İmmünositokimya: İnsan Sinir Kök Hücreler

Özet

İmmünositokimya varlığı, hücre içi lokalizasyonu ve kültür hücreleri ilgi antijen göreceli bolluk belirlemek için güçlü bir yöntemdir. Bu protokol sunan, kolay takip serisi bir antikorlar korunması ve boyama en iyi şekilde almak için sağlayacak adımlar.

Özet

İmmünositokimya olup olmadığının belirlenmesi için çok güçlü ve oldukça basit bir yöntemi, hücre içi lokalizasyonu ve faiz, en yaygın kültür hücrelerinde protein, antijen göreceli bolluk. Bu protokol sunan, kolay takip onların boyama, yüksek kalite, tekrarlanabilir nitel ve nicel veri alırken araştırmacılar primer ve sekonder antikorlar tasarrufu sağlayacak adımları bir dizi. Bu protokolün boyanması için gerekli antikor hacminin korunmasına yardımcı iki yönü vardır. Biri için, hücrelerin doku kültürü plaka kuyulara yerleştirilen küçük, yuvarlak lamelleri yetiştirilmektedir. Fiksasyon sonra, lamelleri hücreleri plaka kuyulardan silinebilir. Antikor boyama, hücre ile lamel parafilm antikor çözüm küçük bir damla üzerine ters ve parafilm kurumasını önlemek için ikinci bir parça ile kaplıdır. Bu yöntemi kullanarak, sadece antikor çözüm ~ 25 ul boyanmış her lamel (ya da örnek) için gereklidir. Bu protokol, insan sinir kök / prekürsör hücrelerinin (hNSPCs) immün açıklar, ama birçok diğer hücre türleri için kullanılabilir.

Protokol

1. Gün: Alman Cam lameller hazırlanması ve Seeding Hücreler

Not: Alman cam lamelleri genellikle kültür birincil sinir kök hücreleri ve nöronlar için tercih edilir. Biz hücre yapışması ve yayılmasını geliştirmek için aşağıdaki temizleme protokolünü kullanır. Lamel her iki taraf için sıvı erişim sağlayacaktır küçük bir raf pozisyon lamelleri. İlk olarak, 10 dakika boyunca% 1 Liquinox inkübe lamelleri, deiyonize su ile 3 yıkar. Sabun köpükleri kalır emin olun. Sonra, 30 dakika boyunca inkübe fişleri 1M HCl, deiyonize su ile 3 yıkar. Kuru lamelleri 65 ° C geceleme. Sterilize etmek için bir bardak çanak ve otoklav lamelleri aktarın.

1. Bir doku kültürü kaputu, uygun büyüklükte bir plaka steril lamelleri yerleştirin.
   
   
2. Hücre adezyon laminin ile Coat lamelleri. 10 mg / 5 dakika oda sıcaklığında ml steril su poli D-Lizin (PDL) inkübe edin lamelleri. 37 ° C doku kültürü inkübatör, bir gecede 4 saat, ya da için EMEM de 20 mikrogram / ml laminin PDL ve inkübe lamelleri çıkarın.
   
   
   
   1. Not: Pasajlanması İnsan Nöral Kök Hücreler makale (bakın https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) ve Sayım İnsan Nöral Kök Hücreler makale ( https://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262 hNSPCs tekrar süspansiyon ve saymak nasıl öğrenmek için).
      
      
3. Her lamel içeren belirli bir yoğunluk (genellikle immün için kaplama olduğunu hücreler için 100,000-300,000 hücre / ml 'lik bir başlangıç ​​kaplama yoğunluğu), laminin PBS ve tohum hücreleri ile kaplı lamelleri durulayın.
   
   
4. 37 Place plaka hücreleri lamelleri (genellikle gerekli olan en az 4 saat) bağlı ° C doku kültürü kuvöz ve izin verir.

2. Gün: Sabitleme, Permeabilizing, engelleme ve Hücreler İlköğretim Antikor ekleme

Not: Biz hücre morfolojisi korumak için aşağıdaki% 4 paraformaldehid fiksatif kullanın. Tarifi paraformaldehid çözüm içine gitmek için izin pH geçiş içerir. Formik asit, floresan kullanırken arka plan boyama artırabilir nesil yüksek sıcaklıklarda yol açabilir, çünkü bu yöntem yerine paraformaldehid çözmek için ısı kullanımı tercih ederler. Diğerleri genel morfolojisi (sukroz) korumak için yardım ederken fiksatif yardım bazı bileşenleri, iskelet yapısı (MgCl ₂ ve EGTA) korumak için.

