Immunocytochimie: des cellules souches humaines

Résumé

Immunocytochimie est une méthode puissante pour déterminer la présence, la localisation subcellulaire, et l'abondance relative d'un antigène d'intérêt dans les cellules cultivées. Ce protocole présente un outil facile à suivre la série d'étapes qui permettent de conserver les anticorps et tirer le meilleur parti de sa coloration.

Résumé

Immunocytochimie est une méthode très puissante et assez simple pour déterminer la présence, la localisation subcellulaire, et l'abondance relative d'un antigène d'intérêt, le plus souvent une protéine, dans les cellules cultivées. Ce protocole présente un outil facile à suivre la série de mesures qui permettront aux chercheurs de conserver les anticorps primaires et secondaires tout en obtenant de haute qualité, reproductibles et qualitative des données quantitatives de leur coloration. Il ya deux aspects de ce protocole qui aidera à conserver le volume d'anticorps nécessaire pour la coloration. D'une part, les cellules sont cultivées sur de petites lamelles circulaires qui sont placés dans les puits d'une plaque de culture de tissus. Après fixation, les cellules sur des lamelles peuvent être retirés dans les puits de la plaque. Pour la coloration des anticorps, la lamelle avec des cellules est inversée sur une petite goutte de solution d'anticorps sur parafilm et est recouvert d'un second morceau de parafilm pour éviter le dessèchement. En utilisant cette méthode, seulement ~ 25 pl de solution d'anticorps est nécessaire pour chaque lamelle (ou échantillons) doivent être colorées. Ce protocole décrit immunomarquage des souches neurales humaines / cellules précurseurs (hNSPCs), mais peut être utilisé pour de nombreux autres types cellulaires.

Protocole

Jour 1: Préparation des lamelles en verre Cellules allemande et l'ensemencement

Remarque: des lamelles de verre allemands sont souvent préférable pour la culture primaire des cellules souches neurales et les neurones. Nous utilisons le protocole de nettoyage suivantes pour améliorer l'adhérence des cellules et se propager. Position des lamelles dans un rack petits qui permettra l'accès de liquide aux deux côtés de la lamelle. Tout d'abord, des lamelles incuber dans Liquinox 1% pendant 10 minutes, suivie de 3 lavages avec de l'eau déminéralisée. Assurez-vous qu'aucun des bulles de savon restent. Ensuite, glisse incuber dans HCl 1M pendant 30 minutes, suivie de 3 lavages avec de l'eau déminéralisée. Lamelles à sec à 65 ° C pendant la nuit. Transfert des lamelles dans un plat en verre et autoclave pour stériliser.

1. Dans une hotte de culture de tissus, placer des lamelles stériles dans une plaque de taille appropriée ainsi.
   
   
2. Manteau avec des lamelles de la laminine de l'adhésion cellulaire. Lamelles Incuber dans 10 ug / ml de poly D-Lysine (PDL) dans l'eau stérile pendant 5 minutes à température ambiante. Retirer lamelles PDL et incuber à 20 mg / ml dans la laminine EMEM pendant 4 heures ou toute la nuit, dans un 37 ° C de culture de tissu incubateur.
   
   
   
   1. Note: Se référer à l'article de repiquage neuronaux humains Cellules souches ( https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) et le comptage de l'homme souches neurales l'article Cells ( https://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262 ) pour apprendre à resuspendre et compter hNSPCs.
      
      
3. Rincer la laminine revêtement des lamelles avec du PBS et les cellules de graines dans chaque lamelle contenant bien à une certaine densité (on utilise souvent une densité de placage initiale de 100,000-300,000 cellules / ml pour les cellules que nous sommes de placage pour immunomarquage).
   
   
4. Placez la plaque à 37 ° C de culture de tissu incubateur et permettent aux cellules d'adhérer à lamelles (habituellement un minimum de 4 heures est requis).

Jour 2: Fixation, perméabilisant, le blocage, et ajout d'anticorps primaire à cellules

Note: Nous utilisons le fixateur paraformaldéhyde 4% suivants afin de préserver la morphologie cellulaire. La recette comporte une transition de pH pour permettre à la paraformaldéhyde à passer en solution. Nous préférons cette méthode plutôt que l'utilisation de la chaleur pour dissoudre paraformaldéhyde parce températures plus élevées peuvent conduire à la génération de l'acide formique, ce qui peut augmenter la coloration de fond lors de l'utilisation de fluorescence. Certaines composantes de l'aide fixatif pour préserver la structure du cytosquelette (MgCl ₂ et EGTA), tandis que d'autres aident à maintenir la morphologie globale (saccharose).

