Diese Untersuchung wurde vom National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) der National Institutes of Health (NIH) unter der Nummer 1R01HL149404-01A1 (BL) und dem Ruth L. Kirschstein National Research Service Award T32 HL 007936 an das Cardiovascular Research Center (JB) der University of Wisconsin-Madison unterstützt. Die Abbildungen wurden mit Biorender.com erstellt oder bearbeitet. Die statistische Analyse wurde mit der Software GraphPad Prism 10 durchgeführt.

Beurteilung der Entwicklung eines Aortenaneurysmas bei Mäusen nach einer Elastase-Behandlung

<ol>
	<li>Kent, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Abdominal+aortic+aneurysms.">Clinical practice. Abdominal aortic aneurysms.</a> New Engl J Med. 371 (22), 2101-2208 (2014).</li><li>Wanhainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Society+for+Vascular+Surgery+Guidelines+on+the+management+of+aorto-iliac+abdominal+aortic+aneurysms.">European Society for Vascular Surgery Guidelines on the management of aorto-iliac abdominal aortic aneurysms.</a> Eur J Vasc Endocasc Surg. 57 (1), 8-93 (2019).</li><li>Shimizu, K., Mitchell, R. N., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+cellular+immune+responses+in+abdominal+aortic+aneurysms.">Inflammation and cellular immune responses in abdominal aortic aneurysms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (5), 987-994 (2006).</li><li>Shen, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aortic+aneurysms+and+dissections+series.">Aortic aneurysms and dissections series.</a> ArteriosclerThromb Vasc Biol. 40 (3), e37-e46 (2020).</li><li>Stanley, J. C., Veith, F., Wakefield, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Therapy+in+Vascular+and+Endovascular+Surgery+E-Book.">Current Therapy in Vascular and Endovascular Surgery E-Book.</a> Elsevier Health Sciences. , (2014).</li><li>Morgan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+novel+mechanisms+of+abdominal+aortic+aneurysm+via+unbiased+proteomics+and+systems+biology.">Identifying novel mechanisms of abdominal aortic aneurysm via unbiased proteomics and systems biology.</a> Front Cardiovasc Med. 9, 889994 (2022).</li><li>Yin, L., Kent, E. W., Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+murine+models+of+ruptured+abdominal+aortic+aneurysm.">Progress in murine models of ruptured abdominal aortic aneurysm.</a> Front Cardiovasc Med. 9, 950018 (2022).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+chronic+advanced+stage+abdominal+aortic+aneurysm+murine+model.">A novel chronic advanced stage abdominal aortic aneurysm murine model.</a> J Vasc Surg. 66 (1), 232-242 (2017).</li><li>Berman, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+aortic+aneurysm+severity+and+growth+depend+on+topical+elastase+concentration+and+lysyl+oxidase+inhibition.">Experimental aortic aneurysm severity and growth depend on topical elastase concentration and lysyl oxidase inhibition.</a> Sci Rep. 12 (1), 99 (2022).</li><li>Deaths, percent of total deaths, and death rates for the 15 leading causes of death in 5-year age groups, by race, and sex. Centers for Disease Control and Prevention Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/nchs/nvss/mortality/lcwk1.htm">https://www.cdc.gov/nchs/nvss/mortality/lcwk1.htm</a> (2015)</li><li>Dansey, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+endovascular+and+open+repair+for+abdominal+aortic+aneurysms+in+the+United+States+from+2004+to+2015+and+implications+for+screening.">Epidemiology of endovascular and open repair for abdominal aortic aneurysms in the United States from 2004 to 2015 and implications for screening.</a> J Vasc Surg. 74 (2), 414-424 (2021).</li><li>Daugherty, A., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+abdominal+aortic+aneurysms.">Mouse models of abdominal aortic aneurysms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (3), 429-434 (2004).</li><li>Busch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+mouse+models+of+abdominal+aortic+aneurysm+to+the+translational+needs+of+vascular+surgery.">Translating mouse models of abdominal aortic aneurysm to the translational needs of vascular surgery.</a> JVS Vasc Sci. 2, 219-234 (2021).</li><li>Anidjar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase-induced+experimental+aneurysms+in+rats.">Elastase-induced experimental aneurysms in rats.</a> Circulation. 82 (3), 973-981 (1990).</li><li>Bhamidipati, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+murine+model+of+aortic+aneurysms+using+peri-adventitial+elastase.">Development of a novel murine model of aortic aneurysms using peri-adventitial elastase.</a> Surgery. 152 (2), 238-246 (2012).</li><li>Xue, C., Zhao, G., Zhao, Y., Chen, Y. E., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+abdominal+aortic+aneurysm+model+induced+by+perivascular+application+of+elastase.">Mouse abdominal aortic aneurysm model induced by perivascular application of elastase.</a> J Vis Exp. (180), e63608 (2022).</li></ol>

