Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Messung der mechanischen Kontrolle der Entspannung oder der Belastungsabhängigkeit der Muskelentspannung in der kardialen Trabekula. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie sich auf die Entspannung des Herzens konzentriert. Angesichts des Mangels an Behandlungsmöglichkeiten für diastolische Erkrankungen könnte diese Technik verwendet werden, um neue Indizes und Wirkstoffziele im Zusammenhang mit der kardialen Entspannung zu identifizieren.
Diese Methode wird mit einem Nagetierherz gezeigt, kann aber bei jedem intakten Muskel angewendet werden. Dieses Verfahren wird von mir und Anita Abbo, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin in meinem Labor, demonstriert. Nehmen Sie zunächst das Herz des grob präparierten Kleintiermodells aus der Kanüle und legen Sie es in eine mit Silikonelastomer beschichtete Wiegeschale, um die Trabekelisolierung vorzubereiten.
Legen Sie dann das Herz unter ein Stereomikroskop und beleuchten Sie es. Nachdem Sie den rechtsventrikulären Ausflusstrakt lokalisiert haben, stecken Sie den linken Vorhof und die ventrikuläre Spitze an das Silikonelastomer in der Schale. Schneiden Sie mit einer langen Vannas-Schere vom rechtsventrikulären Ausflusstrakt bis zur Spitze entlang des Septums.
Als nächstes schneiden Sie vom rechtsventrikulären Ausflusstrakt zum rechten Vorhof in der Nähe der Aorta und dann durch den rechten Vorhof. Ziehen Sie mit einer Pinzette vorsichtig die rechtsventrikuläre freie Wand aus dem Ausflusstrakt heraus, ohne das Gewebe zu dehnen. Weiße, dünne Bindegewebsstränge, wenn sie gefunden werden, können durchtrennt werden, aber nicht die größeren rosa Gewebestränge, da es sich um Trabekel handeln kann.
Stecken Sie die freie Wand des rechten Ventrikeldreiecks an die Schale, um den rechten Ventrikel freizulegen. Durchsuchen Sie mit einer dünnen, geschmolzenen Glaspipette mit stumpfen Enden das freiliegende Endokard nach freistehenden Trabekeln, ohne Druck auszuüben. Vermeiden Sie die dreieckigen Papillarmuskeln und wählen Sie Trabekel mit parallelen Seiten, die sich oft in der Nähe der Basis der rechtsventrikulären freien Wand und entlang der Nasenscheidewand befinden.
Präparieren Sie das Trabekel mit einer kleinen Vannas-Schere und lassen Sie an jedem Ende des Trabekels ein einen Millimeter großes Stück Gewebe übrig, damit es befestigt werden kann. Schneiden Sie als Nächstes etwa zwei Zentimeter vom Ende einer Sieben-Milliliter-Transferpipette ab, ziehen Sie die Trabekula langsam in die Pipette und geben Sie sie in eine neue Wägeschale, die 50 % Perfusionslösung und 50 % modifizierte Tyrode-Lösung enthält. Lassen Sie den Muskel einige Minuten lang auf den Anstieg des extrazellulären Kalziums in der gemischten Lösung abgleichen.
Schalten Sie die Pumpe aus, die die Experimentierkammer mit Superfusion oder Absaugung versorgt. Bewegen Sie die Trabekel mit der Transferpipette mit großem Durchmesser in die mit der Tyrode-Lösung gefüllte Versuchskammer. Stecken Sie ein gewürfeltes Stück Gewebe am Ende des Trabekels an einen Haken am Kraftaufnehmer und stecken Sie dann den zweiten Würfel an den Motor.
Starten Sie die Superfusion neu und beginnen Sie, den Muskel zu bewegen, um die Schwellenspannung zu bestimmen. Tempo bei 20 % über der Schwellenspannung für etwa eine Stunde. Am Ende dieser Gleichgewichtsphase dehnen Sie den Muskel langsam mit der an den Motor angeschlossenen Mikrometer, bis durch Beobachtung der entwickelten Spannung eine optimale Spannungserzeugung erreicht ist.
