Unsere Forschung konzentriert sich auf die Nutzung der einzigartigen Eigenschaften von granulären Hydrogelen, um die Zellbewegung und die Funktionen für die Geweberegeneration zu untersuchen. Die Zellreaktion auf die Mikroumgebung ist wichtig, um die Auswirkungen auf die translationale Wirkung zu modellieren. Mit der zunehmenden Verwendung von 3D-Portgerüsten steigt auch der Bedarf an umfassenden 3D-Migrationsassays, die das Zellverhalten in einer Wundheilungsumgebung besser replizieren.
Wir haben zwei Pipelines entwickelt, die dreidimensional sind, von der Gerüstentwicklung über die Bildgebung bis hin zur Analyse, um Zellbewegungen und -migration in vitro zu untersuchen. Mit diesen beiden neuen Assays haben wir die Möglichkeit gewonnen, die reaktionsfähigen Zellen in zwei verschiedenen Stadien der Wundheilung zu verfolgen: die anfängliche Gerüstinfiltration aus dem Massengewebe und die Zellbewegung, sobald sie von einem komplexen Gerüst umgeben ist. Zu Beginn werden 120.000 humane dermale Fibroblastenzellen pro Quadratzentimeter in mindestens sechs Vertiefungen einer 96-Well-Platte abgefüllt.
Entfernen Sie das Medium nach der Inkubation über Nacht mit einem Aspirator oder einer Pipette aus den Zellvertiefungen. Geben Sie den Farbstoff in 20 Mikrolitern jeder Gelbedingung mit einer Direktverdrängerpipette in die Vertiefungen. Mit einem auf 25 Grad Celsius eingestellten Zentrifugenaufsatz für Plattenspinnrotoren drehen Sie die Platte 15 Sekunden lang bei 100 g, wobei Beschleunigung und Verzögerung auf 8 eingestellt sind, um das Gel flach zu drücken.
Drehen Sie die Platte um 180 Grad und drehen Sie sie erneut, um eine gleichmäßige Gelverteilung auf dem Vertiefungsboden zu gewährleisten. Um das Gel aseptisch zu vernetzen, wenden Sie 30 Sekunden lang fokussiertes Licht bei 365 Nanometern an, um das Gerüst zu glühen. Nachdem Sie alle Gerüste gebildet haben, geben Sie 200 Mikroliter Medium in jede Vertiefung und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Wählen Sie jede Datei einzeln aus, um die Voxelgröße festzulegen. Drücken Sie Alle starten, um die Konvertierung zu starten. Wählen Sie als Nächstes in der Imaris Arena Software ein Bild aus der Arena aus, um mit der Verarbeitung zu beginnen.
Klicken Sie auf die Registerkarte Bildprofis in der Hauptsymbolleiste. Klicken Sie nun auf das Dropdown-Menü für Kanal 1 und wählen Sie Hintergrundsubtraktion. Drücken Sie OK, um zur 3D-Ansicht zurückzukehren.
Klicken Sie in der kleinen Symbolleiste auf das Symbol mit den abgerundeten blauen Formen mit der Bezeichnung Neue Oberflächen hinzufügen, um eine Registerkarte für bearbeitbare Objekte mit dem Namen Oberflächen 1 zu erstellen. Generieren Sie manuell Parameter für alle Repliken mit der blauen Pfeilschaltfläche. Legen Sie die Oberflächendetails auf 0,7 Mikrometer fest, und wählen Sie Hintergrundsubtraktion, Lokaler Kontrast aus.
Geben Sie die durchschnittliche Zellenlänge in den Durchmesser der größten Kugel ein, die in das Objektfeld passt. Bestimmen Sie für die Schwellenwertbestimmung das Intensitätshistogramm, um nur die hellsten Zellen zu segmentieren. Aktivieren Sie "Berührende Objekte teilen", "Bereich vergrößern", und legen Sie den Durchmesser der Kernpunkte so fest, dass er dem zuvor verwendeten Durchmesser entspricht.
Um die Erstellungsparameter für die Stapelanalyse zu speichern, klicken Sie auf das Zauberstabsymbol mit der Bezeichnung Kreation. Klicken Sie auf Parameter für Batch speichern, benennen Sie die Datei, und klicken Sie auf OK. Um alle Zellenhöhen zu erfassen, klicken Sie auf die Registerkarte Detailliert. Wählen Sie bestimmte Werte aus und positionieren Sie dann Z aus den Dropdown-Menüs.
Klicken Sie auf das Symbol Speichern, um alle Z-Positionen und Klassifizierungen in eine XLS-Datei zu exportieren. Gießen Sie zunächst PBS in eine Petrischale unter der laminaren Haube und pipettieren Sie 20 Mikroliter der Zellmedienlösung auf den umgekehrten Deckel der Petrischale. Setzen Sie den Deckel wieder auf die Schale und inkubieren Sie die Platte, um hängende, tröpfchenkultivierte 3D-Sphäroide zu erhalten.
