Inmunocitoquímica: células madre neurales humanas

Resumen

Inmunocitoquímica es un poderoso método para determinar la presencia, localización subcelular, y la abundancia relativa de un antígeno de interés en células cultivadas. Este protocolo presenta una forma fácil de seguir una serie de medidas que permitan una para conservar los anticuerpos y sacar el máximo provecho de su coloración.

Resumen

Inmunocitoquímica es un método muy eficaz y sencillo modo leal, para determinar la presencia, localización subcelular, y la abundancia relativa de un antígeno de interés, por lo general una proteína, en células cultivadas. Este protocolo presenta una forma fácil de seguir una serie de medidas que permitirá a los investigadores para conservar anticuerpos primarios y secundarios al obtener alta calidad, de calidad reproducible y datos cuantitativos de sus manchas. Hay dos aspectos de este protocolo que ayuda a conservar el volumen de los anticuerpos necesarios para la tinción. Por un lado, las células se cultivaron en cubreobjetos pequeños y circulares que se colocan en pocillos de una placa de cultivo de tejidos. Después de la fijación, las células en cubreobjetos se puede quitar de los pozos de la placa. Para la tinción de anticuerpos, el cubreobjetos con las células se invierte en una pequeña gota de solución de anticuerpos en parafina y se cubre con una segunda pieza de parafilm para evitar que se sequen. El uso de este método, sólo aproximadamente 25 l de solución de anticuerpos que se necesita para cada cubreobjetos (o muestra) a teñir. Este protocolo describe la inmunotinción de los derechos humanos madre neurales / células precursoras (hNSPCs), pero se puede utilizar para muchos tipos de células.

Protocolo

Día 1: Preparación de las células Cubreobjetos de vidrio alemán y Siembra

Nota: cubreobjetos de vidrio alemán son a menudo mejores para el cultivo de células madre neuronales primarias y las neuronas. Usamos el protocolo de limpieza siguientes para mejorar la adhesión celular y la difusión. Cubreobjetos posición en una parrilla pequeña que permitirá el acceso de líquido a ambos lados del cubreobjetos. En primer lugar, los cubreobjetos se incuban en el 1% Liquinox durante 10 minutos, seguido de 3 lavados con agua destilada. Asegúrese de que no quedan burbujas de jabón. A continuación, se desliza incubar en HCl 1 M durante 30 minutos, seguido de 3 lavados con agua destilada. Cubreobjetos seco a 65 ° C durante la noche. Transferencia de cubreobjetos para un plato de cristal y autoclave para esterilizar.

1. En una campana de cultivo de tejidos, lugar cubreobjetos estéril en una placa y de tamaño adecuado.
   
   
2. Cubreobjetos capa con la laminina para la adhesión celular. Incubar cubreobjetos de 10 mg / ml poli-D-lisina (PDL) en agua destilada durante 5 minutos a temperatura ambiente. Quitar los cubreobjetos PDL y se incuban en 20 mg / ml en EMEM laminina durante 4 horas, o durante la noche, en un 37 ° C tejidos incubadora de la cultura.
   
   
   
   1. Nota: Consulte la pases Humanos troncales nerviosas artículo células ( https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) y el conteo Humanos troncales nerviosas artículo células ( https://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262 ) para aprender a volver a suspender y contar hNSPCs.
      
      
3. Enjuague laminina recubierto cubreobjetos con PBS y las células de las semillas en cada cubreobjetos que contienen y en una cierta densidad (que a menudo utilizan una densidad inicial de placas de 100.000-300.000 células / ml para las células que están jugando por inmunotinción).
   
   
4. Colocar la placa en 37 ° C incubadora de cultivo de tejidos y permiten que las células se adhieran a cubreobjetos (por lo general un mínimo de 4 horas es necesario).

Día 2: Fijación, permeabilizante, bloqueo, y añadir el anticuerpo primario de las células

Nota: Usamos los siguientes fijador de paraformaldehído al 4% para preservar la morfología celular. La receta incluye una transición para permitir que el pH de paraformaldehído para ir a la solución. Nosotros preferimos este método en lugar del uso de calor para disolver paraformaldehído, ya temperaturas más altas pueden conducir a la generación de ácido fórmico, lo que puede aumentar la tinción de fondo cuando se utiliza la fluorescencia. Algunos componentes de la ayuda fijador para preservar la estructura del citoesqueleto _(MgCl2 y EGTA), mientras que otros ayudan a mantener la morfología general (sacarosa).

