Diese Arbeit wurde vom National Key Research and Development Program of China (2022YFA1104600) und der Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (LQ23H160011) unterstützt.

1. Herstellung der 3D-Akustik-Montagevorrichtung
<ol><li>Beginnen Sie mit der Vorbereitung von vier 1 mm dicken PMMA-Platten durch Laserschneiden30 und kleben Sie sie dann zu einer quadratischen Kammer mit einer Innenbreite von 21 mm und einer Höhe von 10 mm zusammen.</li>
	<li>Befestigen Sie als Nächstes eine weitere 1 mm dicke PMMA-Folie am Boden der Kammer, die als Halterung für die Biotinte dient.</li>
	<li>Drei Blei-Zirkonat-Titanat-Wandler (PZT) (jeweils 20 mm lang, 10 mm breit, 0,7 mm dick und mit einer Primärresonanzfrequenz von 3 MHz, siehe Materialtabelle) werden vorsichtig an der Außenseite der drei orthogonalen Wände der Kammer angebracht. Stellen Sie sicher, dass der untere PZT-Wandler unter der Kammer zentriert ist.</li>
	<li>Löten Sie Drähte an die beiden leitenden Bereiche jedes PZT-Wandlers.</li>
	<li>Befestigen Sie das Gerät abschließend auf einem hohlen Boden, um zu verhindern, dass der untere PZT mit anderen Arbeitsplatten in Berührung kommt.</li>
</ol>2. Aufbau des akustischen Montagesystems
<ol><li>Montieren Sie das akustische Gerät zunächst auf einem Mikroskoptisch, um das Innere der Kammer aus der Vogelperspektive betrachten zu können.</li>
	<li>Positionieren Sie ein digitales Mikroskop auf der Seite des Geräts, die frei von PZT-Wandlern ist, um eine seitliche Beobachtung des Inneren der Kammer zu ermöglichen.</li>
	<li>Verbinden Sie die Drähte der drei PZT-Wandler unabhängig voneinander in Reihe mit drei Leistungsverstärkern und drei Ausgangskanälen von Funktionsgeneratoren (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Programmieren Sie die Einstellungen an den Funktionsgeneratoren für jeden PZT-Wandler und geben Sie Parameter wie sinusförmige Wellenform, Frequenz und Amplitude an.</li>
	<li>Um die Sterilisation zu gewährleisten, füllen Sie die Kammer des akustischen Geräts 5 Minuten lang mit 75%igem Alkohol, gefolgt von einer gründlichen Reinigung mit steriler PBS-Lösung. Bestrahlen Sie anschließend die Kammer mindestens 1 h lang mit UV-Licht in einer sauberen Bank.</li>
</ol>3. Zellkultur- und Ernteverfahren
<ol><li>Beginnen Sie mit der Kultivierung von C3A-Zellen, einer humanen hepatozellulären Karzinomzelllinie, in einer T25-Zellkulturflasche unter Verwendung des modifizierten Eagle-Mediums (DMEM) von Dulbecco, das mit 10 % fötalem Kälberserum und 1 % Penicillin-Streptomycin ergänzt wurde (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Wenn die C3A-Zellen eine Konfluenz von etwa 80 % erreicht haben, führen Sie die Zellpassage wie folgt durch: Zuerst wird der Boden des Kulturkolbens zweimal mit PBS gewaschen. Dann werden 2 ml 0,05%iges Trypsin-EDTA in den Zellkulturkolben gegeben und bei 37 °C inkubiert, um die Zellablösung zu erleichtern. Stoppen Sie den Trypsinisierungsprozess, indem Sie 2 ml des vollständigen Nährmediums hinzufügen.</li>
