La visualización de las células intersticiales de Cajal (ICC) de red en ratones

Resumen

Las células intersticiales de Cajal (ICC) son las células marcapasos del tracto gastrointestinal (GI). Se forman redes complejas entre las células del músculo liso y fibras post-ganglionares neuronal para regular la contractilidad del GI. A continuación, presentamos los métodos de inmunofluorescencia transversal y todo el montaje de visualización de redes murino de la CPI.

Resumen

Las células intersticiales de Cajal (ICC) se mesenquimales derivados de las "células marcapasos" del tracto gastrointestinal (GI) que generan las ondas lentas espontánea necesaria para la peristalsis y mediar en la entrada neuronal de la system1 nervioso entérico. Diferentes subtipos de la CPI formar redes distintas en la capa muscular del tracto gastrointestinal ^2,3. Pérdida o daños a estas redes se asocia con una serie de trastornos de la motilidad ^4. Las células de la CPI expresar la tirosina quinasa del receptor KIT en la membrana plasmática y el KIT inmunotinción se ha utilizado durante los últimos 15 años a la etiqueta de la red de ICC ^5,6. Es importante destacar que la actividad KIT normal es necesaria para el desarrollo de ICC ^5,6. Transformación neoplásica de las células de la CPI resultados en tumores del estroma gastrointestinal (GIST), que con frecuencia puerto de ganancia de función de las mutaciones KIT ^7,8. Recientemente hemos demostrado que ETV1 es un factor de supervivencia de linaje específico, expresado en el linaje de ICC / GIST y es un regulador maestro de la transcripción necesarios tanto para la formación normal de la red de la CPI y de la tumorogénesis GIST ^9. Además, demostrar que coopera con la activación de las mutaciones KIT en la tumorigénesis. Aquí se describen los métodos para la visualización de las redes de la CPI en los ratones, en gran parte basado en los protocolos previamente publicados ^10,11. Más recientemente, el canal de cloro anoctamin 1 (ANO1) también se ha caracterizado como un marcador de membrana específicos de ICC ^11,12. Debido a su localización membrana plasmática, la inmunofluorescencia de ambas proteínas se pueden utilizar para visualizar las redes de la CPI. Aquí se describe la visualización de las redes de la CPI por fija congeladas y preparaciones cyrosections todo el montaje.

Protocolo

1. La disección de ratón del tracto gastrointestinal

1. Los ratones sacrificados por las normas locales IUCAC
2. Pin cada miembro en la superficie de espuma de poliestireno y enjuague la superficie abdominal con el 70% de etanol. Abrir la cavidad abdominal con incisión larga línea media desde el diafragma hasta el pubis. Hacer un corte en el esófago distal, y un segundo corte en el intestino grueso distal y quitar el tubo digestivo desde el estómago hasta el ano en bloque, cortando cuidadosamente los ligamentos en el duodeno y el ciego con unas tijeras pequeñas. Lugar del tracto gastrointestinal en una placa de Petri con PBS. Diseccionar mesenterio con unas pinzas (Figura 1). Para separar el estómago, intestino delgado e intestino grueso, corte en el píloro y la unión ileocecal. Enjuague la luz de cada parte del tracto gastrointestinal con PBS utilizando una jeringa de 5 ml conectada a una aguja de alimentación (ratones de más edad) o aguja sin punta (ratones más jóvenes).
3. Abrir el estómago, intestino delgado e intestino grueso a lo largo del borde mesentérico. Corte dos piezas para cada parte del tracto gastrointestinal, un montaje para la visualización entera y otro para cryosection.