Die Autoren dieses Manuskripts haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Das Verständnis der komplexen Pathophysiologie der AAA ist entscheidend für die Verbesserung der Behandlung von Aortenaneurysmaerkrankungen. Während neuere Strategien aktiv entwickelt werden, um die chirurgischen Ergebnisse zu verbessern, sind AAAs in unserer alternden Gesellschaft nach wie vor weit verbreitet und Aneurysmarupturen sind nach wie vor eine der häufigsten Todesursachen in den Vereinigten Staaten10. Daher rechtfertigt der ungedeckte Bedarf an AAA-Erkennungs-, Präventions- und Behandlungsstrategien weitere grundlegende Aneurysmaforschungen11.
Tiermodelle, die die Merkmale und Verhaltensweisen menschlicher AAAs genau und effizient rekapitulieren, sind für mechanistische Studien der Aneurysma-Pathophysiologie und die Identifizierung potenzieller therapeutischer Ziele unerlässlich. Während aktuelle Tiermodelle die wichtigsten Aspekte der aneurysmatischen Veränderungen, die bei menschlichen Krankheiten auftreten, nachahmen können, repräsentiert kein einzelnes Modell die wahre Komplexität menschlicher AAAs vollständig. Derzeit sind Mäuse die am weitesten verbreitete Spezies für die AAA-Modellierung von Tieren. Forscher sollten die verschiedenen Stärken und Schwächen jedes Mausmodells für ihre jeweilige Aneurysmastudie berücksichtigen, wie sie in Übersichtsarbeiten von Daugherty et al. und Busch et al. fachmännisch beschrieben wurden12,13.
Die Verwendung von Elastase zur Induktion von AAA bei Nagetieren wurde erstmals 1990 von Anidjar et al. beschrieben14. Die Perfusion der Aorta mit porziner Pankreas-Elastase unter Verwendung einer Spritzenpumpe erzeugt eine anfängliche Dilatation zwischen etwa 50 % und 70 %, und die erweiterten Segmente weisen günstige ähnliche pathologische Merkmale menschlicher AAAs auf, wie z. B. mediale Degeneration und adventitielle Entzündung. Das klassische Perfusionsmodell ist jedoch wohl das technisch anspruchsvollste Aneurysmamodell, und die Aneurysmen, die typischerweise in der zweiten Woche gebildet werden, beginnen sich danach allmählich aufzulösen. Bhamidipati et al. zeigten dann im Jahr 2012, dass die adventielle Anwendung von Elastase auch erfolgreich ähnliche Aneurysmen induzieren kann, die in Größe15 reproduzierbarer sind. Das topische Elastase-Modell ist ein weitaus weniger anspruchsvolles Modell, das in der Aneurysmaforschung weit verbreitet ist. Weitere Methoden und Vorteile des topischen Elastasemodells werden im Methodenpapier von Xue und Kollegendiskutiert 16.
Das Elastase/BAPN-Modell der murinen AAA wurde 2017 von Lu und Kollegen entwickelt8. Die Einführung von Trinkwasser mit 0,2 % BAPN verbesserte viele der Kritikpunkte am klassischen topischen Elastase-Modell und führt nun zu Aneurysmen, die sich kontinuierlich bis zum Punkt der AAA-Ruptur ausdehnen. In ihrer Studie aus dem Jahr 2017 zeigten sie, dass Mäuse in der mit Elastase/BAPN behandelten Gruppe signifikant höhere AAA-Bildungsraten aufwiesen als in der Elastase-Gruppe (93 % vs. 65 %, P < 0,01), bei denen es sich ebenfalls um AAAs im fortgeschritteneren Stadium handelte. Über einen Zeitraum von 100 Tagen dehnten sich die AAAs in der Elastase/BAPN-Gruppe weiter auf >800 % des Ausgangsdurchmessers aus und bildeten einen intraluminalen Thrombus (53,8 %), wobei 46,2 % vor Ende des Experiments spontan rupturierten. Dieses Modell hat es Forschern ermöglicht, Faktoren zu untersuchen, die das Fortschreiten und die Stabilität des Aneurysmas im Laufe der Zeit beeinflussen können.
Berman et al. untersuchten das Elastase/BAPN-Modell weiter, indem sie die Konzentration der topischen Elastase, die Studiendauer, den Zeitpunkt der BAPN-Verabreichung und den Einfluss des Tiergeschlechts variierten9. Die Behandlung mit 5 μl höher konzentrierter Elastase (5 mg/ml oder 10 mg/ml) führte über 56 Tage zu größeren Aneurysmen als 2,5 mg/ml. Die Prävalenz der intraluminalen Thrombusbildung hing auch von der Elastasekonzentration ab, die bei 28,6 % der mit 5 mg/ml behandelten Mäusen und bei 62,5 % der mit 10 mg/ml behandelten Mäuse auftrat. Sie zeigten auch, dass das Elastase/BAPN-Modell Aneurysmen bei weiblichen Mäusen induzieren kann. Obwohl nur wenige weibliche Mäuse untersucht wurden (n=5), fanden sie heraus, dass die Aneurysmen bei weiblichen Mäusen anfälliger für Rupturen waren (2 von 5 Mäusen) und nach 56 Tagen signifikant größer waren als bei männlichen AAAs.
In diesem Artikel wollen wir eine Methode entwickeln, um eine der größten Einschränkungen der chirurgischen Modellierung zu beheben, nämlich die Variation des chirurgischen Verfahrens. Ohne einen klaren Konsens über den Grad der Dissektion und den Bereich der Aorta, der mit Elastase behandelt wird, könnten die Ergebnisse dieses Modells zwischen Tieren, Forschern und Institutionen dramatisch variieren. Wir haben zahlreiche anatomische Unterschiede zwischen Mäusen beobachtet, einschließlich der Anzahl und Größe der Lendenarterien und Venen sowie der Lage der IMA, der Abnahme der linken Gonadenvene, unter anderem, was einschränkend sein kann, wenn versucht wird, nur einen Teil oder ein bestimmtes Segment der infrarenalen Aorta zu behandeln. Hier zeigen wir, dass das zirkumferentielle Präparieren der gesamten Länge der infrarenalen Aorta von der linken Nierenarterie proximal zur Aortenbifurkation distal dazu beiträgt, trotz anatomischer Unterschiede reproduzierbare Grade der Aortenfreilegung zu erzielen und gleichzeitig den Erfolg der Aneurysma-Induktion zu erhöhen und dem Bediener klare Grenzen zu setzen. Darüber