Патч зажим Recordings от мыши нейронов сетчатки в темно-адаптированной фрагмент подготовка

Резюме

Здесь мы опишем процедуру для получения темно-адаптированных ломтиками мыши сетчатки для электрофизиологических записей.

Аннотация

Наш визуальный опыт начинается, когда зрительного пигмента сетчатки в нашей фоторецепторов поглощает фотоны света энергию и инициирует каскад внутриклеточных событий, приведших к закрытию циклических нуклеотидов закрытых каналов в клеточной мембране. В результате изменения мембранного потенциала, в свою очередь приводит к сокращению количества нейромедиаторов релиз с обеих палочек и колбочек синаптических терминалов. Чтобы определить, насколько световых вызвало изменение мембранного потенциала фоторецептора приводит к течению активность в сетчатке, ученые сделали электрофизиологических записей из сетчатки подготовки ломтик за ^1,2 лет. В прошлом эти кусочки были вырезаны вручную с лезвием на ткани сетчатки, который прилагается к фильтровальной бумаге, а в последние годы один метод нарезки была разработана котором ткани сетчатки встраивается в странах с низким агар температуры гелеобразования и нарезанный в прохладном растворе с вибрирующий микротома ^3,4. Этот препарат производит сетчатки ломтики меньше повреждений поверхности и очень надежные световых вызвали ответы. Здесь документ как эта процедура может быть сделано при инфракрасном свете, чтобы избежать обесцвечивания зрительного пигмента.

протокол

1. Подготовка электродов

1. Подготовка записи и электродов сравнения, опуская их как в 1M NaCl и вождения 15V между ними с помощью 1 Гц синусоидальной волны для ~ 20 с
2. Сделать запись электродов использовании микропипетки съемник (Саттер инструменты Р-97). Для патч-пипеток использование боросиликатного стекла с внешним диаметром 1,2 мм и внутренним диаметром 0,69 мм (Саттер Instruments, Cat # B120-69-10). Мера последовательное сопротивление через кончик электрода. На основании размера клетки-мишени выбрать диаметр кончика пипетки, для клеточных тел ~ 20 мкм в диаметре использовать ~ 5 МОм для сотовых тел ~ 5 мкм в диаметре использовать ~ 12 МОм.
3. Подготовка земли / электродов сравнения. Использование шприца заполните небольшую трубы полиэтиленовые разделе (Intramedic, PE205) с 1 мМ NaCl, что включает в себя 3,5% агар (Sigma, Cat # A7002) в 1 М NaCl. Поместите этот агар мост через Ag / AgCl электродом сравнения.

2. Подготовка решений

1. Внешнее решение ванна, 'средах, содержащих бикарбонат (1 л): 1 бутылка Эймса Ames среднего (Sigma, Cat # A1420), 1,9 г NaHCO _3, 7 мл пенициллина-стрептомицина (Sigma, Cat # P0781) для предотвращения бактериальных роста. Отрегулируйте осмолярности до ~ 280 мОсм.
2. Нарезки решение, 'средах, содержащих рН буфера HEPES (1 л): 1 бутылка Эймса Ames Средний, 0,887 г NaCl, 2,38 г HEPES, 7 мл пенициллина-стрептомицина. Отрегулируйте рН до ~ 7,4 использованием 1М NaOH и / или 1М HCl. Отрегулируйте осмолярности до ~ 280 мОсм.
3. Калий-аспартата (K-Asp) пипетки внутреннее решение (в мм): 125 К-аспартата, 10 KCl, 10 HEPES, 5 НМГ-HEDTA, 0,5 ₂ CaCl, 1 ATP-Mg, 0,2 ГТФ-Mg, доводят рН до ~ 7.3 с НМГ-ОН, и осмолярность настроен на ~ 280 мОсм.
4. Агар обратного хода для стабилизации низкой температурой гелеобразования агарозном содержащие сетчатки (5% по весу), 7,5 г Агар (Sigma, Cat # A7002) плавится в 150 мл дН ₂ O.

3. День Эксперимент

1. Оттепель ~ 1,5 мл K-Asp внутреннее решение и флуорофора по вашему выбору из морозильной камеры. Развести флуорофора в соответствующей концентрации, которая должна быть определена опытным путем.
2. Налейте СМИ Эймс ', содержащий NaHCO ₃ (~ 200 мл) в светонепроницаемый контейнер для хранения, а затем поместить в ванну с водой (30-32 ° С) и равновесие с 5% CO ₂ / 95% O ₂ газ
3. Заполнить бутылку с ~ 110 мл СМИ Эймс ', содержащий HEPES, места на льду и равновесие со 100% O _2.
4. Положите оставшиеся средства массовой информации Эймса содержащей NaHCO ₃ в резервуаре нагревается в верхней части клетки Фарадея, и равновесие с 5% CO ₂ / 95% O ₂ газа. Парафильмом может быть использован для улавливания газов в пространстве над раствором.
5. Подготовка низкой температурой гелеобразования агарозы (3%) с добавлением 0,75 г (Sigma, Cat # A0701) до 25 мл СМИ Эймса с HEPES и теплом растворе при ~ 115 ° С для расплавления агарозы. Перемешать, пока раствор не ясно, без пузырьков, и хранить на водяной бане (~ 42 ° C).
6. Заполните записи пипетки с K-Asp внутреннее решение и проверить наконечник сопротивления.

