In letzter Zeit haben orale Keratinozyten aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaft Aufmerksamkeit erregt. Wir bieten ein Protokoll für die Kultivierung von oralen Keratinozyten der Maus in einem stammzellähnlichen Zustand, der für nachgelagerte Anwendungen geeignet ist. Die Kultur des oralen Keratinozyten der Maus und unterscheidet sich von den Keratinozyten der Haut.
In diesem Protokoll haben wir erfolgreich den primären oralen Keratinozyten der Maus isoliert und eine Langzeitkulturtechnik entwickelt. Dieses Kultursystem kann in molekularen und biochemischen Assays eingesetzt werden, um das Merkmal oraler basilarer Stammzellen und ihrer verwandten Erkrankungen besser zu verstehen. Nachdem Sie eine erwachsene C57BLK6J-Maus geopfert haben, entfernen Sie die Haare um den Mund mit einem Rasierer und einer Schere, die auf beiden Seiten von den Wangen in Richtung Kiefer geschnitten wird.
Als nächstes verwenden Sie eine Pinzette, um den Mund weit zu öffnen und Blut mit einem Wattestäbchen zu absorbieren, dann desinfizieren Sie die Palette, indem Sie die Innenseite des Mundes mit einem Wattestäbchen abwischen, das 10% Povidonjod enthält. Um die Mauspalette zu ernten, machen Sie zuerst mit einer chirurgischen Skalpellklinge einen Randschnitt in voller Dicke entlang der Palettenseite der Oberkieferzähne. Dann mit einem Raspatorium die gesamte Palette sorgfältig sezieren.
Übertragen Sie das Palettengewebe schnell in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das vier Milliliter vollständiges Medium enthält, das mit Antibiotika und Antimykotika ergänzt wird. Bewahren Sie die Gewebe auf Eis auf, bis sie für die Inkubation bereit sind. In einer Laminar-Flow-Haube die Gewebe in eine 60-Millimeter-Schale mit vier Millilitern komplettem Medium mit Antibiotika und Antimykotika überführen.
Entfernen Sie dann mit einer kurzen stumpfen Pinzette und einer Skalpellklinge vorsichtig Blut aus dem Gewebe und waschen Sie das Gewebe 10 Mal mit dem vollständigen Medium. Nach der letzten Wäsche das Gewebe in eine 35-Millimeter-Schale mit vier Millilitern 0,025% Trypsin, ergänzt mit Antibiotika und Antimykotika, überführen. Legen Sie die Gewebe mit der Epitheloberfläche nach unten und inkubieren Sie sie für 16 Stunden bei Raumtemperatur in der Kulturhaube.
Nach der Trypsin-Verdauung über Nacht verwenden Sie eine stumpfe Pinzette, um das Gewebe aus der Trypsinlösung zu entfernen und es in eine 60-Millimeter-Schale mit einer Trypsin-Inhibitor-Lösung mit der Epitheloberfläche nach oben zu übertragen. Halten Sie sich anschließend mit einer Pinzette am Rand der Palette fest und kratzen Sie mit der Skalpellklinge vorsichtig die Epithelschicht von der darunter liegenden Lamina propria ab. Um die maximale Menge an Epithelzellen aus den Geweben zu sammeln, übertragen Sie das Gewebe in eine weitere 60-Millimeter-Schale mit vier Millilitern vollständigem Medium und wiederholen Sie das Schaben, wie zuvor gezeigt.
Als nächstes legen Sie ein steriles 100-Mikron-Zellsieb auf ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Und mit einer sterilen Pipette zwei Milliliter Trypsinlösung in das Sieb geben, um seine Oberfläche zu benetzen. Mischen Sie dann mit einer Pipette die Zellsuspension einige Male in der 60-Millimeter-Schale und filtern Sie die Zellen durch das 100-Mikron-Zellsieb.
Um die Anzahl der Zellen zu zählen, fügen Sie 15 Mikroliter der Zellsuspension zu 50 Mikrolitern Trypanblaulösung hinzu, übertragen Sie dann 10 Mikroliter der Zell trypanblauen Mischung auf ein Hämozytometer und zählen Sie die Anzahl der Zellen. Als nächstes die Zellsuspension zentrifugieren, den Überstand entfernen und zwei Milliliter vollständiges Medium, das Chelex FBS enthält, in das Röhrchen geben. Resuspendieren Sie das Zellpellet, indem Sie es mehrmals mit einer Fünf-Milliliter-Pipette titrieren.
Dann zwei- bis fünfmal 10- bis fünfte Zellen von einer Maus in eine Vertiefung von 24-Well-Platte, die mit Kollagen Typ eins vorbeschichtet ist, und die Zellen bei 37 Grad Celsius für zwei Tage inkubieren, ohne das Medium zu wechseln. Primäre orale Keratinozyten wuchsen als Monoschicht und zeigten eine Kopfsteinpflastermorphologie. Kleine Keratinozytenkolonien waren nach drei und fünf Tagen sichtbar.
Nach einer Woche Inkubation wurden diese Kolonien größer und bildeten enge Kolonien. Die erste Passage wurde zwei Wochen nach der ersten Beschichtung durchgeführt und bei späteren Passagen zeigten die Keratinozyten ein stabiles Wachstum mit einer kürzeren Kulturperiode. Die Keratinozyten hörten auf zu wachsen, wenn während des Isolationsprozesses eine signifikante Fibroblastenkontamination auftrat.
Nach der Kultivierung exprimierten die Keratinozyten Keratin 14 und alpha6-Integrin. Frühe und späte Passagezellen zeigten eine gleichmäßige Expression von P63, was ihre Stammhaftigkeit bestätigte. Keratinozyten, die mit hohem Kalziumgehalt behandelt wurden, zeigten jedoch eine verminderte P63-Expression, was darauf hindeutet, dass eine Behandlung mit hohem Kalziumgehalt stammzellbezogene Gene unterdrückt.
Der Differenzierungsmarker Keratin 13 zeigte eine seltene oder keine Expression in frühen und späten Passagen, aber eine signifikante Expression in der Behandlung mit hohem Kalziumgehalt. Der Fibroblastenmarker PDGFR alpha wurde in der Keratinozytenkultur nicht exprimiert, was darauf hindeutet, dass dieses Protokoll basale Keratinozyten erfolgreich isolieren und diese Zellen im undifferenzierten Zustand halten konnte. Das Fangen sollte von der Epiduralseite und 10 Minuten pro Gewebeprobe beginnen.
Auch im Allgemeinen ist das Pipettieren von Zellen wichtig für eine bessere Zelllebensfähigkeit. Nach zwei oder drei Durchgängen wird der orale Keratinozyten für weitere funktionelle Experimente stabil. Wichtig ist, dass dieses Protokoll mit transgenem Mausleben für zelluläre und molekulare Assays in vitro kombiniert werden kann.
Jüngste Studien haben über die Dynamik und Heterogenität oraler basilarer Stammzellen berichtet. Diese Methode wird das Studium der oralen Stammzellbiologie erleichtern und zu einem besseren Verständnis von oralen Erkrankungen führen.