Fixateur paraformaldéhyde à 4% pour les cellules

Réactifs et étapes:	Montant pour 100 ml de fixateur:
L'eau MilliQ	75 ml
Paraformaldéhyde (peser dans la hotte)	4 g
NaOH 10N, remuer et ajouter goutte à goutte jusqu'à ce qu'une solution efface	au besoin
PBS 10X	10 ml
1M MgCl 2	0,5 ml
0,5 M EGTA	2 ml
Saccharose	4 g
HCl 6N, titrer à un pH de 7,4	au besoin
L'eau MilliQ	porter à 100 ml
Conserver à 4 ° C pendant 1 semaine. Chaude à 37 ° C avant utilisation

1. Sur le banc, retirez le support et ajouter fixateur préchauffée. Incuber pendant 5-15 minutes (en fonction de l'antigène à détecter, on utilise habituellement 10 minutes). Effectuez cette et les étapes suivantes à la température ambiante.
   
   
2. Jeter le fixateur dans un récipient approprié, comme de nombreuses institutions gérer paraformaldéhyde comme déchets dangereux. Laver les cellules trois fois avec du PBS, à 5 minutes à chaque fois. Lors de la suppression de solutions à partir des cellules, faites attention que l'aspiration ne se dessèche pas les cellules. Aussi, ont toujours la solution suivante sur la main d'ajouter aux cellules avant de retirer la solution que les manteaux eux pour les cellules ne sont pas laissés à sécher.
   
   
3. Si l'antigène d'intérêt est à l'intérieur de la cellule, la membrane cellulaire doit être rendue perméable pour permettre l'entrée de l'anticorps. Pour perméabiliser les cellules, utilisez un nouveau 0,3% de Triton X-100 solution dans du PBS. Pipeter lentement parce que Triton est visqueux, et assurez-vous que le détergent est complètement dissous dans du PBS avant d'ajouter aux cellules. Perméabiliser les cellules pendant 5 minutes, suivi par le lavage des cellules 3 fois avec du PBS, à 5 minutes à chaque fois.
   
   
4. Les cellules doivent être traitées avec un agent de blocage pour empêcher la liaison non spécifique de l'anticorps. Nous utilisons l'albumine sérique bovine (BSA) comme agent de blocage. La solution de blocage est faite en dissolvant BSA 5% dans du PBS (sur une bascule ou des rotateurs, car cela prend du temps à se dissoudre), puis filtrer le solution d'un filtre à seringue de 0,45 um. Bloc cellules dans 5% BSA / PBS solution pendant 1 heure à température ambiante.

Diluer l'anticorps primaire (qui est, espérons-spécifiques de la protéine d'intérêt) à une concentration pré-déterminé de 1% BSA / PBS (préparé par dilution de 5% de BSA / PBS). Placez diluée d'anticorps primaire (30 pi par 25 lamelle mm, 20 ul par 18 mm lamelle, 15 pi par 12 lamelle mm) sur une plaque de verre recouverts de parafilm. Ramassez la lamelle avec des cellules fixes, inverser telles que les cellules, face cachée, et mettez-le sur la solution d'anticorps afin que les cellules sont en contact avec l'anticorps. Placez une bande de parafilm seconde au cours de la construction entière. Incuber à 4 ° C pendant la nuit.

Jour 3: Lavage, incubation anticorps secondaire, Stain nucléaire et de montage

1. Retirez délicatement la bande de parafilm dessus et ramassez la lamelle, l'inverser, et de le replacer dans la plaque avec du PBS dans chaque puits pour les lavages de sorte que les cellules sont vers le haut.
   
