Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados

Resumo

Aqui nós descrevemos um procedimento para a geração de adaptação ao escuro fatias da retina do rato para gravações eletrofisiológicas.

Resumo

Nossa experiência visual é iniciada quando o pigmento visual em nossa fotorreceptores da retina absorve fótons de energia luminosa e inicia uma cascata de eventos intracelulares que levam ao encerramento do cíclica de nucleotídeo-gated canais na membrana da célula. A mudança resultante no potencial da membrana leva, por sua vez a redução na quantidade de liberação de neurotransmissores dos dois rod e terminais de cone sináptica. Para medir o quanto a mudança de luz evocada em fotorreceptoras potencial de membrana leva a atividade a jusante na retina, os cientistas fizeram gravações eletrofisiológicas das preparações fatia da retina para ^1,2 décadas. No passado, essas fatias foram cortadas manualmente com uma lâmina de barbear no tecido da retina que é anexado ao papel de filtro; nos últimos anos um outro método de corte tem sido desenvolvida através do qual o tecido da retina é incorporado em agar baixa temperatura de gelificação e cortados em solução legal com um vibrando micrótomo ^3,4. Esta preparação produz fatias da retina com menos danos superficiais e muito robusto respostas luz evocado. Aqui nós documento como esse procedimento pode ser feito sob a luz infravermelha para evitar a descoloração do pigmento visual.

Protocolo

1. Eletrodos preparar

1. Preparar os eletrodos de registro e referência por imersão-los tanto em NaCl 1M e dirigir 15V entre eles usando uma onda senoidal 1 Hz ~ 20 para s.
2. Fazer a gravação usando eletrodos de um puxador de micropipeta (Sutter Instruments P-97). Para patch-pipetas usar um vidro de borosilicato com um diâmetro exterior de 1,2 mm e um diâmetro interno de 0,69 mm (Sutter Instruments, Cat # B120-69-10). Medir a resistência em série com a ponta do eletrodo. Com base no tamanho das células-alvo escolher uma ponteira de diâmetro, por corpos celulares ~ 20 mM em uso diâmetro ~ 5 mohms de corpos celulares ~ 5 mm de diâmetro em uso ~ 12 mohms.
3. Prepare solo / eletrodos de referência. Usando uma seringa encher um tubo de polietileno pequena seção (Intramedic, PE205) com 1 mM NaCl que inclui Agar 3,5% (Sigma; Cat # A7002) em NaCl 1M. Coloque esta ponte agar sobre o eletrodo de referência Ag / AgCl.

2. Soluções preparar

1. Solução de banho externo, "a mídia contendo bicarbonato (1 L): 1 garrafa de Ames 'Ames Médio (Sigma; Cat # A1420), 1,9 g de NaHCO _3, 7 mL de penicilina-estreptomicina (Sigma; Cat # P0781) para evitar bacteriana crescimento. Ajuste osmolaridade para ~ 280 mOsm.
2. Corte solução, "a mídia contendo o HEPES pH tampão (1 L): 1 garrafa de Ames 'Ames Médio, 0,887 g de NaCl, 2,38 g de HEPES, 7 mL de penicilina-estreptomicina. Ajustar o pH a 7,4 com 1M ~ NaOH e / ou 1M HCl. Ajuste osmolaridade para ~ 280 mOsm.
3. Aspartato de potássio (K-Asp) pipeta solução interna (em mM): 125 K-aspartato, 10 KCl, 10 HEPES, 5 NMG-HEDTA, 0,5 CaCl _2, 1 ATP-Mg, 0,2 GTP-Mg, pH é ajustado para ~ 7.3 com NMG-OH, e osmolaridade é ajustada a ~ 280 mOsm.
4. Recuo Agar para estabilizar a temperatura baixa gelificação agarose contendo a retina (5% em peso), 7,5 g de Agar (Sigma; Cat # A7002) derretido em 150 ml de dH ₂ O.

3. Dia da Experiência

1. Descongelar ~ 1,5 mL de K-Asp Solução Interna e do fluoróforo de sua escolha a partir de freezer. Diluir o fluoróforo à concentração adequada, que deve ser determinada empiricamente.
2. Despeje media Ames 'contendo NaHCO ₃ (~ 200 mL) para o recipiente de armazenamento à prova de luz e coloque em banho-maria (30-32 ° C) e equilibrar com 5% de CO ₂ / 95% O ₂ gás
3. Preencha frasco com 110 mL ~ dos meios de comunicação de Ames contendo HEPES, colocar no gelo e se equilibram com 100% de O _2.
4. Coloque o restante Ames 'mídia contendo NaHCO ₃ em um reservatório aquecido em cima da gaiola de Faraday, e se equilibram com 5% de CO ₂ / O ₂ 95% de gás. Parafilme podem ser usados ​​para prender o gás no espaço acima da solução.
5. Prepare a baixa temperatura de gelificação agarose (3%) pela adição de 0,75 g (Sigma; Cat # A0701) a 25 mL dos meios de comunicação de Ames com HEPES e aquecer a solução em ~ 115 ° C para derreter a agarose. Mexa até que a solução clara, sem bolhas, e armazenar em um banho de água (~ 42 ° C).
6. Preencha uma pipeta de gravação com a solução de K-Asp internos e verificar a resistência de ponta.