2. Todo el montaje y preparación de la muestra inmunotinción

1. Coloque la pieza entera de cada parte del tracto gastrointestinal en un tubo de microcentrífuga de 1,5 cm lleno con 1,0 ml de acetona fría y muestras de solución para al menos 1 hora a 4 ° C. Las muestras pueden ser almacenadas por hasta 1 semana a -20 ° C. Por lo general almacenar las muestras en acetona y proceder a la preparación cyrosections.
2. Lave 2X muestra con PBS. Ponga la muestra en placa de Petri con PBS. Bajo microscopio de disección, cuidadosamente quite la capa de la mucosa con un bisturí por la celebración de un extremo con un par de pinzas, dejando la capa muscular.
3. Los músculos se pueden cortar en trozos de 5 mm para la tinción con anticuerpos diferentes. No almacenar por más de 2 días en PBS antes de la tinción.
4. Pasos de bloque y la incubación se puede hacer en un pocillo de una placa de 24 pocillos o en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Bloque con 0,5 ml de tampón de bloqueo (5% suero de cabra, un 0,1% Triton X-100 en PBS durante 1 hora a 4 ° C).
5. Se incuba con el anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo y gire la noche a 4 ° C. Hemos utilizado con éxito ACK-2 de rata anti-Kit, de conejo anti-Ano1, y de conejo anti-anticuerpos para inmunoticción Pgp9.5 montar todo.
6. Lávese las manos por 5 minutos 2 veces con PBS en los rotadores a temperatura ambiente.
7. Incubar con el anticuerpo secundario diluido en tampón de bloqueo durante 2 horas a temperatura ambiente en los rotadores. Por lo general el uso Alexa Fluor 488 anti-conejo y Alexa Fluor 594 anticuerpos anti-rata.
8. Lávese las manos por 15 minutos 3 veces con PBS en los rotadores a temperatura ambiente.
9. Montaje de la diapositiva, lado seroso en la parte superior para asegurar la orientación de los tejidos durante la microscopía. Esta orientación se asegurará el lado seroso hacer frente a los cubreobjetos y se encontró por primera vez como uno se centra en la diapositiva en un microscopio. Hacemos esto en un microscopio de disección. A veces, brevemente examinar el tejido bajo el microscopio de fluorescencia para orientar correctamente. Bajo microscopía de fluorescencia para visualizar Kit o Ano1, uno debe encontrar el ICC-MI primera red desde el lado del cubreobjetos. A continuación, aspirar PBS tanto como sea posible sin secarse por completo. Añadir 50 l de los medios de comunicación establecidos duro de montaje (que utilizamos prolongar Oro) y coloque suavemente el cubreobjetos en la parte superior del tejido. Permitir el ajuste de montaje de la noche a temperatura ambiente y se desliza almacenar a -80 ° C.
10. Para el examen microscópico, se utilizó un microscopio de campo amplio con un Z-drive. Hemos utilizado ya sea un objetivo 20X de aire (NA 0.75, apocromático plano) o un objetivo de aceite 60X (NA 1.4, apocromático plano) y tomó dos superior o igual a 1 micra Z-secciones que abarcan toda la capa muscular. Las imágenes fueron deconvoluted posteriormente mediante el software de deconvolución AutoQuant. Por otra parte, muchos otros han usado la microscopía confocal en cambio, con resultados similares.

3. Criosección preparación y tinción

1. Lugar de cada parte del tracto gastrointestinal, por parte serosa, planos en papel de filtro. Corte el papel de filtro alrededor del tejido. Coloque el tejido en papel de filtro en el 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS (se diluye el 32% de paraformaldehído en PBS frasco cerrado en la derecha antes de su uso) durante 2 horas a temperatura ambiente. La fijación se puede hacer en un 6 - o 12 y placa, dependiendo del tamaño del tejido, o en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Si se hace en el plato, parafina para minimizar la exposición PFA. Ya veces puede dar lugar a la fijación adhesiva de antígeno, en particular para el ACK-2 Kit anti-anticuerpos.
2. Eliminar el tejido de la PFA y el lugar en el 30% de sacarosa en PBS. Permitir que el tejido a hundirse durante la noche en el 4 ° C.
3. Equilibrar los tejidos con una relación 1:1 de 30% de sacarosa y octubre durante 1 hora. A continuación, monte el tejido verticalmente en cryomold lleno de octubre El eje longitudinal del tracto gastrointestinal debe estar en paralelo con el cyrosections. Al examinar los ratones con diferentes genotipos o con diferentes tratamientos, puede ser útil para montar los tejidos de los ratones en diferentes cryomold mismo para asegurar el procesamiento en paralelo. Congelación de hielo seco y colocar en el congelador -80 ° C para su almacenamiento.
4. Reducción del 10 micras cryosectionsen diapositivas y almacenar a -80 ° C congelador. Por lo general, dos secciones de corte en cada diapositiva. También suele realizar la tinción H & E de diapositivas cryosection una.
5. Por inmunofluorescencia, en primer lugar equilibrar diapositivas a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, dibuje un círculo alrededor del tejido usar la pluma PAP.
6. Bloquear con 150 l de tampón de bloqueo (igual que para toda la inmunotinción de montaje) durante 1 hora.
7. Aspirar el tampón de bloqueo y añadir 150 l de anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo y se incuba durante la noche a 4 ° C en una cámara húmeda.
8. Lavado de 5 minutos 2 veces con PBS.
9. Incubar con el anticuerpo secundario diluido en tampón de bloqueo durante 2 horas a temperatura ambiente. Por lo general el uso Alexa 488 anti-conejo y Alexa 594 anticuerpos anti-rata.
10. Lávese las manos por 15 minutos 3 veces con PBS.
11. Aspirar diapositiva sin secarse por completo los tejidos. Añadir una gota de conjunto difícil de montaje multimedia con DAPI (usamos prolongar Oro) y el lugar # 1.5 cubreobjetos. Lugar de diapositivas a temperatura ambiente durante la noche para establecer y guardar en el congelador -80 ° C.
12. Adquisición de tres imágenes de fluorescencia con DAPI, FITC y Texas establece filtro rojo.

