Grabaciones de patch clamp de neuronas de ratón de retina en una rebanada preparación adaptada a la oscuridad

Resumen

Aquí se describe un procedimiento para la generación adaptada a la oscuridad rebanadas de la retina del ratón de los registros electrofisiológicos.

Resumen

Nuestra experiencia visual se inicia cuando el pigmento visual en nuestra fotorreceptores de la retina absorbe fotones de energía de la luz e inicia una cascada de eventos intracelulares que llevan a la clausura de nucleótidos cíclicos, los canales con compuertas en la membrana celular. El cambio resultante en el potencial de membrana a su vez conduce a una reducción en la cantidad de la liberación de neurotransmisores de los dos terminales de la barra y cono sináptica. Para medir cómo el cambio de luz-evocada en el potencial de membrana del fotorreceptor conduce a la actividad posterior de la retina, los científicos han hecho registros electrofisiológicos de las preparaciones parte de la retina para ^1,2 años. En el pasado estos cortes se han reducido de forma manual con una hoja de afeitar en el tejido de la retina que se une a un papel de filtro, en los últimos años otro método de corte ha sido desarrollado por el cual el tejido retinal está incrustado en agar de baja temperatura de gelificación y en rodajas en una solución fría con un vibración micrótomo ^3,4. Esta preparación produce cortes de la retina con menos daños en la superficie y las respuestas evocadas por la luz muy fuerte. Aquí se documenta cómo este procedimiento puede realizarse bajo la luz infrarroja para evitar la decoloración del pigmento visual.

Protocolo

1. Electrodos de preparar

1. Prepare los electrodos de registro y referencia a los dos por inmersión en NaCl 1 M y la conducción de 15V entre ellos utilizando una onda sinusoidal de 1 Hz ~ 20 s.
2. Hacer los electrodos de registro utilizando un extractor de micropipeta (Sutter Instrumentos P-97). Parche de pipetas de utilizar un vidrio de borosilicato con un diámetro exterior de 1,2 mm y un diámetro interior de 0,69 mm (Sutter Instruments, Cat. # B120-69-10). Medir la resistencia en serie a través de la punta del electrodo. Basándose en el tamaño de las células diana elegir un diámetro punta de la pipeta, porque los cuerpos celulares de aproximadamente 20 micras de diámetro en el uso de ~ 5 mW de los cuerpos celulares ~ 5 micras de diámetro en el uso de ~ 12 mW.
3. Preparar el terreno / electrodos de referencia. Con una jeringa de llenar un tubo de polietileno de sección pequeña (Intramedic, PE205) con 1 mM de NaCl, que incluye un 3,5% de agar (Sigma, Cat. # A7002) en NaCl 1M. Coloque el puente de agar sobre el electrodo de referencia Ag / AgCl.

2. La preparación de soluciones

1. Solución de baño externo, "los medios de comunicación que contiene bicarbonato (1 litro): 1 botella de Ames Ames medio (Sigma, Cat. # A1420), 1,9 g de NaHCO _3, 7 ml de penicilina-estreptomicina (Sigma, Cat. # P0781) para evitar que las bacterias el crecimiento. Ajustar la osmolaridad a ~ 280 mOsm.
2. Corte de la solución, "los medios de comunicación que contiene el tampón HEPES pH (1 L): 1 botella de Ames Ames Medio, 0,887 g de NaCl, 2,38 g de HEPES, 7 ml de penicilina-estreptomicina. Ajustar el pH a 7.4 usando ~ 1M NaOH y / o HCl 1M. Ajustar la osmolaridad a ~ 280 mOsm.
3. -Aspartato de potasio (K-Asp) solución de la pipeta interna (en mm): 125 K-aspartato, 10 KCl, 10 HEPES, 5 NMG-HEDTA, 0,5 CaCl _2, 1 ATP-Mg, 0,2 GTP-Mg, pH se ajusta a ~ 7.3 con NMG-OH, y la osmolaridad se ajusta a ~ 280 mOsm.
4. Respaldo en agar para la estabilización de la temperatura de gelificación bajo agarosa que contiene la retina (5% en peso), 7,5 g de agar (Sigma, Cat. # A7002) fundido en 150 ml de dH ₂ O.