4. Experimente começar

1. Euthanize o mouse e rapidamente remover os olhos com uma tesoura curva. Óculos infravermelhos deve ser usado para todos os procedimentos para prevenir branqueamento do pigmento visual.
2. Coloque os olhos em um pedaço de papel de filtro para os impedir de rolamento, e usando uma lâmina de dupla face fina, fazer uma fenda na córnea, mantendo o olho com a pinça.
3. Tão logo o globo ocular é perfurada, a transferência que olho em um prato cheio com a mídia de Ames.
4. Usando a régua na córnea como um ponto de entrada, tesoura pequena são usados ​​para cortar as porções restantes da córnea, após o qual a lente e vítreo pode ser removido. Tenha cuidado para que a retina permanece preso à ocular, e armazenar a ocular no escuro a 32 ° C nos meios de comunicação equilibrada com 5% de CO ₂ / 95% O ₂ Ames.

5. Corte

1. Hemisect uma das oculares e dissociar a retina do epitélio pigmentar da retina. Retire as bordas da retina para permitir que o tecido para ficar na posição horizontal.
2. Use um pequeno vidro pipeta Pasteur com um bulbo de látex para preencher uma 35 milímetros placa de Petri com agar derretido, e arraste a pinça através através do ágar para testar a sua consistência.
3. Quando você pode começar a ver o ágar solidificar:
   1. Transferência da retina para o topo do ágar.
   2. Use um pedaço torcido de Kimwipe para absorver o excesso de solução em torno da retina.
   3. Coloque 2-3 gotas de Agar diretamente na retina e rapidamente colocar um cilindro de plástico sobre a retina para formar uma parede em torno dela. Então por gotejamento agar derretido adicionais abaixo dos lados do cilindro de plástico, enquanto centrando a retina dentro do ágar.
   4. Transferir o prato Petri to banho de água gelada para esfriar.
4. Depois de ~ 45 segundo remover o tecido do banho-maria de gelo e use um êmbolo para expulsar o ágar bloco para fora do cilindro de plástico, empurrando a partir do lado mais distante da retina.
5. Use a lâmina de um lado para cortar um pequeno bloco de ágar contendo a retina e superglue o bloco no lugar contra o recuo de ágar no disco espécime.
6. Transferência do disco de amostra para a bandeja micrótomo vibrando e despeje HEPES gelada Ames na bandeja permitindo que o bloco com retina para ser totalmente submerso.
7. Fatias da retina com uma espessura de ~ 200 mM pode ser cortado à taxa máxima de lâmina de vibração e uma velocidade de lâmina para a frente esse conjunto que leva de 4 a 5 segundos para cortar a retina em cada fatia.
8. Use uma lâmina de bisturi n º 11 para remover cada uma fatia útil de cada vez
9. Fatias bom contendo retina são colocados em câmaras de gravação e são sobrecarregados com âncoras fatia com fios de nylon cruzá-los. Os fios de nylon mantenha o agar em torno da retina, deixando a retina desobstruídas para as gravações.
10. Transferência da câmara de gravação para o estágio do microscópio na posição vertical, fechar a cortina e ligar a fonte de luz infravermelha para ver a fatia em uma câmera infravermelha e minúsculas.

6. Gravação

1. Uma vez que uma fatia boa da retina (com fotorreceptores intactas e do ângulo de corte adequado) é identificado começar a perfusão da retina a uma taxa superior a 5 mL / min com a mídia Ames aquecida ", que é aquecida a 35 ° C e 37 equilibrada com 5% de CO ₂ / 95% O _2.
2. Alguns danos na superfície pode ser aparente devido ao processo de corte. Esta camada fina de células geralmente pode ser removido com uma pipeta com uma ponta quebrada, e gentilmente sugando os corpos de células mortas. Este será tipicamente revelam células vivas embaixo. Identificar um corpo da célula saudável, cuja posição está localizado nos estratos de interesse.
3. Preencher uma micropipeta com a solução KAsp interna e aplicar pressão (para fora) positiva através da ponta da pipeta, e inferior a ponta da pipeta na câmara de gravação e para baixo ao nível da célula usando um micromanipulador.
4. Mova a ponta da pipeta de tal forma que as covinhas da membrana celular, e aplicar pressão suave (para dentro) negativa a fazer um selo de alta resistência. De célula inteira modo pode ser alcançado através da aplicação de pressão negativa para o eletrodo para invadir a célula.
5. Estimular o tecido da retina usando LEDs podem evocar respostas à luz.
6. Fotografia da célula a partir do qual a gravação foi feita evocando fluorescência do fluoróforo na solução da pipeta interna.

7. Resultados representante

Figura 1. Aqui, a luz-potenciais evocados de um dark-adaptados neurônio da retina para flashes de luz de aumentar a força são mostrados.

Figura 2. Imagem de fluorescência de uma fatia da retina onde as células foram preenchidas com o fluoróforo, Lucifer Yellow. Fluorescência evocado mostra a morfologia das células a partir do qual foram feitas as gravações de patch.

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Discussão

Gravação fatia de retinas vertebrados têm sido feitas há décadas ^1,2, e têm sido bastante bem sucedidos em fornecer uma compreensão mais profunda de como o circuito da retina codifica luz incidente. As vantagens do corte em micrótomo vibrando em vez de diretamente com uma lâmina de barbear é que as fatias da retina incorrer menos danos na superfície. Com uma pipeta de sucção é fácil de remover esse dano e células-alvo saudável logo abaixo da superfície que possuem conectividade no circuito d...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Borosilicate glass	Sutter Instrument Co.	B120-69-10
Polyethylene tubing	Intramedic	PE205
Agar	Sigma-Aldrich	A7002
Low gelling temp agarose	Sigma-Aldrich	A0701
Ames’ Medium	Sigma-Aldrich	A1420
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781