4. Los resultados representativos:

Aquí, nosotros usamos el intestino grueso como un ejemplo. H & E tinción de sacarosa protegidos sección fija de hielo utilizado para inmunofluorescencia muestra algunos artefactos en comparación con una sección de parafina de referencia (Figura 2), donde la línea amarilla del plexo mientérico demarks entre las capas musculares circulares y longitudinales y la demarks línea verde de la frontera entre el mucosa y muscularlis. Examinar la cryosection, de la serosa a mucosa, en primer lugar encontramos la más delgada del músculo longitudinal (LM) de la capa seguido por el grueso del músculo circular (CM) de la capa. La sección debe estar en paralelo con el músculo longitudinal para los núcleos de LM debe ser algo alargado, mientras que los núcleos de la CM debe ser pequeño y redondo. Entre el LM y CM son plexos mientérico hechos de neuronas que se tiñen con Pgp9.5. Pgp9.5 también manchas neuronal procesos a lo largo de la CM. Mientérico red ICC (ICC-MI) rodean el plexo mientérico y están hechos de células multipolares. Dentro de la capa muscular longitudinal, no son raros los CCI intramuscular (ICC-IM), que son células bipolares en paralelo con el músculo. Dentro de la capa muscular circular, hay abundantes ICC-IM, que también son células bipolares que se ejecutan en paralelo con el músculo circular y está seccionado con este corte. En el cruce de la capa muscular y la submucosa, la submucosa de la red de la CPI consiste en ICC-SMP es una red plana de los CCI multipolar. Examinar el kit de montaje en toda la inmunotinción del intestino grueso, se debe esperar encontrar el ICC-MI de la red, y luego la Corte Penal Internacional-IM de la CM, y las redes de ICC-SMP, como uno se centra en el cubreobjetos (Figura. 3) . Medida volumétrica de las redes de ICC con reconstrucción 3D de imágenes de monte se han descrito ^10. Utilizando todo el microscopio de campo, no es significativo fuera del plano de fluorescencia en las imágenes en bruto que puede ser retirado después de deconvolución (Figura 3). Incompleta stripping de la mucosa se traducirá en la fluorescencia de fondo de alta. ANO1 es otro indicador de la Corte Penal Internacional y co-tinción de KIT y ANO1 muestra una superposición completa de la tinción de la CCI (Figura 4).

Representante de la figura 1. Diseccionado el tracto gastrointestinal del ratón, reimpreso con el permiso de ^13.

Figura 2. A) Representante tinción H & E del intestino grande del ratón de cryosections preparado como se describe y embebidos en parafina de referencia sección que muestra algunos artefactos de la contracción de cryosections. El demarks línea amarilla del plexo mientérico y la línea azul que separa la mucosa de la capa muscular. B) Representante Kit (rojo, ACK-2) y Pgp9.5 (verde) de inmunofluorescencia doble con DAPI (azul) contratinción del intestino grande del ratón. LM: CM músculo longitudinal: músculo circular. Barra de escala 20 micras.

Figura 3. Representante Kit (rojo, ACK-2) todo el montaje de inmunofluorescencia el mismo campo en tres planos focales, el ICC-Mi avión en la frontera LM / CM, el plano de la CPI-IM en el CM, y la Corte Penal Internacional SMP avión en la frontera CM / submucosa. Las imágenes RAW y las imágenes se muestran deconvoluted. Barra de escala 20 micras.

Figura 4. Representante de doble inmunofluorescencia de Ano1 (verde) y Kit (rojo, ACK-2) en el intestino grueso. Barra de escala 20 micras.