Hücreler için% 4 Paraformaldehit Sabitleme

Reaktifler ve adımları izleyin:	100 ml için sabitleştirici Miktarı:
MilliQ su	75 ml
Paraformaldehit (davlumbaz dışarı tartmak)	4 g
10N NaOH, karıştırın ve çözüm netleşene kadar damla damla ekleyin	gerektiği gibi
10X PBS	10 ml
1M MgCl 2	0.5 ml
0.5 M EGTA	2 ml
Sakaroz	4 g
6N HCl, pH 7.4 ile titre	gerektiği gibi
MilliQ su	100 ml getirmek
1 hafta kadar 4 ° C'de saklayın. 37 sıcak ° C kullanmadan önce

1. Bankta, medyayı çıkartın ve prewarmed fiksatif eklemek. 5-15 dakika (antijen tespit edilmesi bağlı olarak, biz genellikle 10 dakika) inkübe edin. Bu ve oda sıcaklığında aşağıdaki adımları uygulayın.
   
   
2. Pek çok kurum, tehlikeli atık olarak paraformaldehid sapı gibi, uygun bir kap içine fiksatif atın. Hücreleri PBS ile 3 kez, 5 dakika, her zaman yıkayınız. Hücrelerin çözüm çıkarırken, emme hücrelerin kurumasına olmadığını dikkatli olun. Ayrıca, her zaman kat onları böylece hücreleri kurumaya bırakılır değildir ki çözüm çıkarmadan önce hücre eklemek yandan sonraki çözüm var.
   
   
3. Ilgi antijen, hücre zarı, hücre içinde antikor girişine izin geçirgen hale gerekir ise. Hücreler permeabilize için, PBS içinde taze% 0.3 Triton X-100 çözümü kullanın. Pipet yavaş Triton viskoz, ve deterjanın tamamen hücrelere eklemeden önce PBS içinde çözülür emin olun çünkü. PBS, 5 dakika her zaman hücreleri 3 kez yıkanarak 5 dakika hücreleri, Permeabilize.
   
   
4. Hücreler non-spesifik antikor bağlanma önlemek için engelleyici bir ajan ile tedavi edilmelidir. Biz (BSA) engelleyici bir ajan olarak sığır serum albumin kullanın. (Bunu çözmek için zaman alır, çünkü bir rocker veya rotator) engelleme çözüm PBS% 5 BSA eriterek sonra sol filtreleme0.45 mikron şırınga filtresi ile ution. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 5 BSA / PBS çözüm hücrelerin engelleyin.

Primer antikor (umarım özel ilgi protein)% 1 önceden belirlenmiş bir konsantrasyona seyreltilir BSA / PBS (% 5 BSA / PBS seyreltme tarafından hazırlanan). Yeri parafilm ile kaplanmış bir cam plaka üzerinde birincil antikor (25 mm lamel başına 30 ul, 18 mm lamel başına 20 ul, 12 mm lamel başına 15 ul) seyreltilir. Hücre aşağı yüz, ve böylece hücrelerin antikor ile temas antikor çözüm üzerinde yattığını, invert sabit hücreleri ile lamel Pick up. Tüm yapı üzerinde ikinci bir parafilm şeridi yerleştirin. 4 ° C gece boyunca inkübe edin.

3. Gün: Yıkama, İkincil Antikor Kuluçka, Nükleer Leke ve Montaj

1. Dikkatlice hücreler yukarı bakacak şekilde üst parafilm şerit kaldırmak ve lamel pick up, ters ve her iyi yıkama için PBS ile plaka içine geri koyun.
   