hinaus neigen die Größe und die vordere Position der IVC dazu, einen Großteil der Aorta abzudecken, was sich auf die Menge der behandelten Aorta auswirken kann, wenn sie nicht von der IVC isoliert wird. Während es notwendig ist, die retroperitoneale Faszie zu entfernen, um die Aorta freizulegen, ist es wichtig, das Bindegewebe der Adventitia nicht vollständig von der Aorta abzutrennen und eine der Medienschichten freizulegen, da dies typischerweise zu einem Bruch während der 5-minütigen Elastase-Inkubationszeit führt. Dies könnte als zusätzliche interne Kontrolle bis zum Grad der Dissektion mit diesem Modell dienen, kann jedoch bei der Einführung dieses Modells eine frustrierende Lernkurve sein. Der Bediener lernt außerdem Bereiche mit höherem Risiko kennen (Abbildung 4), die während der Operation leicht verletzt werden und zu unkontrollierbaren Blutungen führen können.
Es ist zwar wichtig, dass die Verfahrensschritte dieses Modells konsistent sind, aber die Dauer der Studie und der Zeitpunkt der Intervallsonographie können je nach Forschungsziel variieren. Die Aortendilatation beginnt unmittelbar mit der Elastase-Anwendung, doch Studien, die dieses Modell verwenden, folgen Mäusen in der Regel 28 Tage nach der Operation7, wie in diesem Beispielexperiment. Eine Verlängerung der Studiendauer sollte in Betracht gezogen werden, wenn fortgeschrittene AAAs, langfristiges Wachstum, intraluminale Thrombusbildung oder Ruptur untersucht werden.
Zusätzliche perioperative Maßnahmen, wie die Aufrechterhaltung der Körpertemperatur und des Hydratationsstatus der Tiere, können dazu beitragen, das Überleben der Tiere bei diesem invasiven Verfahren zu verbessern. Die Verwendung eines Heizkissens während der Operation und die Unterbringung in einem warmen Aufwachkäfig können helfen, Unterkühlung zu vermeiden. Kochsalzlösung sollte erwärmt werden, bevor sie zur Spülung der Bauchhöhle verwendet wird. Ein subkutaner Flüssigkeitsbolus direkt nach der Operation kann unmerkliche Flüssigkeitsverluste während der Operation ausgleichen und dem Tier helfen, während der unmittelbaren Erholungsphase eine ausreichende Flüssigkeitszufuhr aufrechtzuerhalten. Bei sorgfältiger Gewebehandhabung und einem konsequenten methodischen Ansatz kann das Elastase/BAPN-Modell von einem erfahrenen Bediener zwischen 30 min und 45 min pro Maus durchgeführt werden und zuverlässig AAA mit sehr geringen perioperativen Komplikationen produzieren.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Kombination von BAPN zusätzlich zur zirkumferentiellen Dissektion der infrarenalen Aorta vor der Elastase-Applikation große, kontinuierlich expandierende AAAs mit größeren Durchmessern und Rupturinzidenz in kürzeren Zeiträumen erzeugt. In diesem Experiment wurden AAAs bei allen männlichen (6 von 6) und weiblichen (6 von 6) Mäusen, die mit aktiver Elastase behandelt wurden, erfolgreich induziert. Eine 5-minütige Elastase-Exposition führte zu einer sofortigen Vergrößerung des Aortendurchmessers um etwa 30-40%, was hilfreich ist, um eine erfolgreiche und konsistente Elastase-Anwendung in den Behandlungsgruppen zu bestätigen. Ähnlich wie Berman et al. haben wir gezeigt, dass dieses Modell AAAs bei weiblichen Mäusen induzieren kann, die auch eine stärkere Rupturreaktion als männliche Mäuse aufweisen. Die Hälfte der weiblichen Mäuse (3 von 6) riss innerhalb von 28 Tagen, verglichen mit 0 von 6 der männlichen Mäuse, jedoch wiegen weibliche Mäuse weniger als männliche. Männliche Mäuse zeigten eine Zunahme des AAA-Durchmessers um 257 % im Vergleich zu -4 % der männlichen Kontrollen, während die überlebenden Weibchen eine Zunahme des Durchmessers um 417 % zeigten, verglichen mit -16 % der weiblichen Kontrollen. Die Aortendurchmesser unterschieden sich nach 28 Tagen nicht signifikant zwischen den überlebenden männlichen und weiblichen behandelten Mäusen, was auf die höhere Anzahl von Rupturen in der weiblichen Gruppe zurückzuführen ist. Wir spekulieren, dass die Scheinmäuse am Ende der Studie kleinere Aortendurchmesser aufweisen, da die Aorta dazu neigt, sich während der ersten Dissektion leicht zu erweitern und dann nach 28 Tagen Narbengewebe zu bilden.
Das Elastase/BAPN-Modell weist gewisse Einschränkungen auf. Die zirkumferenzielle Dissektion der Aorta erfordert feine chirurgische Fähigkeiten, trägt jedoch dazu bei, die Replizierbarkeit und den Grad der Aneurysma-Induktion zu verbessern. Ähnlich wie beim topischen Elastase-Modell gibt es auch bei der Elastase-Enzymaktivität einen Batch-Effekt, was daher, wie bereits erwähnt, wichtig ist, um die gleiche Flasche Elastase für alle Tiere in einem bestimmten Experiment zu verwenden. Während die Inzidenz von intraluminalen AAA-Thromben und -Rupturen mit der Zeit und dem Schweregrad des Aneurysmas zunimmt, sind diese in diesem Modell weder garantiert noch vollständig vorhersagbar.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Elastase/BAPN-Modell sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Mäusen große, echte infrarenale AAAs produziert, die sich im Laufe der Zeit progressiv ausdehnen, einen intraluminalen Thrombus bilden und rupturieren können. Diese Stärken dieses Mausmodells tragen dazu bei, einige der Verhaltensweisen und Merkmale von Aneurysmen beim Menschen besser zu rekapitulieren. Obwohl es technisch schwierig ist, kann eine sorgfältige und gründliche Dissektion der Aorta die aneurysmatische Reaktion verstärken. Derzeit ist die Elastase/BAPN-Methode ein fortschrittliches Modell zur Untersuchung von infrarenalen Bauchaortenaneurysmen.

