECs kultiviert auf Collagen-I, zeigt einheitlichen CD31 Ausdruck, in rot gesehen. Während HKMECs auf den beiden Gelen kultiviert, die Nieren-ECM enthalten, zeigte reduzierte CD31-Expression in ungleichmäßigen Verteilungen.
Der Matrixtyp schien den VWF-Ausdruck nicht zu beeinflussen, der grün dargestellt ist. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, das dezellularisierte Nieren-Kortexgewebe vollständig zu homogenisieren. Darüber hinaus vermeiden Sie beim Mischen des Gels mit neutralisierenden Reagenzien das Einbringen von Luftblasen.
Mikrophysiologische Systeme ermöglichen die Untersuchung der Organfunktion in einem kontrollierten Labor. Die Schaffung solcher Systeme erfordert die Implementierung von Zellen, Matrizen und Reizen. Das hier hergestellte kECM-Hydrogel wird es uns ermöglichen, solche Systeme zu untersuchen, die die Nierenmikroumgebungen rekapitulieren.