	<li>Die Zelllösung wird in ein 15-ml-Röhrchen überführt und bei 200 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, um ein Zellpellet zu erhalten.</li>
</ol>4. Herstellung der Biotinte
<ol><li>Bereiten Sie eine 6%ige (w/v) GelMA-Lösung mit 0,5 % (w/v) Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP) vor, indem Sie 0,3 g GelMA und 0,025 g LAP (siehe Materialtabelle) in 5 ml Phosphatpufferlösung (PBS) auflösen. Die Mischung 1 h im 47 °C warmen Wasserbad ziehen lassen.</li>
	<li>Vor dem Mischen mit Zellen wird die GelMA-Lösung zur Sterilisation durch einen 0,22-μm-Filter (siehe Materialtabelle) geleitet.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das oben erwähnte Zellpellet (Schritt 3.3) in Zellkulturmedium. Färben Sie ein kleines Zellvolumen mit einer 0,4%igen Trypanblaulösung und verwenden Sie dann ein sauberes Hämozytometer zur Zellzählung.</li>
	<li>Mischen Sie eine geeignete Menge C3A-Zellen, berechnet auf der Grundlage der oben erhaltenen Zelldichte, mit der sterilisierten GelMA-Lösung, um die Biotinte mit einer Zelldichte von 2 × 106 Zellen/ml herzustellen.</li>
	<li>Zur Visualisierung der zusammengesetzten Zellsphäroide werden C3A-Zellen vorgefärbt, indem sie mit 2 μM Cell Tracker (DiO-Farbstoff, siehe Materialtabelle) bei 37 °C für 20 min inkubiert werden. Anschließend werden die markierten Zellen vor Gebrauch dreimal mit frischem Zellkulturmedium gewaschen.</li>
</ol>5. Zusammenbau der Zellsphäroide mit dem akustischen Gerät
<ol><li>Pipettieren Sie mehr als 1 ml der Biotinte in die sterilisierte Kammer. Stellen Sie sicher, dass der Abstand von Angesicht zu Angesicht zwischen der Flüssigkeitsoberfläche und dem Kammerboden ein ganzzahliges Vielfaches der halben akustischen Wellenlänge ist. HINWEIS: Man kann diesen Abstand steuern, indem man die Menge der zugegebenen Biotinte anpasst. Die akustische Wellenlänge (λ) kann mit der Formel λ = c/f abgeschätzt werden, wobei c für die Schallgeschwindigkeit im Medium und f für die Frequenz des PZT-Wandlers steht.</li>
	<li>Schalten Sie den Funktionsgenerator und den Leistungsverstärker ein, um die Betätigung jedes PZT-Wandlers einzuleiten. HINWEIS: Es wird empfohlen, jeden PZT-Wandler zuerst einzeln zu betätigen, um das optimale Parallellinien-Zellmuster zu erreichen. Dies kann erreicht werden, indem für jeden PZT-Wandler ein Frequenz-Sweep mit einer Schrittweite von 0,001 MHz in der Nähe der primären Resonanzfrequenz durchgeführt wird. Anschließend werden diese optimalen Signale gleichzeitig auf alle drei PZT-Wandler angewendet, um das erwartete zelluläre 3D-Punktmuster zu erhalten. Stellen Sie vor dem Auftragen jedes Eingangssignals sicher, dass die Zellen durch leichtes Rühren gleichmäßig in der Biotinte verteilt sind.</li>
