Визуализация интерстициальные клетки Кахала (МУС) в сети Мыши

Резюме

Интерстициальные клетки Кахала (МУС) кардиостимулятора клетках желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Они образуют сложные сети между клеток гладкой мускулатуры и пост-ганглиозные нейронные волокна регулировать И. сократительной. Здесь мы представляем методы иммунофлюоресценции поперечного сечения и целые монтажа визуализации мышиной сетей МУС.

Аннотация

Интерстициальные клетки Кахала (МУС) мезенхимальных производных "кардиостимулятор клетки" из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), которые генерируют спонтанное медленные волны, необходимые для перистальтику и посредником нейронов участии кишечной нервной системы1. Различные подтипы МТП форме различных сетей в мышечной из желудочно-кишечного тракта ^2,3. Потеря или повреждение этих сетей связан с рядом нарушений моторики ^4. ICC клетки экспрессируют КИТ тирозинкиназы рецепторов на мембране плазмы и КИТ иммуноокрашивания был использован в течение последних 15 лет, чтобы этикетка МТП сети ^5,6. Важно отметить, что нормальная деятельность КИТ требуется для развития МТП ^5,6. Онкологические преобразования МТП клеток приводит к желудочно-кишечного стромальных опухолей (GIST), что зачастую гавани получить-функции КИТ мутации ^7,8. Недавно мы показали, что ETV1 является линия-специфической выживаемости фактор выражается в линии ICC / GIST и мастер транскрипционного регулятора необходимо как для нормального формирования сети МТП и в GIST опухолей ^9. Мы также продемонстрировать, что она сотрудничает с активацией КИТ мутации в опухолей. Здесь мы опишем методы визуализации сети МТП на мышах, в значительной степени основаны на ранее опубликованных протоколов ^10,11. Совсем недавно, хлорида канал anoctamin 1 (ANO1) также был охарактеризован как специфическим маркером оболочки МТП ^11,12. Из-за их локализации мембраны плазмы, иммунофлюоресценции обоих белков могут быть использованы для визуализации МТП сетей. Здесь мы описываем визуализации сети МУС фиксированной замороженных cyrosections и целом подготовка монтирования.

протокол

1. Препарирование мышей желудочно-кишечном тракте

1. Эвтаназии мышей местными IUCAC руководящие принципы
2. Pin каждой конечности на поверхности пенополистирола и промыть брюшную поверхность с 70% этанола. Открытое брюшной полости с длинными средней линии разреза от диафрагмы до лобка. Сделать одного отрезка в дистальной части пищевода и второй разрез в дистальной толстой кишке и удаления желудочно-кишечный тракт от желудка до ануса целиком, тщательно резки связок в двенадцатиперстной кишке и слепой кишки с помощью небольших ножниц. Место желудочно-кишечного тракта в чашку Петри с PBS. Рассеките от брыжейки пинцетом (рис. 1). Чтобы отделить желудка, тонкой кишки и толстой кишки, разрезать на привратника и илеоцекального перехода. Полоскание полости каждой части желудочно-кишечного тракта с использованием PBS 5 мл шприца придает кормления игла (более старых мышей) или тупой иглой (младшего мышей).
3. Открытое желудка, тонкой кишки, толстой кишки и по брыжеечной границе. Отрежьте два куска на каждую часть желудочно-кишечного тракта, по одной на весь визуализации горе и один для cryosection.