   
2. Hücreleri PBS ile 3 kez, 5 dakika, her zaman yıkayınız.
   
   
3. Birincil antikor tespit birincil antikor bir tavşan yapıldı örneğin, ikincil antikor tavşan IgG tanımalıdır ikincil bir antikor seçin. (IgG, IgM, vb.) Antikor izotip maç için özen gösterin. Multipl primer antikorlar kullanılarak, farklı türler veya isotypes ve ikincil antikorlar bağlı farklı belirleyicileri ile tespit etmek için planı emin olun. Örneğin, yeşil bir fluorofor bir anti-fare ikincil birleştiğinde kırmızı fluorofor bir anti-tavşan ikincil birleştiğinde kullanabilirsiniz. Ilköğretim için aynı tekniği kullanarak, karanlıkta, oda sıcaklığında 2 saat için% 1 BSA uygun bir konsantrasyon seyreltilmiş ikincil antikor çözüm hücreleri inkübe (video gösterilmeyen adımlar). Ikincil bir gliserol solüsyonu (25 mm lamel başına 40 ul, 18 mm lamel başına 30 ul, 12 mm lamel başına 25 ul) olarak saklanır, kuluçka için gerekli ikincil antikor hacmi birincil antikor için biraz daha büyük olabilir .
   
   
   • Not: floresan moleküller ikincil antikor görselleştirmek için kullanıyorsanız, örnek ikincil antikor eklenmiştir sonra ışıktan korunması gerekir. Karanlık, ya da folyo kaplı plaka inkübe edin.
     
     
4. Primer antikor açıklandığı gibi parafilm lamelleri dikkatlice çıkarın. Hücreleri, 2 mcg / ml Hoechst nükleer PBS içinde seyreltilmesi leke (bir nükleer counterstain tercih edilir) bir 1 dakika inkübasyon PBS ile 2 kez, her zaman 5 dakika yıkayınız. Hoechst leke eski ve sinyal çok zayıfsa, inkübasyon süresi ve / veya konsantrasyonu artırabilir. Hoechst ile inkübasyondan sonra, 5 dakika boyunca 1 kez PBS ile yıkayın.
   
   
5. Lamelleri mikroskop görünüm için montaj medya ile bir slayt monte edilmelidir. Ikincil antikor görselleştirme için kullanılan floresan molekül olduğu durumlarda, montaj medya photobleaching en aza indirmek için ajan içermelidir. Biz, floresan bir montaj medya olarak Vectashield kullanın. Bir mikroskop lamı (25 mm lamel başına 12 ul, 18 mm lamel başına 6 ul, 12 mm lamel başına 3 ul) Vectashield uygun bir boyut damla yerleştirin.
   
   
6. Lamel dikkatlice pick up ve arka tuzları (PBS) kaldırmak için deiyonize su ile durulayın. Kimwipe veya kağıt havlu üzerine aşırı su kapalı Dab ve aşağı bakacak hücreleri ile Vectashield açılan yatıyordu. Lamel bir açıyla yerleştirin ve yakalama hava kabarcıkları önlemek için yavaş yavaş inmeye izin. Tarih ve herhangi bir örnek bilgileri slayt etiketleyin.
   
   
7. Lamelleri ile slaytlar lamel kenarı etrafında (koyu) aşırı Vectashield kapalı sonra emme kurumasını bekleyin. Istenirse lamel kenarları (özellikle yararlıdır lamelleri ters bir mikroskopta görülebilir.), Oje ile kapatılmış olabilir. Biz genellikle, bizim slaytlar -20 ° C derin dondurucuda saklayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokol, gerekli antikor hacmi en aza indirir ve güvenilir hücre boyama verir hNSPCs bir immün prosedürü anlatılmaktadır. Açıklandığı gibi işlem hücre içi antijenler için iyi, ama hücre yüzey molekülleri leke veya hücre iskeletinin boyama artırmak için modifiye edilebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips	Tool	Carolina Biological	WW-63-3029	12,15,18, 22, 25 mm coverslips available
Liquinox phosphate-free detergent	Reagent	Sigma-Aldrich	Z273279	very viscous
Poly-D-lysine hydrobromide	Reagent	Sigma-Aldrich	P7280
Laminin, natural mouse	Reagent	Invitrogen	23017-015
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
24 well plate	Tool	Fisher Scientific	08-772-1
Triton X-100	Reagent	Fisher Scientific	BP151-500	very viscous
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	P6148	potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form
Bovine Serum Albumin, IgG-free	Reagent	Jackson ImmunoResearch	001-000-161
H–chst 33342	Reagent	Invitrogen	H-1399
Vectashield	Reagent	Vector Laboratories	H-1000	viscous