Ein Aneurysma ist definiert als eine pathologische Erweiterung eines Blutgefäßes, die mehr als 50 % des gesunden Gefäßdurchmessersbeträgt 1. Obwohl abdominale Aortenaneurysmen (AAA) mit einer Inzidenz von etwa >5 % der Männer > 65 Jahren eine häufige Erkrankung in der alternden Bevölkerung sind, gibt es keine gezielten therapeutischen Strategien zur Behandlung von AAA1. Die derzeitige Behandlung von AAA beschränkt sich auf die Reduzierung von Risikofaktoren und die chirurgische Reparatur mit offener oder endovaskulärer Chirurgie auf der Grundlage des Aortendurchmessers oder der Wachstumsrate2. Die größte Gefahr von AAA ist die Aneurysmaruptur, die unbehandelt tödlich verläuft, und eine Reparatur in diesem Notfall kann ein Sterblichkeitsrisiko von über 90 % mit sich bringen1.
Die Pathophysiologie der AAA ist kompliziert, multifaktoriell und nicht vollständig verstanden3. Zu den Merkmalen der humanen AAA gehören eine echte aneurysmatische Dilatation der Aortenwand mit einer Infiltration von Entzündungszellen, das Vorhandensein eines intraluminalen Thrombus und eine progressive Dilatation, die schließlich zu einer Ruptur führt 3,4. Darüber hinaus sind AAAs mit fortgeschrittenem Alter assoziiert, haben eine Geschlechtsdominanz von 9:1 zwischen Mann und Frau und treten am häufigsten in der infrarenalen Aorta auf5. Die Modellierung aller Merkmale und Verhaltensweisen menschlicher AAAs bei Tieren bleibt eine ständige Herausforderung6.
Die derzeitige AAA-Modellierung wird hauptsächlich an Mäusen durchgeführt, und Aneurysmen werden häufig mit einer von drei Methoden induziert - durch Angiotensin II (AngII)-Infusion über eine subkutan implantierte osmotische Pumpe und durch direkte Applikation von Calciumchlorid (CaCl2) oder Elastase auf die Aorta7. Bei der letztgenannten Methode wird die porzine Pankreas-Elastase (PPE) auf ein Segment der infrarenalen Aorta aufgebracht und bewirkt einen enzymatischen Abbau von Elastinfasern innerhalb der elastischen Lamelle des Tunica-Mediums. Diese strukturelle Schädigung führt zu einer Schwächung der Aortenwand und einer Aneurysmaerweiterung nach außen. Die alleinige Verwendung von topischer Elastase führt jedoch zu relativ kleinen infrarenalen Aneurysmen, die sich im Laufe der Zeit nicht progressiv vergrößern oder reißen. In jüngerer Zeit verbesserten Lu et al. dieses Modell, indem sie ihren mit Elastase behandelten Mäusen zusätzlich β-Aminopropionitril (BAPN), einen irreversiblen Inhibitor der Lysyloxidase, verabreichten8. Durch die Verhinderung der Vernetzung von Elastin- und Kollagenfasern führt eine BAPN-Supplementierung dazu, dass sich die durch Elastase geschädigten Aorten progressiv bis zum Rupturpunkt erweitern. Das Elastase/BAPN-Modell hat zusätzlich eine höhere Inzidenzrate von AAA als das topische Elastase-Modell, und die erzeugten Aneurysmen sind ebenfalls größer und enthalten intraluminalen Thrombus8.
Im Elastase/BAPN-Modell kann der Grad der chirurgischen Dissektion und die Exposition der Aorta gegenüber Elastase den Erfolg und die Replizierbarkeit dieses Modells beeinflussen. In diesem Manuskript beschreiben wir, dass die gleichzeitige Verabreichung von BAPN-Trinkwasser und topischer Elastase-Applikation in die Aorta nach zirkumferentieller Isolierung des gesamten infrarenalen Aortensegments die Reproduzierbarkeit verbessert, anatomische Unterschiede zwischen Tieren berücksichtigt und zu einer höheren AAA-Induktionsrate, Aneurysmagrößen und Rupturinzidenz führt. In diesem Artikel beschreiben wir einen standardisierten Ansatz zur zuverlässigen Induktion von fortgeschrittenen abdominalen Aortenaneurysmen bei Mäusen unter Verwendung einer Kombination aus topischem Elastase- und BAPN-supplementiertem Wasser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 L induction chamber</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SOMNO-0530XXS</td>
			<td>anesthesia induction chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% sodicum chloride injection, USP, 20 mL</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-4888-03</td>
			<td>normal saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe Luer-Lok Tip with BD PrecisionGlide Needle 22 G x 3/4</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 309569</td>
			<td>syringe, 22 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropionitrile Fumarate</td>
			<td>TCI</td>
			<td>A0796</td>
			<td>BAPN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropionitrile Fumarate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3134-25G</td>
			<td>BAPN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avant Delux gauze sponges, 2&#34; x 2&#34; 4-Ply</td>
			<td>Medline</td>
			<td>NON26224</td>
			<td>gauze sponges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balding clipper</td>
			<td>Whal Clipper Corporation</td>
			<td>8110</td>
			<td>hair clippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%)</td>
			<td>Avrio</td>
			<td>NCD 67618-154-16</td>
			<td>betadine surgical scrub</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt forceps</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5130</td>
			<td>blunt forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine ER-lab</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>BERLAB0.5</td>
			<td>buprenorphine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carprofen</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-131-11</td>
			<td>carprofen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASTROVIEJO 5.75&#34; straight with lock</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-6412</td>
			<td>Castroviejo needle driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton tipped wood applicators, 6&#34;</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>No. 4302</td>
			<td>cotton tipped wood applicators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DESMARRES 5.5&#39; rectractor&#160;</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-6672</td>
			<td>skin rectractor&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital caliper, 0-150 mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501601</td>
			<td>digital caliper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase from porcine pancrease Type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1250-10MG</td>
			<td>elastase &#62;4.0 units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc</td>
			<td>2701</td>
			<td>ethanol diluted to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye lube</td>
			<td>Optixcare</td>
			<td>14716</td>
			<td>eye lube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germinator 500 dry sterilizer</td>
			<td>CellPoint Scientific, Inc</td>
			<td>5-1450</td>
			<td>dry bead sterilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat therapy mat</td>
			<td>Adroit Medical Systems</td>
			<td>V016</td>
			<td>heat therapy mat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat therapy pump</td>
			<td>Adroit Medical Systems</td>
			<td>HTP-1500</td>
			<td>heat therapy pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane, USP</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>NCD 59399-106-01</td>
			<td>isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-10 pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>LTS 0.5-10 uL</td>
			<td>pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile anesthesia mask, small</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SOMNO-0801</td>
			<td>anesthesia nose cone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro dissector scissors</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5619</td>
			<td>micro dissector scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nii-LED high intensity LED illuminatorLED exertnal light</td>
			<td>Nikon Instruments, Inc</td>
			<td>83359 NII-LED</td>
			<td>external dissection light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon 5-0 monofilament, black non-absorbable suture</td>
			<td>Oasis</td>
			<td>MV-661-V</td>
			<td>5-0 nylon suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyisoprene surgical gloves, GAMMEX Non-Latex PI Micro, size 7.5</td>
			<td>Ansell</td>
			<td>20685975</td>
			<td>non-latex surgical gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex 7 mm stainless steel wound clips</td>
			<td>CellPoint Scientific, Inc</td>
			<td>203-1000</td>
			<td>wound clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>Compass CR2200</td>
			<td>scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnofFlo Accessory Kit</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>10-8000-71</td>
			<td>tubing for electronic vaporizer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoFlo electronic vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SF2992</td>
			<td>low-flow electronic vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoPath Flow Diverter</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SP1016</td>
			<td>flow diverter for electronic vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS/45 sharp forceps</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-4941</td>
			<td>sharp forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-6010SC</td>
			<td>surgical scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vessel forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>VES 0.35</td>
			<td>vessel forceps</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced abdominal aortic aneurysm modeling in mice by combination of topical elastase and oral &#223;-aminopropionitrile