3. Día del experimento

1. Descongele ~ 1,5 ml de K-Asp solución interna y el fluoróforo de su elección del congelador. Diluir el fluoróforo a la concentración adecuada, que debe ser determinada empíricamente.
2. Vierta los medios de comunicación de Ames contiene _NaHCO3 (~ 200 ml) en el recipiente de almacenamiento a prueba de luz y luego colocarlo en el baño de agua (30-32 ° C) y equilibrar con un 5% de CO ₂ / 95% O ₂ gas
3. Llene la botella con ~ 110 ml de los medios de comunicación de Ames contiene HEPES, lugar en el hielo y equilibrarlo con el 100% de O _2.
4. Coloque el resto de Ames los medios de comunicación que contiene _NaHCO3 en un depósito de calefacción en la parte superior de la jaula de Faraday, y equilibrar con CO2 al _5% / 95% de gas O _2. Parafilm puede ser usado para atrapar el gas en el espacio por encima de la solución.
5. Prepare la baja temperatura de gelificación de agarosa (3%) mediante la adición de 0,75 g (Sigma, Cat. # A0701) a 25 ml de los medios de comunicación de Ames con HEPES y calentar la solución a ~ 115 ° C para fundir la agarosa. Revuelva hasta que la solución clara, sin burbujas, y guardar en un baño de agua (~ 42 ° C).
6. Llenar una pipeta de grabación con la solución de K-Asp interna de la sonda de punta.

4. Comience Experimento

1. Practicar la eutanasia con el ratón y eliminar rápidamente los ojos con tijeras curvas. Gafas de infrarrojos debe ser utilizado para todos los procedimientos para prevenir la decoloración del pigmento visual.
2. Lugar de los ojos en un pedazo de papel de filtro para evitar que se mueva, y el uso de una fina lámina adhesiva de doble cara, haga un corte en la córnea mientras se mantiene el ojo con las pinzas.
3. Tan pronto el globo ocular es perforado, que la transferencia de los ojos en un plato lleno de los medios de comunicación de Ames.
4. Utilizando la ranura de la córnea como un punto de entrada, unas tijeras pequeñas se utilizan para cortar las porciones restantes de la córnea, después de lo cual el cristalino y humor vítreo se puede quitar. Tenga cuidado de que la retina permanece unido a la ojera, y almacenar el ocular en la oscuridad a 32 ° C en los medios de comunicación equilibrada con 5% de CO ₂ / 95% O ₂ de Ames.