4% de paraformaldehído fijador de células

Reactivos y pasos:	Cantidad de 100 ml de fijador:
MilliQ agua	75 ml
Paraformaldehído (peso en la campana extractora de humos)	4 g
NaOH 10N, agitar y añadir gota a gota hasta que la solución limpia	según sea necesario
PBS 10 veces	10 ml
MgCl2 1M	0,5 ml
0,5 M EGTA	2 ml
Sacarosa	4 g
HCl 6N, se valorarán a pH 7,4	según sea necesario
MilliQ agua	llevar a 100 ml
Almacenar a 4 ° C durante un máximo de 1 semana. Calentar a 37 ° C antes de su uso

1. En el banco, sacar el papel y agregar fijador precalentado. Se incuba durante 5-15 minutos (dependiendo del antígeno a detectar, por lo general el uso de 10 minutos). Realice este y los siguientes pasos a temperatura ambiente.
   
   
2. Deseche el fijador en un recipiente adecuado, ya que muchas instituciones manejan paraformaldehído como residuos peligrosos. Lavar las células 3 veces con PBS, 5 minutos cada vez. Cuando la eliminación de las soluciones de las células, tenga cuidado de que la succión no se seque las células. Además, siempre tiene la siguiente solución a mano para añadir a las células antes de retirar la solución que cubre las células que no se dejan secar.
   
   
3. Si el antígeno de interés dentro de la célula, la membrana de la célula debe ser permeable para permitir la entrada de los anticuerpos. Para permeabilizar las células, utilice un nuevo 0,3% Triton X-100 en PBS solución. Pipeta lentamente debido a Triton es viscoso, y asegúrese de que el detergente se disuelva por completo en PBS antes de añadir a las células. Permeabilizar las células durante 5 minutos, seguido por el lavado de las células 3 veces con PBS, 5 minutos cada vez.
   
   
4. Las células deben ser tratadas con un agente de bloqueo para evitar la unión no específica del anticuerpo. Usamos albúmina de suero bovino (BSA) como un agente de bloqueo. La solución de bloqueo se realiza mediante la disolución de 5% de BSA en PBS (en un agitador rotatorio o porque se necesita tiempo para disolver) y luego filtrar el sollución con un filtro de jeringa de 0,45 micras. Bloquear las células de BSA / PBS solución al 5% durante 1 hora a temperatura ambiente.

Diluir el anticuerpo primario (que es de esperar específicos para la proteína de interés) a una concentración pre-determinado en el 1% BSA / PBS (preparado por dilución de un 5% BSA / PBS). Lugar diluye el anticuerpo primario (30 l por cubreobjetos de 25 mm, 20 l por cubreobjetos de 18 mm, 15 l por cubreobjetos de 12 mm) sobre una placa de vidrio cubierta con parafilm. Levante el cubreobjetos con células fijadas, invertir de tal manera que las células boca abajo, y lo pondré sobre la solución de anticuerpos de manera que las células están en contacto con el anticuerpo. Coloque una tira de Parafilm segundos sobre toda la estructura. Incubar a 4 ° C durante la noche.

Día 3: Lavado, incubación del anticuerpo secundario, las manchas nucleares y de montaje

1. Retire con cuidado la tira de Parafilm superior y recoger el cubreobjetos, invertirlo, y vuelva a colocarlo en la placa con PBS en cada pozo de lava para que las células están mirando hacia arriba.
   