Das topische Elastase-Mausmodell des abdominalen Aortenaneurysmas (AAA) wird in Kombination mit ß-Aminopropionitril (BAPN)-supplementiertem Trinkwasser verbessert, um zuverlässig echte infrarenale Aneurysmen mit Verhaltensweisen zu erzeugen, die menschliche AAAs nachahmen. Die topische Anwendung von Elastase auf die Adventitia der infrarenalen Aorta führt zu einer strukturellen Schädigung der elastischen Schichten der Aortenwand und leitet die aneurysmatische Dilatation ein. Die gleichzeitige Verabreichung von BAPN, einem Lysyloxidase-Hemmer, fördert eine anhaltende Wanddegeneration, indem es die Vernetzung von Kollagen und Elastin reduziert. Diese Kombination führt zu großen AAAs, die sich progressiv ausdehnen, intraluminalen Thrombus bilden und reißen können. Die Verfeinerung chirurgischer Techniken, wie z. B. die zirkumferentielle Isolierung des gesamten infrarenalen Aortensegments, kann dazu beitragen, das Verfahren für eine konsistente und gründliche Anwendung der porzinen Pankreas-Elastase trotz unterschiedlicher Operatoren und anatomischer Unterschiede zwischen Mäusen zu standardisieren. Daher ist das Elastase/BAPN-Modell ein verfeinerter Ansatz zur chirurgischen Induktion von AAA bei Mäusen, der menschliche Aneurysmen besser rekapitulieren und zusätzliche Möglichkeiten zur Untersuchung des Aneurysmawachstums und des Rupturrisikos bieten kann.

