Das aktuelle Protokoll zeigt detailliert die subretinale Verabreichung der gesamten Netzhaut-Organoide in einem Großtiermodell mit dem Ziel, zelltherapeutische Ansätze für die Netzhautdegeneration zu entwickeln. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Abgabe von Organoiden direkt an das Zielgewebe, die Netzhaut, ermöglicht. Die Technik zielt darauf ab, fortgeschrittene erblindende degenerative Netzhauterkrankungen wie altersbedingte Makuladegeneration, Retinitis pigmentosa oder angeborene Leber-Amaurose zu behandeln.
Das Verfahren wird von Dr. Peterson Jones demonstriert. Verwenden Sie für die subretinale Implantation der Organoide eine Stevens-Tenotomieschere, um eine 0,5 bis 1 Zentimeter lange laterale Kanthotomie bei einer vier Monate alten, über Nacht nüchternen anästhesierten Katze durchzuführen, und legen Sie ein Barraquer-Augenlidspekulum in angemessener Größe in den Einschnitt, um die Augenlider offen zu halten, wobei ein chirurgischer Assistent die Hornhaut während des gesamten Eingriffs regelmäßig mit BSS spült. Verwenden Sie 0,5 Castroviejo Hornhautbindezangen und ein kleines Mückenhämostat, um die bulbäre Bindehaut neben dem Limbus sanft zu greifen.
Platzieren Sie zwei 6-0-Seidennähte in der Bindehaut unmittelbar neben dem Limbus in der 4- und 8-Uhr-Position, um das Auge im primären Blick zu halten und das dritte Augenlid zurückzuziehen. Klemmen Sie die Enden der Nähte mit kleinen Moskito-Hämostaten ein, um ihre Manipulation zu erleichtern, und platzieren Sie eine weitere Naht an der 12-Uhr-Position am Limbus teilweise durch die Dicke des Limbus, wobei Sie darauf achten, nicht in das Auge einzudringen. Verknoten Sie die Naht locker, schneiden Sie das Ende kurz ab und platzieren Sie eine Haltenaht in der Bindehaut unmittelbar neben dem Limbus in der 4-Uhr-Position, um das Auge und den primären Blick zu halten.
Reflektieren Sie die bulbäre Bindehaut zwischen 10 und 2 Uhr und schneiden Sie die Bindehaut mit einer Tenotomieschere zwei bis drei Millimeter vom Limbus entfernt ein. Untergraben Sie die Bindehaut und reinigen Sie die Tenon-Kapsel, um die Sklera an den Zwei- und 10-Uhr-Vitrektomiestellen drei bis fünf Millimeter vom Limbus entfernt freizulegen. Verwenden Sie Messschieber, um die Stellen für die Sklerotomie zu identifizieren, und vermeiden Sie die großen Skleragefäße, die bei der Katze hervorstechen können.
Planen Sie einen Bereich von drei Millimetern am 10-Uhr-Instrumentenanschluss für einen rechtshändigen Chirurgen, platzieren Sie 6-0- oder 7-0-Polyglactin-Kreuzmusternähte vor, ohne an den Stellen der vorgeschlagenen Sklerotomien zu binden. Sobald die Nähte angebracht sind, lassen Sie den Assistenten die 12-Uhr-Stehnähte greifen, um den Globus in Position zu halten, und verwenden Sie eine 0,12-Millimeter-Castroviejo-Pinzette, um das Gewebe neben der Sklerotomiestelle zu halten. Verwendet einen Trokar, um einen 23-Gauge-Vitrektomieanschluss durch die Sklera sowohl an der 2- als auch an der 10-Uhr-Position einzuführen, die zum Sehnerv hin abgewinkelt ist, um einen Kontakt mit der Linse zu vermeiden, und verwendet eine Bindezange, um den Spülanschluss vorsichtig zu drücken, um festzustellen, ob die Spitzen im Glaskörper sichtbar sind.
Lassen Sie den Assistenten eine Machemer-Lupenlinse auf die Hornhaut setzen, um die Visualisierung des hinteren Augenabschnitts zu ermöglichen, und einen 23-Gauge-Vitrektomie-Sondenschneider durch den Instrumentenanschluss, um eine partielle Vitrektomie durchzuführen. Führen Sie dann die Nadel einer Ein-Milliliter-Spritze mit einem Milliliter Triamcinolon-Lösung in den Instrumentenanschluss ein und injizieren Sie 250 bis 500 Mikroliter der Kristallsuspension. Wenn die Lösung verabreicht wurde, schieben Sie die Vitrektomiesonde durch den Instrumentenanschluss in die Nähe des Sehnervenkopfes, wobei der Anschluss von der Netzhautoberfläche abgewandt ist.
Verwenden Sie Hochvakuum, um das vitreale Gesicht von der Netzhaut zu lösen, führen Sie den Injektor durch den Instrumentenanschluss in Richtung der Netzhautoberfläche ein und extrudieren Sie die Kanülenspitze. Drücken Sie vorsichtig auf die Spitze der Netzhautoberfläche und lassen Sie den Assistenten einen leichten schnellen Druck auf den Spritzenkolben geben, um die Netzhautablösung zu starten, wobei der Injektionsdruck reduziert wird, um eine langsame Zunahme der Netzhautablösung zu ermöglichen, bis die gewünschte Größe erreicht ist. Verwenden Sie eine 41-Gauge-Kanüle des Injektors, um die Ablösung leicht zu vergrößern, bis die Netzhautschere eingeführt werden kann, und entfernen Sie den 10-Uhr-Skleraport.
Verwenden Sie dann ein gerades 2,850-Millimeter-Schlitzmesser, das auf den Sehnerv ausgerichtet ist, um eine Berührung der Linse zu vermeiden und die Sklerotomie an dieser Stelle zu vergrößern. Führen Sie die Retinotomie an der Blase vom Sehnerv weg durch, um eine Schädigung der retinalen Nervenfasern aus der transplantierten Region zu vermeiden und zu vermeiden, dass wichtige Netzhautgefäße durchtrennt werden, um das Risiko einer Blutung zu verringern. Um die Organoide zu implantieren, führen Sie eine mit Organoiden beladene Glaskapillare durch die vergrößerte Sklerotomie in Richtung der Retinotomiestelle ein und verwenden Sie die Spitze der Kapillare, um die Retinotomie leicht zu öffnen, um den Zugang zur subretinalen Bläschenöffnung zu ermöglichen.
Lassen Sie den Assistenten erneut langsam auf den Kolben des Injektors drücken, um die Organoide in die subretinale Blase zu injizieren. BSS sollte Organoide, die Organe und die Retinotomie aufspülen. Wenn alle Organoide abgegeben wurden, lassen Sie die Glaskapillare einige Sekunden an Ort und Stelle, bevor Sie die Kapillare langsam aus dem Auge entfernen, wobei Sie darauf achten sollten, dass keine plötzliche Flüssigkeit freigesetzt wird.
Wenn die Kapillare entfernt wurde, verschließen Sie die Sklerotomie mit der vorplatzierten Naht im Kreuzmuster. Lassen Sie den Assistenten den Infusionsanschluss entfernen, binden Sie schnell die Sklerotomienaht und verschließen Sie die Peritomie mit den Polyglactinnähten in einem einfachen, durchgehenden Muster. Schließen Sie die laterale Kanthotomie mit einer 6-0-Polyglactin-Naht und Achter-Hautnähten, um den lateralen Canthus durchzuführen, und verwenden Sie einfache unterbrochene Hautnähte, um den Rest der Wunde zu schließen.
Verabreichen Sie dann den entsprechenden postoperativen Steroid- und Antibiotika-Cocktail. Die Beladung mit retinalen Organoiden aus humanen pluripotenten Stammzellen kann in der Glaskanüle des Injektionsgeräts und während der Operation durch direkte Visualisierung bestätigt werden. Das Vorhandensein der Organoide im subretinalen Raum kann postoperativ durch ophthalmologische Untersuchung und Fundusbildgebung bestätigt werden.
Vor der Euthanasie können auch eine konfokale Scanning-Laser-Ophthalmoskopie und eine optische Kohärenztomographie-Bildgebung im Spektralbereich durchgeführt werden, um die Position der Organoide zu beurteilen. Mit diesen Techniken kann die Persistenz von retinalen Organoiden im subretinalen Raum zwischen der neuralen Netzhaut und dem retinalen Pigmentepithel des Empfängerauges nachgewiesen werden. Histologische und immunhistochemische Analysen können verwendet werden, um das Überleben der xenogenen Graphen im subretinalen Raum eines großen Auges bei einem immunsupprimierten Tier zu veranschaulichen.
Nur Fachkundige in der vitreoretinalen Chirurgie, wie z. B. ausgebildete Veterinäraugenärzte oder vitreoretinale Chirurgen, die mit den Artunterschieden des Katzenauges im Vergleich zum menschlichen Auge vertraut sind, sollten dieses Verfahren durchführen. Die in diesem Video vorgestellte Technik sollte auch auf andere Großtiermodelle anwendbar sein, die für die Übertragung vitreoretinaler Operationstechniken in die Kliniken verwendet werden.