5. Rebanar

1. Hemisect uno de los oculares y disociar la retina del epitelio pigmentario de la retina. Quitar los bordes de la retina para que el tejido que se acueste.
2. Use una pequeña pipeta Pasteur de vidrio con una bombilla de látex para llenar una caja de Petri de 35 mm con agar fundido y arrastre a través de las pinzas a través del agar para comprobar su consistencia.
3. Cuando se puede empezar a ver el agar solidifique:
   1. La transferencia de la retina en la parte superior del agar.
   2. Use un trozo retorcido de Kimwipe para absorber el exceso de solución alrededor de la retina.
   3. Colocar 2-3 gotas de Agar directamente sobre la retina y poner rápidamente un cilindro de plástico en la retina para formar un muro alrededor de él. Después dejar agar fundido adicionales a los lados del cilindro de plástico, mientras que el centrado de la retina en el agar.
   4. La transferencia de la placa de Petri to un baño de agua helada para enfriar.
4. Después de aproximadamente 45 segundos quitar el tejido del baño de agua helada y el uso de un émbolo para extruir el agar bloque del cilindro de plástico, presionando por el lado más alejado de la retina.
5. Use la hoja de afeitar de un solo lado para cortar un pequeño bloque de agar que contiene la retina y el pegamento del bloque en su lugar contra el tope de agar en la platina.
6. La transferencia de la platina hasta la bandeja vibrante microtomo y se vierte el hielo frío HEPES Ames en la bandeja que permite el bloque con la retina a estar completamente sumergido.
7. Rebanadas de la retina con un espesor de ~ 200 micras se pueden cortar a la tasa máxima de hoja de vibración y una velocidad de hoja anterior conjunto de tal forma que tarda de 4 a 5 segundos para cortar a través de la retina en cada rebanada.
8. Use una hoja de bisturí N º 11 para quitar cada una rebanada útil a la vez
9. Rebanadas de mercancía que contenga la retina se colocan en cámaras de grabación y son cargados con anclas de corte con hilo de nylon cruzarlas. Los hilos de nylon mantenga pulsado el agar que rodea la retina, dejando en la retina sin obstáculos para las grabaciones.
10. La transferencia de la cámara de grabación a la platina del microscopio en posición vertical, cerca de la cortina y encienda la fuente de luz infrarroja para ver el corte en una cámara sensible al infrarrojo.

6. Grabación

1. Una vez que una buena tajada de retina (fotorreceptores intactos y con el ángulo de corte apropiado) se identifica iniciar la perfusión de la retina a un ritmo superior a 5 mL / min con los medios de comunicación climatizada de Ames que se calienta a 35 37 ° C y se equilibró con 5% de CO ₂ / 95% O _2.
2. Algunos daños en la superficie puede ser evidente debido al proceso de corte. Esta capa delgada de células por lo general se puede eliminar con una pipeta con una punta rota, y con suavidad chupando los cuerpos de las células muertas. Esto normalmente se revelan las células vivas por debajo. Identificar un cuerpo saludable de las células, cuya posición se encuentra en los estratos de interés.
3. Llene una micropipeta con la solución interna KAsp y aplicar positiva (hacia fuera) la presión a través de la punta de la pipeta, y bajar la punta de la pipeta en la cámara de grabación y hasta el nivel de la célula mediante un micromanipulador.
4. Mueva la punta de la pipeta de tal manera que los hoyuelos de la membrana celular, y aplicar suavemente negativa (hacia adentro) la presión para hacer un sello de alta resistencia. De células enteras modo se puede lograr mediante la aplicación de presión negativa para el electrodo de entrar en la célula.
5. Estimular el tejido de la retina mediante LEDs puede evocar respuestas a la luz.
6. Fotografía de la célula de la cual se realizó la grabación, evocando la fluorescencia de los fluoróforos en la solución de la pipeta interna.

7. Resultados representante

Figura 1. Aquí, la luz potenciales evocados de una adaptada a la oscuridad de neuronas retinianas de destellos de luz para aumentar la fuerza se muestran.

Figura 2. Imagen de fluorescencia de una rebanada de la retina donde las células se han llenado con el fluoróforo, Lucifer amarillo. Fluorescencia evocado muestra la morfología de las células de las cuales se hicieron las grabaciones de parches.

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Discusión

Grabación de sector a partir de las retinas de vertebrados se han hecho durante décadas ^1,2, y han tenido bastante éxito en la prestación de un mejor entendimiento de cómo los circuitos de la retina codifica la luz incidente. Las ventajas del corte con un micrótomo de vibración en lugar de hacerlo directamente con una hoja de afeitar es que las rodajas de la retina incurrir en un menor daño en la superficie. Con una pipeta de succión que es fácil de quitar estos daños y las células diana sano deba...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Borosilicate glass	Sutter Instrument Co.	B120-69-10
Polyethylene tubing	Intramedic	PE205
Agar	Sigma-Aldrich	A7002
Low gelling temp agarose	Sigma-Aldrich	A0701
Ames’ Medium	Sigma-Aldrich	A1420
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781