In dieser Studie wurden männliche und weibliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 22-24 Wochen verwendet. Die infrarenalen Aorten wurden 5 Minuten lang mit 5 μl Elastase-Enzym (6,9 mg Protein/ml, 6 Einheiten/mg Protein) oder denaturierter Elastase behandelt. Mit Elastase behandelte männliche Mäuse zeigten eine Zunahme des Aortendurchmessers um 43,4 % nach 5-minütiger Exposition gegenüber Elastase im Vergleich zu unbehandelten Aortendurchmessern zu Studienbeginn, während die behandelten weiblichen Aorten um 33,6 % zunahmen (P = 0,0342). Die Aortendurchmesser von Schämchen zeigten über 5 Minuten Exposition gegenüber denaturierter Elastase relativ keine Veränderung (Männchen 0,5 %; Weibchen -2,8 %). Bei den 12 behandelten und 6 Scheinmäusen gab es keine chirurgisch bedingten Todesfälle. Die Daten der 28-Tage-Studie sind in Tabelle 1 dargestellt. Von den weiblich behandelten Mäusen starben 3 von 6 an einer AAA-Ruptur; eine am postoperativen Tag 20 und zwei am Tag 25 (Abbildung 6). Es gab keine AAA-Rupturen bei den behandelten Männchen. AAAs (definiert als eine Zunahme >50% des Aortendurchmessers zu Studienbeginn oder der Tod durch AAA-Ruptur) wurden bei allen behandelten Mäusen erfolgreich induziert (12 von 12). Nach 28 Tagen betrug der durchschnittliche AAA-Durchmesser der behandelten Männchen 2,86 ± 0,31 mm, mit einer durchschnittlichen prozentualen Veränderung von 257 ± 54 %, während die AAA-Durchmesser der überlebenden behandelten weiblichen Mäuse 3,60 ± 1,87 mm betrugen, mit einer durchschnittlichen prozentualen Veränderung von 417 ± 286 % (Abbildung 7). Scheinmäuse zeigten relativ keine Veränderung der Aortendurchmesser.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig06.jpg"> Abbildung 6: Überleben von männlichen und weiblichen B6-Mäusen während eines 28-Tage-Elastase/BAPN-Modells von AAA. (A) Bei 3 der 6 behandelten weiblichen Mäuse trat eine AAA-Ruptur auf (eine Maus nach 20 Tagen, dann zwei Mäuse nach 25 Tagen), während es bei den 6 behandelten männlichen Mäusen nach 28 Tagen keine Rupturen gab. (B) Repräsentative Bilder bei der Autopsie einer weiblichen Maus, die an einer AAA-Ruptur starb. Die AAA-Ruptur wird durch ein großes retroperitoneales Hämatom (links) und das Vorhandensein eines infrarenalen AAA mit einem Wanddefekt (rechts) demonstriert. Abkürzungen: BAPN = ß-Aminopropionitril; AAA = Bauchaortenaneurysma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig07.jpg"> Abbildung 7: Maximale Aortendurchmesser von Elastase/BAPN- und Schein-B6-Mäusen nach 28 Tagen. (A) Behandelte Mäuse weisen nach 28 Tagen signifikant größere infrarenale Durchmesser auf als Scheinmäuse. (B) Die Kombination von Elastase und BAPN führt sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen B6-Mäusen erfolgreich zu großen infrarenalen AAAs. Abkürzungen: BAPN = ß-Aminopropionitril; AAA = Bauchaortenaneurysma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"></td>
			<td>86 männlich Sham</td>
			<td>86 weiblich Sham</td>
			<td>86 männliche Elastase/8APN</td>
			<td>86 weibliche Elastase/8APN</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Anzahl der Mäuse</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Alter (Wochen)</td>
			<td>22,3 ± 0,0</td>
			<td>22,7 ± 0,7</td>
			<td>23,1 ± 0,2</td>
			<td>23,2 ± 0,2</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Gewicht (g; bei der Operation)</td>
			<td>36,3 ± 2,5</td>
			<td>23,7 ± 1,2</td>
			<td>32,8 ± 1,7*</td>
			<td>23,7 ± 0,8</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Durchmesser der Aorta vor der Behandlung (mm)</td>
			<td>0,89 ± 0,02</td>
			<td>0,75 ± 0,04</td>
			<td>0,81 ± 0,07</td>
			<td>0,73 ± 0,09</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Durchmesser der Aorta nach der Behandlung (mm)</td>
			<td>0,90 ± 0,03</td>
			<td>0,73 ± 0,01</td>
			<td>1,15 ± 0,03**</td>
			<td>0,98 ± 0,12**</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Prozentuale Veränderung nach 5-minütiger Behandlung (%)</td>
			<td>0,5 ± 4,4</td>
			<td>-2,8 ± 5,3</td>
			<td>43,4 ± 10,2***</td>
			<td>33,6 ± 4,5***</td>
		</tr><tr><td colspan="3">AAA-Inzidenz (%)</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>6 / 6</td>
			<td>6 / 6</td>
		</tr><tr><td colspan="3">AAA reißt um 28 Tage</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>0 / 6</td>
			<td>3 / 6</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Überlebenszeit bis zu 28 Tage</td>
			<td>3 / 3</td>
			<td>3 / 3</td>
			<td>6 / 6</td>
			<td>3 / 6</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Maximaler Aortendurchmesser nach 28 Tagen (mm)</td>
			<td>0,85 ± 0,01</td>
			<td>0,64 ± 0,01</td>
			<td>2,86 ± 0,31*</td>
			<td>3,60 ± 1,87**</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Prozentuale Veränderung des Aortendurchmessers nach 28 Tagen (%)</td>
			<td>-4 ± 2</td>
			<td>-16 ± 2</td>
			<td>257 ± 54*</td>
			<td>417 ± 286**</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Ergebnisse eines 28-Tage-Modells des Elastase/BAPN-Mausmodells von AAA. Die Daten sind mittlere ± SD. *P<0,05, **P<0,005, ****P<0,0001 im Vergleich zu Scheinproben des gleichen Geschlechts mittels Einweg-ANOVA Fischer-Test. Abkürzungen: BAPN = ß-Aminopropionitril; AAA = Bauchaortenaneurysma.