2. Всего образец горе подготовки и иммунной

1. Место всю часть каждой части желудочно-кишечного тракта в 1,5 см микроцентрифужную трубки, заполненной 1,0 мл ледяной ацетон и исправить образцы, по крайней мере 1 часа при температуре 4 ° C. Пробы могут храниться до 1 недели при температуре -20 ° C. Мы обычно хранят образцы в ацетоне и приступить к подготовке cyrosections.
2. Промыть образец 2X с PBS. Место образца в чашку Петри с PBS. Под рассекает miscroscope, тщательно соскоблить слизистой оболочки с помощью скальпеля, держа один конец с пинцетом, оставляя мышечной.
3. Мышцы можно разрезать на 5 мм пьесы для окрашивания различных антител. Не хранить более 2-х дней в PBS перед окрашиванием.
4. Блок и инкубации может быть сделано в одну лунку 24-луночного планшета или в 1,5 мл трубки отцентрифугировать. Блок с 0,5 мл блокирующего буфера (5% сыворотки козьего, 0,1% Тритон Х-100 в PBS в течение 1 часа при температуре 4 ° С).
5. Инкубируйте с первичным антителом разводят в блокирующем буфере и поворачивать течение ночи при 4 ° C. Мы успешно использовали ACK-2 крысы анти-Kit, кролика против Ano1 и кролика против Pgp9.5 антител для всей иммунной монтирования.
6. Промыть в течение 5 мин 2X с PBS на ротатор при комнатной температуре.
7. Инкубируйте с вторичными антителами разводят в блокирующем буфере в течение 2 часов при комнатной температуре на ротатора. Обычно мы используем Alexa Fluor 488 анти-кролик и Alexa Fluor 594 анти-крыса антител.
8. Промыть в течение 15 минут 3 раза с PBS на ротатор при комнатной температуре.
9. Горы на слайде, серозный стороны на вершине, чтобы обеспечить ориентацию ткани при микроскопии. Это направление будет обеспечивать серозный стороны к лицу покровное и встретится сначала как один фокусируется на слайд на микроскоп. Мы делаем это на вскрытии микроскопом. Иногда мы кратко рассмотрим ткани под флуоресцентной микроскопии правильно сориентироваться. Под флуоресцентной микроскопии для визуализации Kit или Ano1, следует встреча ICC-MY сети сначала со стороны покровного стекла. Далее, аспирация PBS как можно больше без полного высыхания. Добавить 50 мкл жесткий набор монтажа средств массовой информации (мы используем продлить Gold) и осторожно положите покровное стекло поверх ткани. Разрешить установку монтаж в течение ночи при комнатной температуре и хранить слайды при температуре -80 ° C.
10. Для микроскопического исследования, мы использовали широким полем зрения микроскопа с Z-приводом. Мы использовали либо 20-кратным воздуха цель (NA 0,75, план апохромат) или 60X цель нефти (NA 1.4, план апохромат) и занял 2 мкм или 1 мкм Z-разделов, которые охватывают всю мышечную. Изображения были впоследствии deconvoluted использованием программного обеспечения Autoquant деконволюции. Кроме того, многие другие использовали вместо конфокальной микроскопии с аналогичными результатами.

3. Подготовка Cryosection и иммунной

1. Место каждой части желудочно-кишечного тракта, серозный стороной вниз, плашмя на фильтровальную бумагу. Вырезать фильтровальную бумагу вокруг ткани. Места тканью фильтровальной бумаги 4% параформальдегиде (PFA) в PBS (Мы разбавленной 32% параформальдегида в запечатанный чашу PBS праве Перед использование) 2 часов температуре. Фиксация может быть сделано в 6 - или 12-луночного планшета в зависимости от размера ткани, или в 1,5 трубки микроцентрифужную мл. Если все сделано в пластину, чтобы свести к минимуму парафильмом PFA экспозиции. Более длительное время записи, может привести к антигену маскировки, особенно для ACK-2 анти-Kit антител.
2. Удаление ткани из PFA и место в 30% сахарозы в PBS. Разрешить ткани на раковине на ночь в 4 ° С.
3. Равновесие ткани с соотношении 1:1 на 30% сахарозы и октябрь на 1 час. Затем смонтируйте ткани вертикально в cryomold заполнены октября продольной оси желудочно-кишечного тракта следует параллельно с cyrosections. При изучении мышей с разными генотипами или с различных методов лечения, это может быть полезно для монтирования ткани из разных мышей на той же cryomold для обеспечения параллельной обработки. Заморозить на сухом льду и место в -80 ° C морозильника для хранения.
4. Вырезать 10 мкм cryosectionsна слайд и хранить при температуре -80 ° С морозильник. Мы обычно вырезать две секции на слайд. Кроме того, мы как правило, выполняют H & E окрашивания одной cryosection слайда.
5. Для иммунофлюоресценции, первый слайд равновесие при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем нарисуйте круг вокруг ткани с использованием PAP пера.
6. Блок с 150 мкл блокирующего буфера (такой же как для всей иммунной крепление) в течение 1 часа.
7. Аспирируйте блокирующим буфером и добавьте 150 мкл первичных антител разводят в блокирующем буфере и инкубировать в течение ночи при 4 ° С в увлажненной камере.
8. Вымойте 5 мин 2X с PBS.
9. Инкубируйте с вторичными антителами разводят в блокирующем буфере в течение 2 часов при комнатной температуре. Обычно мы используем Alexa 488 анти-кролик и Alexa 594 анти-крыса антител.
10. Промыть в течение 15 минут 3 раза с PBS.
11. Аспирируйте слайд без полного высыхания тканей. Добавить каплю жесткий набор монтажа сред с DAPI (мы используем продлить Gold) и место № 1.5 покровное. Место слайд при комнатной температуре в течение ночи установить и хранить в морозильной камере -80 ° C.
12. Приобретать тройной флуоресценции изображений с использованием DAPI, FITC и Техас Красной наборы фильтров.