	<li>Vernetzen Sie die Biotinte mit blauem Licht (405 nm, 60 mW/cm2, 30 s), um ein 3D-Hydrogel-Gerüst zu erstellen, das die akustisch zusammengesetzten Zellaggregate einkapselt. Schalten Sie anschließend den Funktionsgenerator und die Endstufe aus.</li>
	<li>Übertragen Sie das 3D-Hydrogel-Gerüst vorsichtig aus der Kammer in eine Petrischale und schneiden Sie es mit einem sauberen Rasiermesser in kleine Stücke (z. B. 2 mm × 2 mm × 2 mm).</li>
	<li>Geben Sie Zellkulturmedium für die Kultivierung hinzu. HINWEIS: Denken Sie daran, das Nährmedium jeden Tag zu wechseln.</li>
</ol>6. Abrufen von Zellsphäroiden
<ol><li>Beginnen Sie mit der Beobachtung der Sphäroidbildung an verschiedenen Schichten der Gerüste mit einem inversen Mikroskop.</li>
	<li>Entfernen Sie nach 3 Tagen Kultur das Nährmedium und waschen Sie die Hydrogel-Gerüste zweimal gründlich mit PBS.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Gerüste mit mehr als 2 ml GelMA-Lysepuffer in einer Verdünnung von 1:200 mit Zellkulturmedium für 30 Minuten in einem Zellinkubator. Dieser Schritt zielt darauf ab, die Hydrogel-Gerüste aufzulösen.</li>
	<li>Die Lösung aus dem vorherigen Schritt wird in ein Röhrchen überführt und dann bei 200 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, um das Zellkugelpellet zu erhalten.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in frischem Nährmedium für nachgelagerte Anwendungen.</li>
</ol>7. Sphäroid-Viabilitätsanalyse
<ol><li>Beurteilen Sie die Lebensfähigkeit von Zellsphäroiden entweder innerhalb der Hydrogel-Gerüste oder in den gewonnenen Sphäroiden mit einem Lebend-/Tot-Färbekit (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Proben zu verschiedenen Kulturzeitpunkten mit 1 ml PBS-Lösung, die 1 μl Calcein-AM und 2 μl Propidiumiodid (PI) enthält, für 15 Minuten bei 37 °C.</li>
	<li>Proben innerhalb der Hydrogel-Gerüste werden zweimal direkt mit PBS gewaschen. Bei gewonnenen Sphäroiden wird bei 200 × g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert, um ein Sphäroidpellet zu erhalten, und vor der Beobachtung zweimal gewaschen.</li>
	<li>Beobachten Sie die Proben mit einem Fluoreszenzmikroskop und nehmen Sie die Fluoreszenzbilder auf.</li>
	<li>Berechnen Sie das Verhältnis der mit Calcein-AM gefärbten Fläche zur Gesamtfläche, die sowohl mit Calcein-AM als auch mit PI gefärbt ist, mit ImageJ, um die Sphäroidviabilität zu bestimmen.</li>
</ol>

Skalierbare Erzeugung von einheitlichen Zell-Sphäroiden mit Hilfe eines 3D-Akustik-Montagegeräts

<ol>
	<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+spheroids+as+a+versatile+research+platform:+formation+mechanisms,+high+throughput+production,+characterization+and+applications.">Cell spheroids as a versatile research platform: formation mechanisms, high throughput production, characterization and applications.</a> Biofabrication. 13 (3), 032002 (2021).</li><li>Lee, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+spheroids+potentiating+cell-cell+and+cell-ECM+interactions+by+self-assembly+of+stem+cell+microlayer.">Engineering spheroids potentiating cell-cell and cell-ECM interactions by self-assembly of stem cell microlayer.</a> Biomaterials. 165, 105-120 (2018).</li><li>Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. 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K., Schuchard, K., Shirwaiker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-assisted+biofabrication+and+bioprinting+of+preferentially+aligned+three-dimensional+cellular+constructs.">Ultrasound-assisted biofabrication and bioprinting of preferentially aligned three-dimensional cellular constructs.</a> Biofabrication. 11 (3), 035015 (2019).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+assembly+of+cell+spheroids+in+disposable+capillaries.">Acoustic assembly of cell spheroids in disposable capillaries.</a> Nanotechnology. 29 (50), 504006 (2018).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+hydrogel+arrays+individually+encapsulating+acoustic+formed+multicellular+aggregates+for+high+throughput+drug+testing.">On-chip hydrogel arrays individually encapsulating acoustic formed multicellular aggregates for high throughput drug testing.</a> Lab on a Chip. 20 (12), 2228-2236 (2020).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acoustofluidic+focusing+and+separation+of+rare+tumor+cells+using+transparent+lithium+niobate+transducers.">The acoustofluidic focusing and separation of rare tumor cells using transparent lithium niobate transducers.</a> Lab on a Chip. 19 (23), 3922-3930 (2019).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+acoustofluidic+fabrication+of+tumor+spheroids.">High-throughput acoustofluidic fabrication of tumor spheroids.</a> Lab on a Chip. 19 (10), 1755-1763 (2019).</li><li>Sriphutkiat, Y., Kasetsirikul, S., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+cell+spheroids+using+Standing+Surface+Acoustic+Wave+(SSAW).">Formation of cell spheroids using Standing Surface Acoustic Wave (SSAW).</a> International Journal of Bioprinting. 4 (1), 130 (2018).</li><li>Guex, A. G., Di Marzio, N., Eglin, D., Alini, M., Serra, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+waves+that+make+the+pattern:+a+review+on+acoustic+manipulation+in+biomedical+research.">The waves that make the pattern: a review on acoustic manipulation in biomedical research.</a> Materials Today Bio. 10, 100110 (2021).</li><li>Harley, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+biofabrication+techniques+towards+functional+bioprinted+heterogeneous+engineered+tissues:+A+comprehensive+review.">Advances in biofabrication techniques towards functional bioprinted heterogeneous engineered tissues: A comprehensive review.</a> Bioprinting. 23, 00147 (2021).</li><li>Yang, Y., Dejous, C., Hallil, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+and+applications+of+surface+and+bulk+acoustic+wave+devices:+a+review.">Trends and applications of surface and bulk acoustic wave devices: a review.</a> Micromachines (Basel). 14 (1), 43 (2022).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+holographic+cell+patterning+in+a+biocompatible+hydrogel).">Acoustic holographic cell patterning in a biocompatible hydrogel).</a> Advanced Materials. 32 (4), 1904181 (2020).</li><li>Miao, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fabrication+of+cell+spheroids+with+3D+acoustic+assembly+devices.">High-throughput fabrication of cell spheroids with 3D acoustic assembly devices.</a> International Journal of Bioprinting. 9 (4), 733 (2023).</li><li>Jeger-Madiot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+and+culture+of+Mesenchymal+Stem+Cell+spheroids+in+acoustic+levitation.">Self-organization and culture of Mesenchymal Stem Cell spheroids in acoustic levitation.</a> Scientific Reports. 11 (1), 8355 (2021).</li><li>Cai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustofluidic+assembly+of+3D+neurospheroids+to+model+Alzheimer's+disease.">Acoustofluidic assembly of 3D neurospheroids to model Alzheimer's disease.</a> Analyst. 145 (19), 6243-6253 (2020).</li><li>Mei, J., Zhang, N., Friend, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+surface+acoustic+wave+devices+on+lithium+niobate.">Fabrication of surface acoustic wave devices on lithium niobate.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (160), e61013 (2020).</li><li>Niculescu, A. G., Chircov, C., B&#238;rc&#259;, A. C., Grumezescu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+applications+of+microfluidic+devices:+a+review.">Fabrication and applications of microfluidic devices: a review.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2011 (2011).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die effiziente und stabile Herstellung von Zellsphäroiden mit hohem Durchsatz unter Verwendung von Technologien wie dem 3D-Akustik-Montagegerät ist vielversprechend für die Weiterentwicklung der Biomedizintechnik und des Wirkstoffscreenings 1,2,3. Dieser Ansatz vereinfacht die Massenproduktion von Zellsphäroiden durch einfache Verfahren.
Es gibt jedoch kritische Faktoren, die bei der Verwendung di...