Autor im Rampenlicht: Erweitertes Maus-AAA-Modell mit Elastase zur Nachahmung menschlicher Aneurysmen

Dieses Protokoll beschreibt einen methodischen chirurgischen Ansatz zur Modellierung fortgeschrittener Bauchaortenaneurysmen bei Mäusen durch eine Kombination aus direkter Applikation von Elastase auf die infrarenale Aorta und Verabreichung von ß-Aminopropionitril über das Trinkwasser.

Fortgeschrittene Modellierung des abdominalen Aortenaneurysmas bei Mäusen durch Kombination von topischer Elastase und oralem ß-Aminopropionitril

The topical elastase murine model of abdominal aortic aneurysm (AAA) is enhanced when combined with &#223;-aminopropionitrile (BAPN)-supplemented drinking ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Advanced Abdominal Aortic Aneurysm Modeling in Mice by Combination of Topical Elastase and Oral &#223;-aminopropionitrile

1.1K Aufrufe.  University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health. Unsere Forschung zielt darauf ab, die Pathophysiologie des Bauchaortenaneurysmas zu verstehen. Insbesondere möchten wir in molekularer Hinsicht wissen, wie Aneurysmen reißen. Wir glauben, dass die Modellierung des Aortenaneurysmas bei Mäusen, Männern und Frauen uns helfen wird, eine neue Behandlung für diese hochgradig tödliche Krankheit zu entwickeln, die dringend pharmakologisch behandelt werden muss.Die Pathophysiologie des abdominalen Aortena...

Serie: Autor im Rampenlicht: Erweitertes Maus-AAA-Modell mit Elastase zur Nachahmung menschlicher Aneurysmen

Creation of Murine Experimental Abdominal Aortic Aneurysms with Elastase 

Transient intraluminal infusion of porcine pancreatic elastase into the infrarenal segment of the abdominal aorta is the most widely used animal model of abdominal aortic aneurysm (AAA) ever since it was first described in rats by Anidjar and colleagues.1 The rationale for its development was based on the disrupted nature of elastin observed in AAAs. This rat model has been modified to produce AAAs in the infrarenal aortic region of mice.2 The model has the ability to add broad insight into the pathobiology of AAA due to the emergence of numerous transgenic and gene knockout mice. Moreover, it is a viable platform to test potential therapeutic agents for AAA. In this video, we demonstrate the elastase infusion AAA procedure used in our laboratory. 
Mice are anesthetized using 2.5% isoflurane, and a laparotomy is performed under sterile conditions. The abdominal aortais isolated with the assistance of an operating stereomicroscope (Leica). After placing temporary ligatures around the proximal and distal aorta, an aortotomy is created at the bifurcation with the tip of a 30-gauge needle. A heat-tapered segment of PE-10 polyethylene tubing is introduced through the aortotomy and secured. The aortic lumen is subsequently perfused for 5-15 minutes at 100 mm Hg with saline containing type I porcine pancreatic elastase (4.5 U/mL; Sigma Chemical Co.). After removing the perfusion catheter, the aortotomy is repaired without constriction of the lumen.

Creation of Murine Experimental Abdominal Aortic Aneurysms with Elastase

This video shows how to induce abdominal aortic aneurysms (AAA) in mice via transient intraluminal infusion of porcine pancreatic elastase into the infrarenal segment of the abdominal aorta. The model has the ability to add broad insight into the pathobiology of AAA due to the emergence of numerous transgenic and gene knockout mice.

Erstellung von Murine Experimental Bauchaortenaneurysmen mit Elastase

Transient intraluminal infusion of porcine pancreatic elastase into the infrarenal segment of the abdominal aorta is the most widely used animal model of ...

Forschung

Biologie

Transverse Aortic Constriction in Mice

Transverse aortic constriction (TAC) in the mouse is a commonly used experimental model for pressure overload-induced cardiac hypertrophy and heart failure.1 TAC initially leads to compensated hypertrophy of the heart, which often is associated with a temporary enhancement of cardiac contractility. Over time, however, the response to the chronic hemodynamic overload becomes maladaptive, resulting in cardiac dilatation and heart failure.2 The murine TAC model was first validated by Rockman et al.1, and has since been extensively used as a valuable tool to mimic human cardiovascular diseases and elucidate fundamental signaling processes involved in the cardiac hypertrophic response and heart failure development. When compared to other experimental models of heart failure, such as complete occlusion of the left anterior descending (LAD) coronary artery, TAC provides a more reproducible model of cardiac hypertrophy and a more gradual time course in the development of heart failure. Here, we describe a step-by-step procedure to perform surgical TAC in mice. To determine the level of pressure overload produced by the aortic ligation, a high frequency Doppler probe is used to measure the ratio between blood flow velocities in the right and left carotid arteries.3, 4 With surgical survival rates of 80-90%, transverse aortic banding is an effective technique of inducing left ventricular hypertrophy and heart failure in mice.

