Unser Protokoll ist von Bedeutung, da es die effiziente Produktion von homogenen Gewebesphäroiden in großem Maßstab ermöglicht, die für unsere fortschrittlichen Anwendungen in den Bereichen Tissue Engineering, Arzneimittelentwicklung und Krankheitsmodellierung von entscheidender Bedeutung sind. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Fähigkeit, schnell und kostengünstig große Mengen an einheitlichem Gewebesphäroid herzustellen, die hohe Zellviabilität und die Qualität der Sphäroide zu gewährleisten, was für unsere verschiedenen biomedizinischen Anwendungen von entscheidender Bedeutung ist. Durch die Herstellung patientenspezifischer Steroide bietet diese Technik ein physiologisch genaues Modell, das eine präzise Modellierung von Krankheiten und das Verständnis molekularer und verhaltensbezogener Mechanismen ermöglicht. einschließlich Krebs. Diese Methode kann Einblicke in die Krebsforschung, neurodegenerative Erkrankungen und das Tissue Engineering liefern und kann auf die Arzneimittelentwicklung und die personalisierte Medizin angewendet werden, um unser Verständnis verschiedener biologischer Systeme zu verbessern.
Unsere Vision-Demonstration ist von entscheidender Bedeutung, da sie komplizierte Schritte wie das Einsetzen des Geräts und das Aussäen der Zellen deutlich veranschaulicht, dazu beiträgt, häufige Fehler zu vermeiden und sicherzustellen, dass die richtige Technik ein Polster für konsistente Ergebnisse ist. Beginnen Sie damit, das Agarosepulver in ein x PBS zu geben, um 2%Agarose-Gel in einem Glasbehälter zuzubereiten. Homogenisieren Sie die Suspension mit kreisenden Bewegungen.
Stellen Sie den Glasbehälter in die Mikrowelle und stellen Sie die Zeit auf 30 Sekunden ein. Stoppen Sie die Mikrowelle alle fünf Sekunden, nehmen Sie die Glasflasche heraus und homogenisieren Sie die Lösung manuell mit kreisenden Bewegungen. Führen Sie den Erhitzungsprozess durch, bis die Lösung einen flüssigen, klaren Zustand erreicht.
Geben Sie als Nächstes sechs Milliliter der Agaroselösung in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte und warten Sie 15 Minuten oder bis die Agarose fest wird. Führen Sie dann das 3D-gedruckte Biogerät vorsichtig über die flüssige Agarose ein und warten Sie 30 Minuten oder bis sich die Agarose verfestigt. Nehmen Sie dann das Gerät vorsichtig aus der Agarose und fügen Sie zwei Milliliter DMEM-Medien hinzu.
Warten Sie 10 Minuten, bevor Sie das Medium entsorgen und durch neues DMEM ersetzen. Wiederholen Sie den Waschgang dreimal. Wenn Sie fertig sind, fügen Sie zwei Milliliter DMEM hinzu und stellen Sie die Sechs-Well-Platte für die Zellaussaat bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und 80 % Luftfeuchtigkeit.
Züchten Sie die Fibroblastenzellen der Maus in Zellkulturflaschen und halten Sie sie in einem Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius, bis eine Konfluenz von 80 % erreicht ist. Waschen Sie dann die Zellen mit einem x PBS und fügen Sie das Dissoziationsenzym hinzu. Inkubieren Sie die Zellen zwei bis fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius bei 5 % Kohlendioxid und 80 % Luftfeuchtigkeit.
Sobald die Zellen vom Zellkulturkolben gelöst sind, fügen Sie ein Wachstumsmedium hinzu, um das Zelldissoziationsenzym zu neutralisieren. Die Zellsuspension wird bei 400 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert und die Zellen gezählt. Zu 50 mal 10 hoch der Potenz von fünf Zellen, die in einem Röhrchen eingenommen werden, fügen Sie fünf Milliliter von einem x PBS hinzu.
Anschließend zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 400 g. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette, bevor Sie einen Milliliter des Zellkulturmediums hinzufügen und die Lösung homogenisieren. Entfernen Sie aus der zuvor vorbereiteten Sechs-Well-Platte zwei Milliliter Medium und geben Sie einen Milliliter der Zellsuspension in die Mitte der Agaroseform, die durch das 3D-gedruckte Biogerät gebildet wird.
Warten Sie 20 bis 30 Minuten, bis sich die Zellen in den Mikroresektionen sedimentiert haben, bevor Sie einen Milliliter Zellkulturmedium in die Vertiefung geben. Legen Sie die Sechs-Well-Platte für etwa 24 bis 48 Stunden bei 37 Grad Celsius in den Inkubator, um die Sphäroidbildung im Gewebe zu ermöglichen. Das 3D-gedruckte stempelähnliche Gerät, das aus zylindrischen Mikrostiften besteht, wurde erfolgreich im Stereolithographie-Verfahren unter Verwendung eines photohärtenden Harzes hergestellt.
Das Gerät war einfach, leicht zu sterilisieren, wiederverwendbar und für verschiedene Größen von Well-Platten und Petrischalen abstimmbar. Es wurden 750 homogene Mikroresektionen gut oder 4.716 pro Sechs-Well-Platten erzeugt. Durch das frühe Zurückziehen des Geräts aus der Platte wurde die nicht haftende Form gestört und die Mikroresektionsgeometrie verformt.
Die Zellen, die auf die nicht anhaftenden Agarosepilze ausgesät wurden, sedimentierten und bildeten nach etwa 24 Stunden die Gewebesphäroide. Diese Methode demonstrierte erfolgreich die großtechnische Produktion der Sphäroide, indem sie ihre Form, Größe und Lebensfähigkeit beibehielt und die Steroidkultur monatelang unterstützte. Das Wichtigste, woran ich denken sollte, wenn ich an dieses Verfahren denke, ist, das Gerät vorsichtig einzuführen, um Luftblasen zu vermeiden, und das Kulturmedium vorsichtig hinzuzufügen, um die Zellen nicht zu stören.
Im Anschluss an dieses Verfahren können Wirkstofftests und Genexpressionsanalysen durchgeführt werden. Beantwortung von Fragen zur Wirksamkeit von Medikamenten, zum Schmackhaftigkeit und zur genetischen Reaktion auf Behandlungen. Diese Technik wird neue Forschungen im Bereich des Tissue Engineering und der regenerativen Medizin ermöglichen, indem sie die großflächige, qualitativ hochwertige Sphäroidproduktion ermöglicht, die für den 3D-Biodruck von entscheidender Bedeutung ist, und die Zellqualität und -quantität für pharmazeutische und kosmetische Toxizitätstests verbessert.