3D-In-vitro-Kulturmodelle, die im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Kulturmodellen mehr In-vivo-ähnliche strukturelle und morphologische Eigenschaften aufweisen, wurden als vielversprechende Systeme in verschiedenen biomedizinischen Anwendungen wie Tissue Engineering, Krankheitsmodellierung und Wirkstoffscreening anerkannt 1,2,3. Als eine Art von 3D-Kulturmodell beziehen sich Zellsphäroide typischerweise auf die Zellaggregation und erzeugen 3D-sphäroidale Strukturen, die durch verbesserte Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen gekennzeichnet sind 4,5,6. Daher ist die Herstellung von Zellsphäroiden zu einem leistungsfähigen Werkzeug geworden, um verschiedene biologische Studien zu ermöglichen.
Verschiedene Techniken, einschließlich des Aufhängensvon Tropfen 7, nicht klebender Platten8 oder Mikrotitervorrichtungen9, wurden entwickelt, um Sphäroide zu erhalten. Prinzipiell erleichtern diese Methoden die Zellassemblierung, indem sie physikalische Kräfte wie die Gravitationskraft nutzen und gleichzeitig die Wechselwirkungen zwischen Zellen und Substrat minimieren. Sie sind jedoch oft arbeitsintensiv, haben eine geringe Produktivität und stellen eine Herausforderung für die Steuerung der Sphäroidgrößedar 10,11. Wichtig ist, dass die Herstellung von Sphäroiden mit der gewünschten Größe und Gleichmäßigkeit in ausreichender Menge von größter Bedeutung ist, um spezifische biologische Anwendungen zu erfüllen. Im Gegensatz zu den oben genannten Methoden haben akustische Wellen als eine Art von externer Krafttechnik 12,13,14 das Potenzial für die Massenherstellung von Zellsphäroiden mit hoher Qualität und hohem Durchsatz gezeigt, basierend auf dem Prinzip der Verbesserung der Zellaggregation durch äußere Kräfte 15,16,17,18. Im Gegensatz zu elektromagnetischen oder magnetischen Kräften sind akustische Zellmanipulationstechniken nicht-invasiv und markierungsfrei, was eine Sphäroidbildung mit ausgezeichneter Biokompatibilität ermöglicht19,20.
Üblicherweise wurden auf akustischen Wellen der stehenden Oberfläche (SAWs) und auf akustischen Massenwellen (BAWs) basierende Geräte entwickelt, um Sphäroide zu erzeugen, wobei die akustischen Knoten (ANs) verwendet werden, die durch entsprechende stehende akustische Felder21, 22, 23 erzeugt werden. Insbesondere akustische Montagevorrichtungen, die auf BAWs basieren, mit den Vorteilen einer bequemen Herstellung, einer einfachen Bedienung und einer ausgezeichneten Skalierbarkeit, haben für die Herstellung von Zellsphäroiden24,25 Aufmerksamkeit erregt. Wir haben kürzlich ein einfaches BAWs-basiertes akustisches Montagegerät entwickelt, das in der Lage ist, Sphäroide mit hohem Durchsatzzu erzeugen 26. Die vorgeschlagene Vorrichtung besteht aus einer quadratischen Polymethylmethacrylat (PMMA)-Kammer mit drei Blei-Zirkonat-Titanat-Wandlern (PZT), die jeweils in der X/Y/Z-Ebene angeordnet sind. Diese Anordnung ermöglicht die Erstellung eines 3D-Punkt-Array-Musters von schwebenden akustischen Knoten (LANs) zur Ansteuerung der Zellmontage. Im Vergleich zu zuvor berichteten BAWs- oder SAWs-basierten Vorrichtungen, die nur ein 1D- oder 2D-Array von ANs27, 28, 29 erzeugen können, ermöglicht die vorliegende Vorrichtung ein 3D-Punkt-Array von LANs für eine schnelle Zellaggregatbildung innerhalb der Gelatinemethacryloyl (GelMA)-Lösung. Anschließend reiften die Zellaggregate nach drei Tagen Kultivierung zu Sphäroiden mit hoher Viabilität innerhalb der photogehärteten GelMA-Gerüste. Schließlich konnte eine große Anzahl von Sphäroiden mit einheitlicher Größe aus den GelMA-Gerüsten für nachgelagerte Anwendungen leicht gewonnen werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22-&#956;m filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SLGSM33SS</td>
			<td>Used for GelMA solution sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm-cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td>Used for culturing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1RHD25</td>
			<td>Fluorescent cell observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiO dye</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1038</td>
			<td>Dye used to stain cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12430054</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141C</td>
			<td>Cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>Rigol</td>
			<td>DG5352</td>
			<td>For RF signal generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelMA</td>
			<td>Regenovo</td>
			<td>none</td>
			<td>Used to prepare bioink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelMA lysis buffer</td>
			<td>EFL</td>
			<td>EFL-GM-LS-001</td>
			<td>Used to dissolve GelMA scaffolds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-U</td>
			<td>Cell observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>900889</td>
			<td>Used as photoinitiator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-Dead kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C2015M</td>
			<td>Cell vability analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010002</td>
			<td>Used as buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Prevent cell culture contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power amplifer</td>
			<td>Minicircuit</td>
			<td>LCY-22+</td>
			<td>Increase the voltage amplitude of the RF signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PZT transducers</td>
			<td>Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd.</td>
			<td>PZT-41</td>
			<td>Functional units for acoustic assembly device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td>Used for culturing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Cell dissociation enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional acoustic assembly device for mass manufacturing of cell spheroids