Hören Sie auf, die Muskellänge zu erhöhen, wenn die passive diastolische Spannung schneller ansteigt als die Spitzenspannung, was darauf hinweist, dass die optimale Länge überschritten wurde. Schalten Sie die Durchlichtmikroskopbeleuchtung aus und beleuchten Sie die Trabekel mit einem Schwanenhalsstrahler in einem steilen Winkel. Nehmen Sie mit einer zuvor kalibrierten Kamera, die über die Mikroskopoptik angeschlossen ist, ein Bild der Trabekula während der Diastole in den Versuchsordner auf.
Ermitteln Sie den Mittelwert der Durchmessermessungen und konvertieren Sie den Durchmesser und die Länge von Pixeln in Millimeter mithilfe einer zuvor erhaltenen Kalibrierung. Berechnen Sie die Querschnittsfläche und die Muskellänge in Mikrometern. Erfassen Sie in der Datenerfassungssoftware Lastklemmdaten, indem Sie die Nachlast in der dap-Datei definieren, und iterieren Sie die Werte der proportionalen Verstärkung und der Integrationsparameter, indem Sie die Datei im Texteditor speichern, und drücken Sie dann in der Benutzeroberfläche auf "Experiment ausführen".
Steuern Sie das Ende der Lastklemme, indem Sie den Modus ändern. Wiederholen Sie die Erfassung, während Sie das Ende der Lastklemme von Null auf vollständig ändern und wieder auf die Ausgangslänge verlängern. Um die Länge zu erhöhen, erhöhen Sie schrittweise den Schwellenwert für das Beenden der Lastklemme von Null, bis sich der Muskel fast wieder auf seine ursprüngliche Länge verlängert.
Ändern Sie bei Bedarf die Nachlast und wiederholen Sie die Erfassung sofort. Falls gewünscht, modifizieren Sie die Vorspannung, indem Sie den Muskel dehnen oder verkürzen, oder behandeln Sie den Muskel, indem Sie der Tyrode-Lösung Verbindungen hinzufügen, aber warten Sie mindestens 20 Minuten, um sicherzustellen, dass sich die langsame Kraftreaktion stabilisiert hat und die Verbindung vollständig in den Muskel eindringt. Sobald die Datenerfassung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Trabekel und reinigen Sie das Versuchssystem.
Quantifizieren Sie die Relaxation, indem Sie sicherstellen, dass das Datenanalyseprogramm die eingespannte Schwebung analysiert und dass das Programm den Anfang der Lastklemme korrekt erfasst. Nachdem Sie alle Spuren eines bestimmten Zustands quantifiziert haben, stellen Sie die Beziehung zwischen der Relaxationsrate und der Dehnungsrate dar und begrenzen Sie die maximalen Daten auf eine physiologische Dehnungsrate von weniger als einer pro Sekunde. Schließen Sie Daten bei niedrigen Dehnungsraten aus, da die Relaxationsphase möglicherweise nicht den exponentiellen Zerfall widerspiegelt.
Ermitteln Sie die Steigung der Geraden zwischen der Relaxationsrate und der Dehnungsrate und zeichnen Sie die Steigung als Index der mechanischen Steuerung der Relaxation auf. Hier ist ein einzelner Herztrabekel dargestellt, der mit einer Schwanenhals-LED-Leuchte in einem steilen Winkel von 75 Grad von der Achse der Mikroskoplinse beleuchtet wird. Spannungszeit- und Dehnzeitkurven für die gleiche Trabekel zeigten ein isometrisches Zucken und drei Lastklemmenzuckungen bei steigenden und systolischen Dehnungsraten.
Die Dehnrate wird aus der Ableitung der Dehnung unmittelbar vor der isometrischen Relaxation berechnet. Die Daten werden in einem Diagramm der Relaxationsrate im Vergleich zur Dehnrate dargestellt, wobei die Steigung der Linie die mechanische Steuerung der Relaxation oder den MCR-Index ermöglicht. Die schwierigste Komponente in diesem Protokoll ist eine sorgfältige Isolierung der Herztrabekula.
Dieses Protokoll kann mit anderen Muskelmessungen kombiniert werden, einschließlich intrazellulärem Kalzium, Kontraktilität und Sarkomerlänge. Diese Methode wird auch verwendet, um molekulare Mechanismen zu identifizieren und die Pathophysiologie der gestörten Herzrelaxation besser zu verstehen.