   
2. Laver les cellules trois fois avec du PBS, à 5 minutes à chaque fois.
   
   
3. Choisissez un anticorps secondaire qui permet de détecter l'anticorps primaire, par exemple, si l'anticorps primaire a été faite chez le lapin, l'anticorps secondaire devraient reconnaître IgG de lapin. Prenez soin aussi de correspondre à l'isotype d'anticorps (IgG, IgM, etc.) Si vous utilisez plusieurs anticorps primaires, assurez-vous qu'ils sont de différentes espèces ou isotypes, et le plan de détecter avec différents marqueurs attachés à l'anticorps secondaire. Par exemple, vous pourriez utiliser un anti-lapin couplé à un fluorophore secondaire rouge avec un anti-souris couplé à un fluorophore secondaires vert. Incuber les cellules dans la solution d'anticorps secondaire dilué à une concentration appropriée dans de la BSA 1% pendant 2 heures dans le noir à température ambiante, en utilisant la même technique que pour le primaire (étapes ne figurent pas dans la vidéo). Le volume d'anticorps secondaire nécessaire pour l'incubation peut être légèrement supérieure à celle de l'anticorps primaire si le secondaire est stocké comme une solution de glycérol (40 pi par 25 mm lamelle, 30 pi par 18 mm lamelle, 25 pi par 12 mm lamelle) .
   
   
   • Remarque: Si vous utilisez des molécules fluorescentes pour visualiser l'anticorps secondaire, l'échantillon doit être protégé de la lumière une fois de l'anticorps secondaire a été ajoutée. Incuber dans l'obscurité, ou dans une plaque aluminium couvert.
     
     
4. Retirez délicatement les lamelles de la parafilm comme décrit pour l'anticorps primaire. Laver les cellules deux fois avec du PBS, à 5 minutes à chaque fois, suivi par une incubation de 1 minute à 2 ug / ml colorant nucléaire Hoechst dilué dans du PBS (si une contre-coloration nucléaire est préférée). Si la tache est vieille et Hoechst, le signal est trop faible, vous pouvez augmenter le temps d'incubation et / ou la concentration. Après incubation avec Hoechst, laver une fois avec du PBS pendant 5 minutes.
   
   
5. Les lamelles doivent être montées sur une lame avec les médias de montage pour une visualisation sur un microscope. Dans les cas où une molécule fluorescente est utilisé pour la visualisation de l'anticorps secondaire, les médias de montage doit contenir des agents pour minimiser photoblanchiment. Nous utilisons Vectashield comme un média de montage pour la fluorescence. Placez une goutte de taille appropriée de Vectashield sur une lame de microscope (12 pi par 25 lamelle mm, 6 pi par 18 mm lamelle, 3 pi par 12 lamelle mm).
   
   
6. Soigneusement ramasser la lamelle et rincer le dos avec de l'eau déminéralisée pour éliminer les sels (à partir du PBS). Tamponnez l'excès d'eau sur une serviette en papier ou Kimwipe, et jeter sur la goutte de Vectashield avec des cellules vers le bas. Placer la lamelle sur un angle et permettent de descendre lentement pour éviter les bulles d'air de piégeage. Étiquette de la diapositive avec la date et de toute information sur l'échantillon.
   
   
7. Autoriser des diapositives avec des lamelles de sécher (dans le noir), puis d'aspiration hors Vectashield excès de la lamelle sur le pourtour. Les bords lamelle peut maintenant être scellé avec du vernis à ongles, si désiré (particulièrement utile si des lamelles à être visionnés sur un microscope inversé). En général, nous stockons nos diapositives dans un congélateur à -20 ° C.

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Discussion

Ce protocole décrit une procédure d'immunomarquage hNSPCs qui minimise la quantité d'anticorps nécessaire et donne une coloration cellulaire fiable. La procédure décrite est la meilleure pour les antigènes intracellulaires, mais peut être modifiée pour tache de molécules de surface cellulaire ou à améliorer la coloration du cytosquelette.

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips	Tool	Carolina Biological	WW-63-3029	12,15,18, 22, 25 mm coverslips available
Liquinox phosphate-free detergent	Reagent	Sigma-Aldrich	Z273279	very viscous
Poly-D-lysine hydrobromide	Reagent	Sigma-Aldrich	P7280
Laminin, natural mouse	Reagent	Invitrogen	23017-015
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
24 well plate	Tool	Fisher Scientific	08-772-1
Triton X-100	Reagent	Fisher Scientific	BP151-500	very viscous
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	P6148	potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form
Bovine Serum Albumin, IgG-free	Reagent	Jackson ImmunoResearch	001-000-161
H–chst 33342	Reagent	Invitrogen	H-1399
Vectashield	Reagent	Vector Laboratories	H-1000	viscous