Agua Morris laberinto de prueba para los déficits de aprendizaje y memoria en ratones de Alzheimer modelo de enfermedad

Resumen

El laberinto acuático de Morris es una tarea para poner a prueba el comportamiento dependiente del hipocampo aprendizaje y la memoria. Ha sido ampliamente utilizada en el estudio de la neurobiología, la neurofarmacología y trastornos neurocognitivos en modelos de roedores.

Resumen

El laberinto acuático de Morris (MWM) se estableció por primera vez por el neurocientífico Richard G. Morris en 1981 para poner a prueba el aprendizaje dependiente del hipocampo, incluyendo la adquisición de memoryand espacial a largo plazo la memoria espacial ^1. El MWM es un procedimiento relativamente simple que suele estar compuesta de seis días de prueba, la principal ventaja es la diferenciación entre el espacio (plataforma oculta) y no espaciales (visible de la plataforma) las condiciones de ^4.2. Además, el entorno de prueba MWM reduce la interferencia olor ruta ^5. Esto ha llevado a la tarea de ser utilizado ampliamente en el estudio de la neurobiología y neurofarmacología de aprendizaje espacial y la memoria. El MWM juega un papel importante en la validación de modelos de roedores para los trastornos neurocognitivos como la enfermedad de Alzheimer ^{6, 7.} En este protocolo, se discutió el procedimiento típico de MWM para el aprendizaje y la memoria de las pruebas y análisis de datos de uso común en ratones la enfermedad de Alzheimer modelo transgénico.

Protocolo

1. Preparación

1. Equipo de preparación
   1. Obtener una piscina circular con un diámetro de 150 cm y una profundidad de 50 cm (Fig. 1). Si el uso de ratones negro, un grupo blanco se debe utilizar, si se utiliza el ratón blanco, un charco negro se debe utilizar.
   2. Organizar la sala de tal manera que el animal se está probando no puede ver el experimentador durante la prueba. Esto se puede lograr con cortinas o mamparas.
   3. Coloque las señales de alto contraste espacial de la habitación, y / o en el interior de la piscina en un lugar que estaría por encima de la superficie del agua.
   4. Coloque una plataforma de 10 cm de diámetro en la piscina - blanco para una piscina de color blanco, de plexiglás transparente de un charco negro. Llenar la piscina con el agua hasta que la plataforma es de 1 cm por encima de la superficie del agua. Deje que el agua alcance la temperatura ambiente (22 ° C). Dependiendo de la temperatura del agua que puede tomar de uno a tres días, o alternativamente de agua caliente se puede agregar a acelerar el equilibrio.
2. Software de preparación de
   1. Calibrar la piscina en el software del ordenador para que la cámara puede crear información de la distancia física de la información basadas en píxeles. Divida el grupo en 4 cuadrantes. Especificar la zona de la plataforma como una zona de variables que pueden cambiar con cada ensayo. Crear cinco subzonas de la plataforma - una en cada cuadrante, y uno en el centro de la piscina. Guardar la calibración y el uso que para el resto de días de prueba. (Ver Fig. ejemplo. 2).
   2. Establecer el tiempo de la prueba máxima de 60 seg. Si el ratón se encuentra la plataforma antes de este tiempo, el programa de software para detener el ensayo cuando la plataforma se encuentra.
   3. Especificar el programa para comenzar el seguimiento de forma automática, cuando el experimentador sale de la zona de pruebas. Utilizar cualquier "reflejo la reducción al mínimo" las opciones de su paquete de software proporciona.
   4. