Diese Technik kann verwendet werden, um Zellsphäride aus einzelnen und mehreren Zelltypen mit einer Lab-on-a-CD-Plattform zu erzeugen, einem wegweisenden System für die schnelle Erzeugung von Sphäroiden. Die Technik verwendet Zentrifugalkraft, um Zellen in ausgewiesenen Mikrobrunnen abzulagern, was die sequentielle Elation mehrerer Zelltypen für die Produktion verschiedener Sphäroide ermöglicht. Für die CMS-Kulturchip-Herstellung, machen sie zuerst Polycarbonat-Formen für die obere und untere Schicht des Kulturchips durch Computer-Numerische Steuerungsbearbeitung.
Nächste Mischen PDMS-Basis und PDMS-Härtungsmittel in einem Verhältnis von 10 zu 1 für fünf Minuten, bevor Sie die Mischung in einem Trockengerät für eine Stunde, um Luftblasen zu entfernen. Gießen Sie die entgaste PDMS-Mischung in die CMS-Kultur-Chip-Formen, und legen Sie die Formen in den Trockenbau für eine weitere Stunde, um alle Luftblasen zu entfernen. Am Ende der zweiten Entgasung das Gemisch in einer Wärmekammer bei 80 Grad Celsius zwei Stunden lang aushärten, bevor die Späne in einen vakuumierten Plasmareiniger mit den zu verklebenden Oberflächen nach oben gegeben werden.
Setzen Sie die Kulturchips 30 Sekunden lang mit einer Leistung von 18 Watt dem luftunterstützten Plasma aus und kleben Sie die beiden Schichten des Chips in der Wärmekammer 30 Minuten lang bei 80 Grad Celsius, um die Haftfestigkeit zu erhöhen. Dann sterilisieren Sie den CMS-Kulturchip in einem Autoklaven bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten. Um die Zellen auf die Sphäroidbildung vorzubereiten, tauen Sie eine Ein-Milliliter-Durchstechflasche auf, die fünf bis zehn mal 10 auf die fünf von Interesse sindden Zellen in einem 36,5 Grad Celsius Wasserbad zwei Minuten lang enthält, bevor Sie den Zellen mit sanftem Mischen einen Milliliter DMEM hinzufügen.
Als nächstes fügen Sie die Zellen zu einer Petrischale mit einem Durchmesser von 150 Millimetern hinzu, die 15 Milliliter 36,5-Grad-Celsius-Medium enthält, und legen Sie die Schale 24 Stunden lang in einen Zellkultur-Inkubator. Ersetzen Sie am nächsten Tag den Überstand durch 15 Milliliter frisches DMEM, und geben Sie die Zellen an den Inkubator zurück. Um die Zellen zu lösen, erstellen Sie die Kultur mit vier Milliliter Trypsin für vier Minuten bei 36,5 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, stoppen Sie die Reaktion mit frischem Medium, wenn die Zellen von der Unterseite der Schale angehoben haben.
Um die Zellen zu kennzeichnen, erwärmen Sie einen geeigneten Zellfluoreszenzfarbstoff auf Raumtemperatur, bevor Sie 20 Mikroliter wasserfreies Dimethylsulfoxid in die Durchstechflasche geben, um eine einmillimolarige Lösung zu erhalten. Verdünnen Sie die Fluoreszenz auf eine endende Arbeitskonzentration von einem Mikromolaren in DMEM, und fügen Sie den Farbstoff mit sanftem Mischen in die zellgefederte Suspension von Interesse. Legen Sie dann die Zellen 20 Minuten lang in den Zellkultur-Inkubator.
Für die Monokultur-Sphäroidbildung, fügen Sie zuerst 2,5 Milliliter 4%Pluronic F-127 Lösung, um das Einlassloch des CMS-Kulturchips, während drehen Sie den Chip bei 500 bis 1.000 Umdrehungen pro Minute. Wenn die gesamte Lösung hinzugefügt wurde, drehen Sie den Chip mit dem CMS-System drei Minuten lang mit 4.000 Umdrehungen pro Minute. Am Ende der Rotation, inkubieren Sie den Kulturchip über Nacht bei 36,5 Grad Celsius bei 5% Kohlendioxid.
Entfernen Sie am nächsten Morgen die Pluronic-Lösung und waschen Sie den Kulturchip mit DMEM. Nach dem Trocknen des Chips für 12 Stunden auf einer sauberen Bank, fügen Sie 2,5 Milliliter des Mediums an den Einlassanschluss, und drehen Sie den Chip bei 4.000 Umdrehungen pro Minute für drei Minuten. Ersetzen Sie am Ende der Drehung 100 Mikroliter des Mediums im Einlassanschluss durch 100 Mikroliter der vorbereiteten Zellsuspension, während sich der Chip bei 500 bis 1 000 Umdrehungen pro Minute dreht.
Drehen Sie den Chip dann drei Minuten lang mit 3.000 Umdrehungen pro Minute, um die Zellen in jedem Mikrobrunnen durch Zentrifugalkraft einzufangen, bevor Sie den Chip drei Tage lang im Zellkultur-Inkubator platzieren, und erfrischen Sie das Medium, wie jeden Tag gezeigt wird. Für die Erzeugung konzentrischer Sphäroid-Kokultur fügen Sie die erste Population von Zellen in 100 Mikroliter n. Medium in den Einlassanschluss des Chips ein, während sich der Chip mit 500 bis 1.000 Umdrehungen pro Minute dreht, gefolgt von drei Minuten Rotation bei 3.000 Rotationen pro Minute. Fügen Sie am Ende der Drehung 100 Mikroliter der zweiten Zellpopulation hinzu, während sich der Chip mit 500 bis 1 000 Umdrehungen pro Minute dreht, und drehen Sie den Chip weitere drei Minuten bei 3.000 Umdrehungen pro Minute.
Wenn beide Zellvolumen injiziert wurden, legen Sie den Chip 24 Stunden lang bei 1 000 bis 2 000 Umdrehungen pro Minute in den Zellkultur-Inkubator. Für die Janus Sphäroidbildung fügen Sie 100 Mikroliter der ersten Zellpopulation hinzu, während sich der Chip mit 500 bis 1 000 Umdrehungen pro Minute dreht, gefolgt von drei Minuten bei 3.000 Umdrehungen pro Minute. Platzieren Sie den Chip am Ende der Drehung drei Stunden lang im Zellkultur-Inkubator für die Rotation bei 1 000 bis 2 000 Umdrehungen pro Minute.
Am Ende der Inkubation 100 Mikroliter der zweiten Zellpopulation hinzufügen, während sich der Chip mit 500 bis 1 000 Umdrehungen pro Minute dreht, bevor der Chip drei Minuten lang bei 3.000 Umdrehungen pro Minute gedreht wird. Platzieren Sie dann die Zellen im Zellkultur-Inkubator 24 Stunden lang bei 1 000 bis 2 000 Umdrehungen pro Minute. Für die Sandwich-Sphäroidbildung fügen Sie zunächst 100 Mikroliter der ersten Zellpopulation hinzu, während sich der Chip mit 500 bis 1 000 Umdrehungen pro Minute dreht, gefolgt von drei Minuten Drehung bei 3.000 Umdrehungen pro Minute.
Platzieren Sie den Chip am Ende der Drehung zwei Stunden lang auf einem Rotator im Zellkultur-Inkubator bei 1.000 bis 2 000 Umdrehungen pro Minute, bevor Sie 100 Mikroliter der zweiten Zellpopulation hinzufügen, während sich der Chip mit 500 bis 1 000 Umdrehungen pro Minute dreht. Drehen Sie den Chip drei Minuten lang bei 3.000 Umdrehungen, und legen Sie den Chip für eine dreistündige Inkubation mit Drehung wieder in den Inkubator. Fügen Sie dann weitere 100 Mikroliter der ersten Zellpopulation hinzu, während sich der Chip mit 500 bis 1.000 Umdrehungen pro Minute dreht, und drehen und kultiieren Sie die Zellen, wie gerade für 12 Stunden demonstriert.
Nach dem Protokoll, wie gezeigt, kann ein CMS-Kulturchip mit sechs Zentimetern Durchmesser erfolgreich hergestellt werden. Der Kanal des CMS-Kulturchips besteht aus einem Einlassanschluss sowie zentralen, slide- und microwell-Regionen. Zeitrafferbilder von zwei Arten von Zellkulturen, die in den ersten 24 Stunden der Kultur innerhalb einzelner CMS-Chips mit 2 000 Umdrehungen pro Minute aufgenommen wurden, zeigen die erfolgreiche Bildung von Sphäroiden.
Die Bildgebung der Mikrobrunnen nach drei Tagen Kultur zeigt, dass die Sphäroide eine ausgezeichnete Gleichförmigkeit und Sphärizität aufweisen. Cokultivierte Sphäroide mit konentric,Janus- und Sandwichstrukturen können ebenfalls erzeugt werden. Darüber hinaus zeigen Zellkulturen, die sieben Tage lang hoher Schwerkraft ausgesetzt sind, gefolgt von Leben/Toten-Färbung, dass die meisten Zellen die langfristige Kultur innerhalb der Chips überleben.
Die obere und untere Schicht des CMS-Kulturchips sollten sorgfältig ausgerichtet werden, wenn sie gebunden sind, da andernfalls die Anzahl der Zellen in jedem Mikrobrunnen möglicherweise nicht gleich ist. Diese Studie kann die Eintrittsbarriere für die Cokultur-Sphäroidforschung senken und kann in Kokulturstudien weit verbreitet sein, beispielsweise für das Screening neuer Medikamente von Interesse.