Transverse aortic constriction (TAC) in the mouse is a commonly used experimental model to study mechanisms underlying cardiac hypertrophy and heart failure development. Here, we describe procedures to constrict the aorta to create a reproducible degree of cardiac hypertrophy in mice.

Quer Aorten-Verengung in Mäuse

Transverse aortic constriction (TAC) in the mouse is a commonly used experimental model for pressure overload-induced cardiac hypertrophy and heart ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genomweiten Gen-Deletionen in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Von High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Die Analyse der Autophagie in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Mithilfe von Starvation Pads in Kombination mit Fluoreszenzmikroskopie

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal Glucocorticoid-Analyse: Nicht-invasive Monitoring-Adrenal in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

Isolierung und Kultur von primären oralen Keratinozyten aus dem erwachsenen Mausgaumen

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Mouse Abdominal Aortic Aneurysm Model Induced by Perivascular Application of Elastase

Abdominal aortic aneurysm (AAA), although primarily asymptomatic, is potentially life-threatening as the rupture of AAA usually has a devastating outcome. Currently, there are several distinct experimental models of AAA, each emphasizing a different aspect in the pathogenesis of AAA. The elastase-induced AAA model is the second most used rodent AAA model. This model involves direct infusion or application of porcine pancreatic elastase (PPE) to the infrarenal segment of the aorta. Due to technical challenges, most elastase-induced AAA model nowadays is performed with the external application rather than an intraluminal infusion of PPE. The infiltration of elastase will cause degradation of elastic lamellae in the medial layers, resulting in the loss of aortic wall integrity and subsequent dilation of the abdominal aorta. However, one disadvantage of the elastase-induced AAA model is the inevitable variation of how the surgery is performed. Specifically, the surgical technique of isolating the infrarenal segment of the aorta, the material used for aorta wrapping and PPE incubation, the enzymatic activity of PPE, and the time duration of PPE application can all be important determinants that affect the eventual AAA formation rate and aneurysm diameter. Notably, the difference in these factors from different studies on AAA can lead to reproducibility issues. This article describes a detailed surgical process of the elastase-induced AAA model through direct application of PPE to the adventitia of the infrarenal abdominal aorta in the mouse. Following this procedure, a stable AAA formation rate of around 80% in male and female mice is achievable. The consistency and reproducibility of AAA studies using an elastase-induced AAA model can be significantly enhanced by establishing a standard surgical procedure.

The present protocol describes a standardized surgical method for the elastase-induced AAA model through the direct application of elastase to the adventitia of infrarenal abdominal aorta in mice.

Mausmodell für das abdominale Aortenaneurysma, das durch die perivaskuläre Anwendung der Elastase induziert wird

Abdominal aortic aneurysm (AAA), although primarily asymptomatic, is potentially life-threatening as the rupture of AAA usually has a devastating outcome. ...

A Modified Technique for Transverse Aortic Constriction in Mice

Transverse aortic constriction (TAC) is a frequently used surgery in research regarding heart failure and cardiac hypertrophy based on the formation of pressure overload in mouse models. The main challenge of this procedure is to clearly visualize the transverse aortic arch and precisely band the target vessel. Classical approaches perform a partial thoracotomy to expose the transverse aortic arch. However, it is an open-chest model that causes a rather large surgical trauma and requires a ventilator during the surgery. To prevent unnecessary trauma and simplify the operating procedure, the aortic arch is approached via the proximal proportion of the sternum, reaching and binding the target vessel using a small self-made retractor that contains a snare. This procedure can be conducted without entering the pleura cavity and does not need a ventilator or microsurgical operation, which leaves the mice with physiological breathing patterns, simplifies the procedure, and significantly reduces operation time. Due to the less invasive approach and less operation time, mice can undergo fewer stress reactions and recover rapidly.

The present protocol describes a modified and simplified technique with a minimally invasive transverse aortic constriction (TAC) procedure using a self-made retractor. This procedure can be conducted without a ventilator or microscope and introduces pressure overload, eventually leading to cardiac hypertrophy or heart failure.

Eine modifizierte Technik zur transversalen Aortenverengung bei Mäusen

Transverse aortic constriction (TAC) is a frequently used surgery in research regarding heart failure and cardiac hypertrophy based on the formation of ...

A Calcium Phosphate-Induced Mouse Abdominal Aortic Aneurysm Model

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is a life-threatening cardiovascular disease that occurs worldwide and is characterized by irreversible dilation of the abdominal aorta. Currently, several chemically induced murine AAA models are used, each simulating a different aspect of the pathogenesis of AAA. The calcium phosphate-induced AAA model is a rapid and cost-effective model compared to the angiotensin II- and elastase-induced AAA models. The application of CaPO4 crystals to the mouse aorta results in elastic fiber degradation, loss of smooth muscle cells, inflammation, and calcium deposition associated with aortic dilation. This article introduces a standard protocol for the CaPO4-induced AAA model. The protocol includes material preparation, the surgical application of the CaPO4&#160;to the adventitia of the infrarenal abdominal aorta, the harvesting of aortas to visualize aortic aneurysms, and histological analyses in mice.

This protocol describes a calcium phosphate-induced abdominal aortic aneurysm (AAA) mouse model to study the pathological features and molecular mechanisms of AAAs.

Ein Calciumphosphat-induziertes Maus-Bauchaortenaneurysma-Modell

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is a life-threatening cardiovascular disease that occurs worldwide and is characterized by irreversible dilation of the ...