Discusión

Las células intersticiales de Cajal se caracteriza inicialmente por Santiago Ramóón y Cajal exactamente un siglo atrás con manchas de metileno cromato azul y plata de muscularis gastrointestinal. Cajal pensaba inicialmente ICC se basa en las neuronas de sus procesos que son una reminiscencia de los axones y dendritas. Lo largo de muchos años de seguimiento, el estudio de la biología de la CPI ha sido limitada por la falta de marcadores específicos hasta el descubrimiento de que Kit no sólo se expresa en la CPI, pero también es necesario para su desarrollo ^6. Desde entonces, KIT inmunofluorescencia ha sido ampliamente utilizado en el estudio de la biología y la Corte Penal Internacional también ha llevado a la apreciación de la Corte en otros órganos contráctiles, como la vejiga urinaria. Recientemente, ANO1 ha sido identificado como un segundo marcador fiable de la CPI.

Ha habido numerosas publicaciones en los últimos 15 años mediante inmunofluorescencia para identificar a la CPI con la fijación de diversas técnicas de montaje. En nuestras manos "fijo" congelados cryosections que se han prefijado con paraformaldehído y sacarosa obras protegidas por el mejor en comparación con acetona o paraformaldehído posterior a la fijación después de muestras criostáticas. Para montajes todo, hemos encontrado que la fijación de acetona seguida por disección de la mucosa se presentan los resultados más robustos.

Históricamente, el ACK-2 ha sido el anticuerpo Kit de elección para el ratón de la CPI de identificación. Es una rata monoclonal que reconoce el dominio extracelular y es también un bloqueo de anticuerpos que causa íleo cuando se les da para vivir ratones. Sin embargo, el epítopo ACK-2 es destruido lentamente por la fijación de paraformaldehído y no es rescatado por los métodos de recuperación de antígeno. Hemos encontrado que el epítopo ACK-4 es más resistente a la fijación de paraformaldehído. En comparación con el fijo bloques congelados y secciones, bloques de parafina y las secciones conserva la morfología mejor y es más susceptible de archivo a largo plazo (Figura 4). Ni ACK ACK-2 ni 4 se han utilizado con éxito en las secciones de parafina. Hemos caracterizado que D13A2, un anticuerpo monoclonal de conejo nuevo, funciona excepcionalmente bien en las dos secciones fijas congeladas y la parafina en el tracto gastrointestinal.

Kit se expresa en varios tipos celulares, incluyendo los melanocitos, las células hematopoyéticas, células germinales, y en particular en los mastocitos, que también se encuentran en el tracto gastrointestinal. Afortunadamente, la mayoría de las células cebadas se encuentran es la mucosa y no en la capa muscular. Doble tinción con conejo anti-Ano1 y rata anti-Kit puede eliminar la tinción inespecífica de cada anticuerpo (Figura 4). También vale la pena señalar que la expresión relativa de Kit y Ano1 entre las subclases de la Corte Penal Internacional parece diferente. Por ejemplo, en el intestino delgado, la tinción de Kit es mucho más intensa en mientérico ICC en comparación con el ICC de los músculos profundos del plexo Ano1 mientras que la tinción es comparable.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
rata anti-Kit de anticuerpos (clon ACK-2)	eBioscience	14-1172	Uso en 2μg/ml. Epítopo se pierde con overfixation.
rata anti-Kit de anticuerpos (clon ACK-4)	Cedarlane	CL8936AP	Uso en 2μg/ml.
conejo anti-KIT anticuerpos (clon D13A2)	Señalización Celular	3074	Uso en dilución 1:100. Anticuerpos sólo figuran en esta lista que funciona bien en las secciones de parafina.
conejo anti-anticuerpos Pgp9.5	Abcam	ab10404	Etiquetas citoplasma de la célula neuronal. Útil para marcar las neuronas del plexo mientérico. Uso en la dilución 1:1000.
conejo anti-anticuerpos Ano1	Abcam	ab53212	Uso en 2μg/ml
Alexa Fluor 594 cabra anti-IgG de rata	Invitrogen	A-11007	Uso en 2μg/ml
Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo IgG	Invitrogen	A-11008	Uso en 2μg/ml
Aguja de alimentación de los animales	Pescador	01-208-87	De silicona con punta de aguja útil para el lavado del tracto gastrointestinal de los ratones adultos
Blunt aguja	Becton Dickison	305180	Aguja roma útil para el lavado del tracto gastrointestinal de las crías pre-destete
Prolongar reactivo Antifade oro con DAPI	Invitrogen	P-36931	Puede usar alternativas difíciles de establecer medios de montaje con DAPI
Tissue-Tek Cryomold	Tissue-Tek	4557
Tissue-Tek octubre	Tissue-Tek	4583
32% de paraformaldehído (ampollas de 10 ml sellado)	EM Ciencias	15714	Ampolla abierta sellado y diluir a 4% justo antes de usar
Tampón de bloqueo			5% de suero de cabra, 0,1% Triton X-100 en PBS