   
2. Lavar las células 3 veces con PBS, 5 minutos cada vez.
   
   
3. Elegir un anticuerpo secundario que detectan el anticuerpo primario, por ejemplo, si el anticuerpo primario se realizó en un conejo, la secundaria de anticuerpos IgG de conejo deben reconocer. Tenga cuidado para que coincida también el isotipo de anticuerpos (IgG, IgM, etc.) Si el uso de múltiples anticuerpos primarios, asegúrese de que sean de diferentes especies o isotipos, y un plan para detectar con diferentes marcadores adjunta a la secundaria de anticuerpos. Por ejemplo, podría usar un acoplamiento secundario anti-conejo de un fluoróforo rojo junto con un anti-ratón secundaria a un fluoróforo verde. Se incuban las células en la solución de anticuerpo secundario diluido a una concentración adecuada en el 1% BSA durante 2 horas en la oscuridad a temperatura ambiente, utilizando la misma técnica que para la primaria (medidas que no aparecen en el video). El volumen de secundaria de anticuerpos necesarios para la incubación puede ser ligeramente mayor que para el anticuerpo primario al secundario, si se almacena como una solución de glicerol (40 l por cubreobjetos de 25 mm, 30 l por cubreobjetos de 18 mm, 25 l por cubreobjetos de 12 mm) .
   
   
   • Nota: Si utiliza moléculas fluorescentes para visualizar la secundaria de anticuerpos, la muestra debe ser protegido de la luz una vez que el anticuerpo secundario se ha añadido. Incubar en la oscuridad, o en una placa de aluminio cubiertos.
     
     
4. Retire con cuidado el cubreobjetos de la parafina como se ha descrito para el anticuerpo primario. Lavar las células dos veces con PBS, 5 minutos cada vez, seguida de una incubación de 1 minuto en 2 mg / ml Hoechst tinción nuclear diluido en PBS (si contratinción nuclear se prefiere). Si la mancha es antigua Hoechst y la señal es demasiado débil, puede aumentar el tiempo de incubación y / o la concentración. Después de la incubación con Hoechst, lavar una vez con PBS durante 5 minutos.
   
   
5. Los cubreobjetos se debe montar en un portaobjetos con medio de montaje para su visualización en el microscopio. En los casos en que se utiliza una molécula fluorescente para la visualización de la secundaria de anticuerpos, los medios de comunicación de montaje debe contener agentes para reducir al mínimo photobleaching. Usamos Vectashield como medio de montaje para fluorescencia. Coloque una gota de tamaño apropiado de Vectashield sobre un portaobjetos de microscopio (12 l por cubreobjetos de 25 mm, 6 l por cubreobjetos de 18 mm, 3 l por cubreobjetos de 12 mm).
   
   
6. Recoja cuidadosamente el portaobjetos y enjuagar la parte posterior con agua destilada para eliminar las sales (de la PBS). Frote el exceso de agua en un Kimwipe o toalla de papel, y se echó en la caída de Vectashield con células hacia abajo. Coloque el cubreobjetos en un ángulo y dejar descender lentamente para evitar burbujas de aire atrapado. Etiqueta de la diapositiva con la fecha y cualquier otra información de la muestra.
   
   
7. Permita que se desliza con cubreobjetos para secar (en la oscuridad) de succión después de Vectashield exceso de alrededor del borde cubreobjetos. Los bordes cubreobjetos ahora se pueden sellar con esmalte de uñas, si lo desea (especialmente útil si cubreobjetos se pueden ver en un microscopio invertido). Por lo general, nuestra tienda de diapositivas en un congelador a -20 ° C.

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Discusión

Este protocolo describe un procedimiento de inmunotinción para hNSPCs que minimiza el volumen de los anticuerpos necesarios y da la tinción de células confiable. El procedimiento descrito es el mejor de los antígenos intracelulares, pero puede ser modificado para teñir las moléculas de la superficie celular o para mejorar la tinción del citoesqueleto.

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips	Tool	Carolina Biological	WW-63-3029	12,15,18, 22, 25 mm coverslips available
Liquinox phosphate-free detergent	Reagent	Sigma-Aldrich	Z273279	very viscous
Poly-D-lysine hydrobromide	Reagent	Sigma-Aldrich	P7280
Laminin, natural mouse	Reagent	Invitrogen	23017-015
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
24 well plate	Tool	Fisher Scientific	08-772-1
Triton X-100	Reagent	Fisher Scientific	BP151-500	very viscous
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	P6148	potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form
Bovine Serum Albumin, IgG-free	Reagent	Jackson ImmunoResearch	001-000-161
H–chst 33342	Reagent	Invitrogen	H-1399
Vectashield	Reagent	Vector Laboratories	H-1000	viscous