4. Представитель Результаты:

Здесь мы используем толстой кишки в качестве примера. H & E пятно сахарозы защищен фиксированной замороженный участок используется для иммунофлюоресценции показывает некоторые артефакты по сравнению с справочный раздел парафина (рис. 2), где желтая линия demarks myenteric сплетения между кольцевые и продольные мышцы слоями и зеленый demarks линии границы между слизистой оболочки и muscularlis. Рассматривая cryosection, из серозной к слизистой оболочке, Вы впервые столкнулись тонкие продольные мышцы (LM), затем слой толще круговой мышцы (КМ) слоя. Раздел должен быть параллельно продольной мышцы так ядер LM должна быть несколько удлиненный в то время как ядра СМ должна быть небольшой и круглый. Между ЛМ и КМ myenteric оргстекла сделаны из нейронов, которые окрашиваются Pgp9.5. Pgp9.5 также пятна нейронные процессы в CM. Myenteric МТП сети (ICC-MY) окружают myenteric сплетения и сделаны из многополярного клеток. В продольный слой мышц, Есть редкие ЦКУ внутримышечных (ICC-IM), которые являются биполярные клетки параллельно с мышц. В круговой мышечный слой, Есть богатый ICC-чаты, которые также являются биполярные клетки, которые работают параллельно с круговой мышцы и являются кросс-секционного с этого разреза. На стыке мышечной и подслизистой, подслизистой сети МТП, состоящий из ICC-SMPS представляет собой плоскую сеть многополярного МКК. Рассматривая весь комплект крепление иммуноокрашивания толстой кишки, следует ожидать сталкиваться с ICC-MY сети, а затем ICC-ИМ CM, и ICC-SMP-сетей, в качестве одного из фокусируется покровное (Figure. 3) . Объемная мера сетей МТП с использованием 3D реконструкция целого монтировать образы были описаны ^10. Использование широкого поля микроскопа, существует значительный вне плоскости флуоресценции в необработанных изображений, которые могут быть удалены после деконволюции (рис. 3). Неполное зачистки слизистой приведет к высокой флуоресценции фон. ANO1 другой маркер МУС и сотрудничества иммуноокрашивания КИТ и ANO1 показывает полное перекрытие МТП окрашивания (рис. 4).

Рисунок 1. Представителю расчлененный мыши желудочно-кишечного тракта, перепечатано с разрешения ^13.

Рисунок 2.) Представитель H & E окрашивание мыши толстой кишки cryosections приготовленного, как описано и справочные парафин разделе показаны некоторые усадки артефакты cryosections. Желтая линия demarks myenteric сплетения и синяя линия отделяет слизистую оболочку от мышечной. Б) представитель Kit (красный, АСК-2) и Pgp9.5 (зеленый) двойной иммунофлуоресценции с DAPI (синий) counterstaining мыши, толстой кишки. Л.М.: продольные мышцы CM: круговой мышцы. Шкала бар 20 мкм.

Рисунок 3. Представителю Kit (красный, АСК-2) все крепления иммунофлюоресценции того же поля в трех основных плоскостях, ICC-мой самолет на LM / CM границы, МТП-IM плоскости в СМ, и ICC- SMP плоскости CM / подслизистой границы. Сырье изображений и deconvoluted изображения показано на рисунке. Шкала бар 20 мкм.

Рисунок 4. Представителю дважды иммунофлюоресценции из Ano1 (зеленый) и Кит (красный, АСК-2) в толстой кишке. Шкала бар 20 мкм.