4. Начать эксперимент

1. Эвтаназии мыши и быстро удалить глаза использованием изогнутых ножниц. Инфракрасные очки должны использоваться для всех процедур, чтобы предотвратить обесцвечивание зрительного пигмента.
2. Место глазами на кусочек фильтровальной бумаги, чтобы предотвратить их прокат, и с помощью тонкой двухсторонние лезвия, делают разрез в роговице, удерживая глаз с щипцами.
3. Как только глаз проколот, передачи их глаза в чашку заполнены СМИ Эймса.
4. Использование щели в роговице в качестве отправной точки, маленькие ножницы используются отрезать остальные части роговицы, после чего хрусталик и стекловидное могут быть удалены. Будьте осторожны, что сетчатка остается прикрепленной к наглазник, и хранить наглазник в темноте при 32 ° С в средствах массовой информации Эймса уравновешенную 5% CO ₂ / 95% O _2.

5. Нарезки

1. Hemisect одним из наглазники и диссоциируют сетчатки от пигментного эпителия сетчатки. Удаление краев сетчатки, чтобы ткань лежать.
2. Используйте маленькую стеклянную пипетку Пастера с латексом лампу, чтобы заполнить 35 мм чашки Петри с расплавленным агаром, и перетащить через щипцов через агар, чтобы проверить его консистенцию.
3. Когда вы можете начать видеть агар укрепить:
   1. Передача сетчатки к верхней части агара.
   2. Использование витой кусок Kimwipe, чтобы поглотить избыток раствора вокруг сетчатки.
   3. Место 2-3 капли агара непосредственно на сетчатку и быстро разместить пластмассовый цилиндр через сетчатку, чтобы сформировать вокруг него стены. Затем капельно дополнительные расплавленный агар вниз стороны пластмассовый цилиндр в то время как центрирование сетчатки в агар.
   4. Передача чашку Петри то ванну ледяной воды для охлаждения.
4. Через ~ 45 секунд удалить ткань из ванны водяного льда и использовать поршень для выдавливания агар блок из пластмассовый цилиндр, толкая со стороны дальней от сетчатки.
5. Используйте односторонним лезвием бритвы вырезать небольшой блок агара, содержащего сетчатки и суперклей блок на место против агар обратного хода на образец диска.
6. Передача образца диска на вибрирующих микротома поднос и залить ледяной Эймс HEPES в лоток позволяет блоку с сетчаткой, чтобы быть полностью погружать в воду.
7. Сетчатки ломтиками толщиной около 200 мкм могут быть сокращены в вибрирующие лезвия максимальная скорость и скорость движения лезвия множество, что это занимает от 4 до 5 секунд, чтобы прорваться через сетчатку на каждый ломтик.
8. Используйте № 11 лезвие скальпеля, чтобы удалить все использовать один ломтик в то время,
9. Хорошо ломтиками содержащие сетчатки помещаются в записи камер и взвешиваются вниз с ломтиком якоря с нейлоновым темы пересекая их. Нейлон темы удерживать агар окружающей сетчатки, в результате чего сетчатка беспрепятственный для записей.
10. Передача записи камеры в стадии прямой микроскоп, рядом занавеску и включите источник инфракрасного света, чтобы посмотреть на срез инфракрасных чувствительных к камере.

6. Запись

1. После хорошего сетчатки срез (с неповрежденными фоторецепторов и соответствующий угол резки) отождествляется начать перфузии сетчатки в размере более 5 мл / мин с подогревом СМИ Эймса, который нагревается до 35 37 ° С и уравновешенную 5% CO ₂ / 95% O _2.
2. Некоторые повреждения поверхности могут быть очевидными из-за нарезки процесса. Как правило, это тонкий слой клеток можно удалить с помощью пипетки со сломанным наконечником, и мягко отсоса трупы клетки. Это, как правило, показывают живые клетки под ними. Определить здоровых клеток организма, положение которых находится в слоях интерес.
3. Заполните микропипетки с KAsp внутреннее решение и применить положительный (внешнее) давление через кончик пипетки и ниже кончика пипетки в записи камеры и вниз до уровня ячейки с помощью микроманипулятора.
4. Перемещение пипетки таким образом, что ямочки клеточной мембраны, а также применять нежные отрицательной (внутрь) давление, чтобы сделать печать высокой стойкости. Всего-клеточные режим может быть достигнуто путем применения отрицательного давления на электрод, чтобы ворваться в клетку.
5. Стимулирование ткани сетчатки использованием светодиодов может вызвать ответы на свете.
6. Фотография клетка, из которой была сделана запись, вызывая флуоресценции флуорофора в пипетку внутреннее решение.

7. Представитель Результаты

Рисунок 1. Здесь, светло-вызванных потенциалов темно-адаптированной сетчатки нейрона на вспышки света увеличения прочности показано на рисунке.

Рисунок 2. Флуоресценция картинку из сетчатки срез, где клетки были заполнены флуорофора, Люцифер желтый. Вызванные флуоресценции показывает морфологии клетки, из которых патч записи были сделаны.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Фрагмент записи с сетчатки позвоночных были сделаны десятилетиями ^1,2, и были весьма успешны в обеспечении более глубокого понимания того, как схема сетчатки кодирует падающего света. Преимущества резки с вибрирующим микротома, а не непосредственно с лезвием в том, что сетчатки л?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Borosilicate glass	Sutter Instrument Co.	B120-69-10
Polyethylene tubing	Intramedic	PE205
Agar	Sigma-Aldrich	A7002
Low gelling temp agarose	Sigma-Aldrich	A0701
Ames’ Medium	Sigma-Aldrich	A1420
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781