Zellsphäroide sind vielversprechende dreidimensionale (3D) Modelle, die in vielen biologischen Bereichen breite Anwendung gefunden haben. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Herstellung von qualitativ hochwertigen Zellsphäroiden mit hohem Durchsatz unter Verwendung einer akustischen 3D-Montagevorrichtung durch manövrierfähige Verfahren dar. Die akustische Montagevorrichtung besteht aus drei Blei-Zirkonat-Titanat-Wandlern (PZT), die jeweils in der X/Y/Z-Ebene einer quadratischen Polymethylmethacrylat-Kammer (PMMA) angeordnet sind. Diese Konfiguration ermöglicht die Erzeugung eines 3D-Punkt-Array-Musters von schwebenden akustischen Knoten (LANs), wenn drei Signale angelegt werden. Dadurch können Zellen in der Gelatinemethacryloyl-Lösung (GelMA) zu den LANs getrieben werden und gleichmäßige Zellaggregate in drei Dimensionen bilden. Die GelMA-Lösung wird dann UV-photogehärtet und vernetzt, um als Gerüst zu dienen, das das Wachstum von Zellaggregaten unterstützt. Abschließend werden Massen an gereiften Sphäroiden gewonnen und durch anschließendes Auflösen der GelMA-Gerüste unter milden Bedingungen gewonnen. Das vorgeschlagene neue akustische 3D-Zellassemblierungsgerät wird die Scale-up-Herstellung von Zellsphäroiden und sogar Organoiden ermöglichen und ein großes Technologiepotenzial im biologischen Bereich bieten.

3D in vitro culture models, which provide more in vivo-like structural and morphological characteristics compared to conventional 2D culture models, have been recognized as promising systems in various biomedical applications such as tissue engineering, disease modeling, and drug screening1,2,3. As one type of 3D culture model, cell spheroids typically refer to cell aggregation, creating 3D spheroidal structures characterized by enhanced cell-cell and cell-matrix interactions4,5,6. Therefore, fabricating cell spheroids has become a powerful tool for enabling diverse biological studies.
Various techniques, including hanging drop7, non-adhesive plates8, or microwell devices9, have been developed to obtain spheroids. In principle, these methods commonly facilitate cell assembly by utilizing physical forces such as gravitational force while minimizing interactions between cells and the substrate. However, they often involve labor-intensive processes, have low productivity, and pose challenges for controlling spheroid size10,11. Importantly, the production of spheroids with the desired size and uniformity in sufficient quantity is of utmost importance to satisfy specific biological applications. In contrast to the above-mentioned methods, acoustic waves, as one type of external-force-driven technique12,13,14, have shown potential for mass manufacturing of cell spheroids with high quality and throughput, based on the principle of enhancing cell aggregation through external forces15,16,17,18. Unlike electromagnetic or magnetic forces, acoustic-based cell manipulation techniques are non-invasive and label-free, enabling spheroid formation with excellent biocompatibility19,20.
Commonly, standing surface acoustic waves (SAWs) and bulk acoustic waves (BAWs)-based devices have been developed to generate spheroids, utilizing the acoustic nodes (ANs) produced by corresponding standing acoustic fields21,22,23. Particularly, acoustic assembly devices based on BAWs, with the merits of convenient manufacture, easy operation, and excellent scalability, have gained attention for fabricating cell spheroids24,25. We have recently developed a facile BAWs-based acoustic assembly device with the ability to generate spheroids with high throughput26. The proposed device consists of a square polymethyl methacrylate (PMMA) chamber with three lead zirconate titanate (PZT) transducers arranged respectively in the X/Y/Z plane. This arrangement enables the creation of a 3D dot-array pattern of levitated acoustic nodes (LANs) for driving cell assembly. Compared to previously reported BAWs- or SAWs-based devices, which can only create a 1D or 2D array of ANs27,28,29, the present device enables a 3D dot-array of LANs for rapid cell aggregate formation within the gelatin methacryloyl (GelMA) solution. Subsequently, cell aggregates matured into spheroids with high viability within the photocured GelMA scaffolds after three days of cultivation. Finally, a large number of spheroids with uniform size were easily obtained from the GelMA scaffolds for downstream applications.