Обсуждение

Интерстициальные клетки Кахала были изначально характеризуется Сантьяго Ramóón Кахаль ровно сто лет назад использованием метиленового синего и хромата серебра пятна желудочно-кишечного мышечной. Кахала первоначально думали МУС были нейронов на основе их процессами, которые напоминают аксонов и дендритов. В течение многих последующих лет, изучение биологии МТП было ограничено из-за отсутствия специфических маркеров до открытия, что КИТ не только выражается в МУС, но и необходимые для их развития ^6. С тех пор, КИТ иммунофлюоресценции широко используется при исследовании МТП биологии и привело также к оценке Международной торговой палаты в других сократительной органов, таких как мочевой пузырь. В последнее время ANO1 была определена в качестве второго надежным маркером МУС.

Там были многочисленные публикации в течение последних 15 лет с помощью иммунофлюоресценции для выявления ICC с помощью различных фиксации и монтаж техники. В наших руках "фиксированных замороженных" cryosections, которые были с префиксом параформальдегида и сахарозы защищены работает лучше по сравнению с ацетоном или параформальдегид после фиксации после cryosectioning. Для тотальных, мы обнаружили, что ацетон фиксации затем слизистой рассечение дает наиболее надежные результаты.

Исторически сложилось так, ACK-2 был комплект антител выбора для мыши МТП идентификации. Это крысиного моноклонального, которая признает внеклеточный домен, и это также блокирование антителом, которое вызывает кишечная непроходимость, когда оно сделано живых мышей. Тем не менее, ACK-2 эпитопа медленно уничтожены параформальдегида фиксации и не спасли с помощью стандартных методов поиска антигена. Мы обнаружили, что ACK-4 эпитопа более устойчив к параформальдегида фиксации. По сравнению с фиксированными замороженных блоков и секций, парафин блоков и секций сохраняет морфологию лучше и более пригодными для долгосрочного архивирования (рис. 4). Ни ACK-2, ни ACK-4 были успешно использованы в парафиновых срезах. Мы охарактеризовали что D13A2, новые кролика моноклональное антитело, работает исключительно хорошо в обоих фиксированных замороженных и парафиновых срезов желудочно-кишечного тракта.

Комплект выражается и в некоторых других типах клеток, в том числе меланоциты, кроветворные клетки, половых клеток, в частности, тучных клеток, которые также найдены в желудочно-кишечном тракте. К счастью, большинство тучных клеток находятся в слизистой оболочке, а не в мышечной. Двойное окрашивание кролика против Ano1 и крысы анти-Kit можно устранить без специфического окрашивания каждого антител (рис. 4). Стоит также отметить, что относительное выражение Kit и Ano1 между подклассами МУС выглядит иначе. Например, в тонкой кишке, Кит окрашивания значительно интенсивнее в myenteric ICC по сравнению с МТП глубоких мышц сплетения в то время как Ano1 окрашивания является сопоставимым.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (необязательно)
крысы анти-Kit антител (клон ACK-2)	eBioscience	14-1172	Используйте на 2μg/ml. Эпитоп теряется с overfixation.
крысы анти-Kit антител (клон ACK-4)	Cedarlane	CL8936AP	Используйте на 2μg/ml.
кроличьих анти-KIT антител (клон D13A2)	Сотовые сигнализации	3074	Использование при 1:100 разбавления. Только антитела, перечисленные здесь, что хорошо работает в парафиновых срезах.
кролика против антител Pgp9.5	Abcam	ab10404	Этикетки нейронов цитоплазме клетки. Полезные для маркировки нейронов myenteric сплетения. Используйте на 1:1000 разбавления.
кролика против антител Ano1	Abcam	ab53212	Используйте на 2μg/ml
Alexa Fluor 594 козьего анти-IgG крысы	Invitrogen	-11007	Используйте на 2μg/ml
Alexa Fluor 488 козьего анти-IgG кролика	Invitrogen	-11008	Используйте на 2μg/ml
Иглы для кормления животных	Рыболов	01-208-87	Кремний наконечником иглы полезны для промывки ЖКТ взрослых мышей
Тупой иглой	Becton Dickison	305180	Тупые иглы полезны для промывки ЖКТ предварительно отучить щенка
Продлите Золотой реагента antifade с DAPI	Invitrogen	P-36931	Может использовать альтернативные жесткого установления монтажа сред с DAPI
Ткань-Tek Cryomold	Ткань-Tek	4557
Ткань-Tek октября	Ткань-Tek	4583
32% Параформальдегид (10 мл запаянных ампулах)	Е. М. наук	15714	Открытое запаянных ампулах и развести на 4% непосредственно перед употреблением
Блокировка буфера			5% сыворотки козьего, 0,1% Тритон Х-100 в PBS