Um das PLOSMA einzurichten, geben Sie mit einer Direktverdrängerpipette aseptisch 15 Mikroliter des Gels in die Vertiefungen einer durchsichtigen 96-Well-Platte. Mit einem Zentrifugenaufsatz für Plattenspinnrotoren die Platte 10 Sekunden lang bei 1.000 g drehen, um das Gel flach zu drücken. Drehen Sie die Platte um 180 Grad und drehen Sie sie erneut, um eine gleichmäßige Gelverteilung zu gewährleisten.
Wenden Sie dann 30 Sekunden lang fokussiertes Licht bei 365 Nanometern an, um das Gerüst zu glühen und das Gel von oben zu vernetzen. Schieben Sie die Petrischale mit den hängenden Tröpfchen aseptisch in die Gewebekulturhaube und drehen Sie den Deckel um. Saugen Sie mit einer 20-Mikroliter-Pipette langsam ein Tröpfchen an, bis das Sphäroid in die Pipettenspitze eintritt, und werfen Sie das Tröpfchen auf das Gerüst in der Mitte der Vertiefung.
Inkubieren Sie die Well-Platte zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, damit sich die Sphäroide am Gerüst anheften können. Pipettieren Sie nach der Inkubation weitere 15 Mikroliter Gel auf jedes Sphäroide. Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 g für 15 Sekunden in jede Richtung, um eine gleichmäßige Gelverteilung zu gewährleisten.
Glühen Sie die oberste Schicht des Gels für die Verwendung von ultraviolettem Licht, wie zuvor gezeigt. Legen Sie die Platte unter ein konfokales Mikroskop und bilden Sie die Sphäroide ab, nachdem Sie die unterste und die höchste Z-Ebene ausgewählt haben. Nachdem Sie die Bilder in die Imaris Arena Software importiert haben, klicken Sie auf das Dropdown-Menü für Kanal 1 und wählen Sie Hintergrundsubtraktion.
Drücken Sie OK am unteren Rand des Bedienfelds. Drücken Sie in der 3D-Ansicht im Popup-Fenster "Anzeigeanpassung" auf "Alle Kanäle automatisch anpassen" und nehmen Sie bei Bedarf Korrekturen vor. Klicken Sie in der kleineren Symbolleiste auf das Symbol Neuen Referenzrahmen hinzufügen, um eine Registerkarte mit der Bezeichnung Referenzrahmen 1 zu erstellen.
Verschieben Sie den Ursprung in allen drei Ebenen in die Mitte des Sphäroids. Klicken Sie in derselben Symbolleiste auf das Symbol mit den orangefarbenen Kugeln, um neue Punkte hinzuzufügen, erstellen Sie eine Registerkarte mit dem Namen Flecken 1 und drücken Sie die blaue Pfeiltaste, um fortzufahren. Passen Sie für die Schwellenwertbestimmung das Intensitätshistogramm so an, dass nur die hellsten Teile segmentiert werden.
Verwenden Sie den Slicer, um aus Gründen der Genauigkeit durch den Bildstapel zu navigieren. Drücken Sie dreimal auf den blauen Pfeil Weiter. Deaktivieren Sie "Auf Slicer rendern" oder klicken Sie auf das gelbe quadratische Symbol im Setup-Bedienfeld.
Klicken Sie auf die Registerkarte Statistiken. Wählen Sie in den Dropdown-Menüs bestimmte Werte und den Abstand vom Ursprungsreferenzrahmen aus. Klicken Sie auf das Symbol Speichern.
Um alle Änderungen und Analysen zu speichern, klicken Sie auf das Symbol Speichern in der Hauptsymbolleiste. Diese Methode wurde verwendet, um die zelluläre Infiltration an einer Gewebegrenzfläche zu bewerten. Die mediane Position in der Z-Achse migrierender Zellen stieg signifikant von null auf 24 Stunden an, was auf eine bemerkenswerte vertikale Zellbewegung hinweist.
Die Faltenänderung der Zellmigration entlang der Z-Achse verdoppelte sich nach 24 Stunden. Zellen, die mit der PLOSMA-Methode ausgesät wurden, zeigten nach 24 Stunden eine signifikante Ausbreitung und Migration aus dem Sphäroidkern. Dreidimensionale Renderings zeigten nach 24 Stunden eine großflächige Zellausbreitung im PLOSMA-Gerüst, wobei sich sichtbare Projektionen nach außen erstreckten.
Die mit der Spots-Funktion verarbeiteten 3D-Bilder zeigten verteilte Zellpositionen im Gerüst, was auf eine weit verbreitete Migration hindeutet. Die Zellen legten eine durchschnittliche Strecke von über 200 Mikrometern zurück, wobei die Ergebnisse über alle Proben hinweg konsistent waren. Die Z-Höhenfaltenänderung der Zellen im PLOSMA-Gerüst betrug etwa 4, was auf eine erhebliche Aufwärtsbewegung hinweist.