Autor im Rampenlicht: Entwicklung einer gerüstfreien akustischen Assemblierungsmethode für hochwertige 3D-Zell-Sphäroid-Kulturen 

Dreidimensionales akustisches Montagegerät für die Massenfertigung von Zellsphäroiden

3D in vitro culture models, like cell spheroids, have been widely used in the fields of tissue engineering, disease modeling, and drug screening. Our research focuses on developing and invest per engineering method to fabricate spheroids or other 3D in vitro culture models with high quality for diverse biological studies. In the current protocol, the spheroids grew within the GelMA scaffold and are retrieved at the final layback, dissolving the scaffold, causing additional procedures.We will try to acoustically assemble cell aggregates in a cultural medium to enable them to grow within spheroids without scaffold. Compared to magnetic assembly techniques, acoustic waves can directly assemble cells in a label-free manner without potential toxic effects on cells. Besides, our protocol enables cell spheroids to be assembled in a three-dimensional array, substantially increasing throughput.

In dieser Studie wurde ein akustisches 3D-Montagegerät für die Massenfertigung von Zellsphäroiden entwickelt. Die akustische Vorrichtung bestand aus einer quadratischen Kammer mit zwei PZT-Wandlern, die an der X- und Y-Ebene an der Außenfläche der Kammer angebracht waren, und einem PZT-Wandler am Boden der Kammer (Abbildung 1A, B). Drei Ausgangskanäle von zwei Funktionsgeneratoren wurden mit drei Leistungsverstärkern verbunden, um drei unabhängig voneinander sinusfö...

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Zellsphäroide gelten als ein potenzielles Modell im Bereich biologischer Anwendungen. Dieser Artikel beschreibt Protokolle zur skalierbaren Erzeugung von Zellsphäroiden unter Verwendung eines 3D-Akustik-Assemblierungsgeräts, das eine effiziente Methode für die robuste und schnelle Herstellung einheitlicher Zellsphäroide bietet.

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method ...

3D-In-vitro-Kulturmodelle, wie Zellsphäroide, sind in den Bereichen Tissue Engineering, Krankheitsmodellierung und Wirkstoffscreening weit verbreitet. Unsere Forschung konzentriert sich auf die Entwicklung und Investition von Sphäroiden oder anderen 3D-In-vitro-Kulturmodellen mit hoher Qualität für verschiedene biologische Studien. Im aktuellen Protokoll wuchsen die Sphäroide innerhalb des GelMA-Gerüsts und werden beim endgültigen Layback geborgen, wodurch sich das Gerüst auflöste, was zusätzliche Eingriffe verursachte.Wir werden versuchen, Zellaggregate in einem Kulturmedium akustisch zusammenzusetzen, damit sie in Sphäroiden ohne Gerüst wachsen können. Im Vergleich zu magnetischen Montagetechniken können akustische Wellen Zellen direkt und markierungsfrei zusammensetzen, ohne dass es zu toxischen Auswirkungen auf die Zellen kommt. Außerdem ermöglicht unser Protokoll die Zusammenstellung von Zellsphäroiden in einem dreidimensionalen Array, was den Durchsatz erheblich erhöht.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-Dimensional Acoustic Assembly Device for Mass Manufacturing of Cell Spheroids

777 Aufrufe.  Hangzhou Dianzi University. 3D-In-vitro-Kulturmodelle, wie Zellsphäroide, sind in den Bereichen Tissue Engineering, Krankheitsmodellierung und Wirkstoffscreening weit verbreitet. Unsere Forschung konzentriert sich auf die Entwicklung und Investition von Sphäroiden oder anderen 3D-In-vitro-Kulturmodellen mit hoher Qualität für verschiedene biologische Studien. Im aktuellen Protokoll wuchsen die Sphäroide innerhalb des GelMA-Gerüsts und werden beim endgültigen Layback geborgen, wodurch sich das Gerüst auflöste, w...

