Dieses einfache Protokoll ermöglicht es, EVs zu kennzeichnen und sie mittels konfokaler Mikroskopie zu überwachen. Zum Beispiel könnte die EV-Bildgebung bei der Bewertung der EV-Verteilung helfen, wenn sie in Therapeutika verwendet wird. Diese Technik ermöglicht es, die EV-Migration und -Aufnahme in Knorpelexplantaten einfach und mit konfokaler Mikroskopie ohne besondere Funktion zu überwachen.
Das gleiche Protokoll kann für EVs für In-vitro- oder In-vivo-Experimente verwendet werden. Stellen Sie sicher, dass die Säulen vorher vorbereitet werden und dass das Anfangsvolumen der EVs ausreicht, um die gewünschte endgültige Partikelkonzentration zu erreichen, da während des Reinigungsschritts etwa 10% der Partikel verloren gehen. Beginnen Sie mit der Konzentration des extrazellulären Vesikels oder EV, der Probe und der Kontrolle.
Legen Sie die Proben in ein 15-Milliliter- oder 500-Mikroliter-Konzentrationsröhrchen, abhängig vom Startvolumen der EV-Probe. Zentrifugieren Sie die Röhrchen nach den Anweisungen des Herstellers, bis eine fast trockene Probe erhalten ist. Suspendieren Sie die konzentrierten EV-Proben mit 200 Mikrolitern und die Kontrollgruppe mit 100 Mikrolitern Verdünnungsmittel C erneut und übertragen Sie sie in neue 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Trennen Sie die EV-Probe in zwei Aliquots zu je 100 Mikrolitern. Markieren Sie eines der Aliquots mit Farbstoff und verwenden Sie es als Behandlung. Lassen Sie die andere unmarkiert, aber verarbeiten Sie sie wie die EV-Probe und verwenden Sie sie, um die EV-Konzentration durch Nanopartikel-Tracking-Analyse zu quantifizieren.
2x Farbstofflösung so herstellen, dass die resultierende Konzentration der PKH26-Lösung im Verdünnungsmittel C acht Mikromolar beträgt. Mischen Sie einen Mikroliter PKH26-Linker mit einem Millimol pro 125 Mikroliter Verdünnungsmittel C in der Probe. Bereiten Sie das Volumen vor, das erforderlich ist, um die Proben im Verhältnis 1:1 hinzuzufügen.
Fügen Sie 2x Farbstofflösung zu PKH-Thrombozytenlysat-abgeleiteten EVs hinzu und kontrollieren Sie Proben im Verhältnis 1: 1, um 1x Farbstoffkonzentration und vier mikromolarE PKH26-Konzentration zu erreichen. Fügen Sie der NTA-Thrombozyten-Lysat-abgeleiteten EV-Probe das gleiche Volumen PBS hinzu. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Geben Sie 5% Rinderserumalbumin-PBS-Lösung im Verhältnis 1:1 zu den Proben und stellen Sie sicher, dass das Endvolumen etwa 400 Mikroliter beträgt. Trennen Sie die markierten EVs von den ungebundenen Farbstoff- und unspezifischen Farbstoffinteraktionen mit der Säule. Entfernen Sie die Kappe von der Säule, fügen Sie 400 Mikroliter PKH-Thrombozytenlysat-abgeleitete EVs, NTA-Thrombozyten-Lysat-abgeleitete EVs hinzu oder kontrollieren und verwerfen Sie alle eluierten Flüssigkeiten.
Warten Sie, bis das Beispiel vollständig in die Spalte gelangt ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Fügen Sie 600 Mikroliter PBS hinzu und entsorgen Sie die gesamte eluierte Flüssigkeit. Warten Sie, bis der PBS die Spalte vollständig aufgerufen hat, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
Fügen Sie 600 Mikroliter PBS hinzu und sammeln Sie einen Bruchteil von 600 Mikrolitern in einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie für eine neue Spalte die Schritte zur Konzentration der Proben, die zu Beginn des Protokolls erwähnt werden. Fügen Sie der Spalte 600 Mikroliter zuvor eluierter EVs hinzu und verwerfen Sie das eluierte Volumen.
Fügen Sie dann 400 Mikroliter PBS hinzu und verwerfen Sie alle eluierten Volumina. Fügen Sie 600 Mikroliter PBS in die Säule hinzu und sammeln Sie einen Bruchteil von 600 Mikrolitern in einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie den Knorpel zweimal mit PBS und schneiden Sie ihn mit einem Biopsiestempel mit einem Durchmesser von drei Millimetern unter sterilen Bedingungen aus.
Legen Sie die Explantate in 96-Well-Kulturplatten mit DMEM-F12-Medium, ergänzt mit 1% Penicillin Streptomycin bei 37 Grad Celsius, 5% CO2 und 80% Luftfeuchtigkeit. Um ein entzündungsgetriebenes OA-Modell zu etablieren, ergänzen Sie das Zellkulturmedium mit 10 Nanogramm pro Milliliter Oncostatin M und zwei Nanogramm pro Milliliter Tumornekrosefaktor-alpha. Behandeln Sie die Explantate mit 1 mal 10 bis 9. Partikeln pro Vertiefung von PKH-Thrombozyten-Lysat-abgeleiteten EVs oder Kontrolle in Zellkulturmedium, ergänzt mit Oncostatin M und Tumornekrosefaktor-alpha.
Entfernen Sie das Medium von den 96-Well-Zellkulturplatten, die Knorpel-Explantate enthalten. Fügen Sie jedem Bohrloch 200 Mikroliter des Zellkulturmediums hinzu, wie im Manuskript beschrieben. Stoppen Sie den In-vitro-Test stündlich von null bis fünf Stunden.
Waschen Sie die Zellkulturtöpfe, die die Knorpelexplantate enthalten, zweimal mit 200 Mikrolitern PBS. Fügen Sie dem Gewebe 100 Mikroliter 4% Paraformaldehyd hinzu, um es drei Stunden lang bei vier Grad Celsius zu fixieren. Entfernen Sie die PFA, fügen Sie 100 Mikroliter PBS hinzu, lagern Sie das fixierte Gewebe bei vier Grad Celsius und verarbeiten Sie die Proben innerhalb von 48 Stunden.
Bilder, die zu verschiedenen Zeitpunkten aufgenommen wurden, zeigen, wie EVs in das Gewebe eindringen, bis sie die Chondrozyten erreichen und im Laufe der Zeit in die Chondrozyten gelangen. Die markierten EVs waren bereits nach einer Stunde Inkubation um Chondrozyten lokalisiert. Stellen Sie sicher, dass das Anfangsvolumen der EVs ausreicht, um die gewünschte endgültige Partikelkonzentration zu erreichen.
Eine weitere wichtige Sache, an die Sie sich erinnern sollten, ist, die gekennzeichneten EVs innerhalb der nächsten 24 Stunden zu verwenden. Wenn Sie es nicht innerhalb von 24 Stunden verwenden, kann eine Abnahme der Fluoreszenz auftreten. Diese Technik wird Forschern helfen, die EV-Bildgebung zu verbessern und EVs in Biologie und Therapeutik zu untersuchen.