Serie: Autor im Rampenlicht: Entwicklung einer gerüstfreien akustischen Assemblierungsmethode für hochwertige 3D-Zell-Sphäroid-Kulturen 

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method for manufacturing high-quality and high-throughput cell spheroids using a 3D acoustic assembly device through maneuverable procedures. The acoustic assembly device consists of three lead zirconate titanate (PZT) transducers, each arranged in the X/Y/Z plane of a square polymethyl methacrylate (PMMA) chamber. This configuration enables the generation of a 3D dot-array pattern of levitated acoustic nodes (LANs) when three signals are applied. As a result, cells in the gelatin methacryloyl (GelMA) solution can be driven to the LANs, forming uniform cell aggregates in three dimensions. The GelMA solution is then UV-photocured and crosslinked to serve as a scaffold that supports the growth of cell aggregates. Finally, masses of matured spheroids are obtained and retrieved by subsequently dissolving the GelMA scaffolds under mild conditions. The proposed new 3D acoustic cell assembly device will enable the scale-up fabrication of cell spheroids, and even organoids, offering great potential technology in the biological field.

Cell spheroids have been considered one potential model in the field of biological applications. This article describes protocols for scalably generating cell spheroids using a 3D acoustic assembly device, which provides an efficient method for the robust and rapid fabrication of uniform cell spheroids.

Forschung

Biotechnik

Setting Up an Acoustic Assembly System and Cell Culture Harvesting for Generating Uniform Cell Spheroids

To begin, sterilize the chamber of the acoustic device with 75%alcohol for five minutes. Then, clean the device with sterile PBS and irradiate it with UV light for one hour. Mount the sterile acoustic device onto a microscope stage for top-view observation of the chamber's interior.Position a digital microscope on the side of the device that is free from PZT transducers, enabling side-view observation of the chamber's interior. Independently connect the wires from the three PZT transducers in series to three power amplifiers and three output channels of function generators. Program the settings on the function generators for each PCT transducer, specifying parameters such as sinusoidal waveforms, frequency, and amplitude.Culture 3CA cells in DMEM supplemented with 10%FBS and 1%penicillin streptomycin in a T25 cell culture flask. When the cells become 80%confluent, wash the culture twice with PBS. After removing the PBS, add two milliliters of 0.05%trypsin-EDTA to the flask and incubate at 37 degrees Celsius for cell detachment.Add two milliliters of complete cell culture medium into the flask to stop the trypsinization. Transfer the cell suspension to a 15-milliliter tube and centrifuge at 200 G for five minutes.

Aufbau eines akustischen Montagesystems und Zellkulturernte zur Erzeugung einheitlicher Zellsphäroide

Bioink Preparation, Acoustic Device Assembly, and Viability Analysis of Cell Spheroids

To prepare the bio ink solution mix an appropriate amount of C3A cell suspension with the sterilized gelMA solution. Prestain the C3A cell spheroids with two micromolar cell tracker solution at 37 degrees for 20 minutes. To wash the cells, first, remove the supernatin by centrifuging and then add fresh cell culture medium.Add at least two milliliters of bio ink into the sterilized acoustic device chamber. Turn on the function generator and power amplifier to initiate the actuation of each PZT transducer to generate a 3D array of cell aggregates. Crosslink the bio ink using blue light for 30 seconds to create 3D hydrogel scaffolds, encapsulating the assembled cell aggregates acoustically.Next, carefully transfer the 3D hydrogel scaffold from the chamber into a Petri dish. Cut it into small pieces using a clean razor, and then add cell culture medium into the Petri dish. Incubate the C3A cell spheroids at different culture time points in one milliliter of PBS containing one microliter of calcium am and two microliters of propidium iodide for 15 minutes at 37 degrees Celsius.Rinse the sample embedded in hydrogel scaffolds twice with PBS. For retrieved spheroids, perform centrifugation at 200 G for five minutes and wash twice with PBS. Using a fluorescence microscope, observe the spheroids and capture the images.The cell aggregates were arranged in the regular 3D dot array pattern with a green fluorescent signal. The assembled C3A gelMA aggregates gradually integrated and formed tight spheroids by day three, accompanied by an increase in spheroid diameter. The viability of the cell spheroids remained good before day three, but slightly decreased after a week of culture.The released spheroids maintained a good spherical morphology with a narrow size distribution along with desirable viability and expression of albumin.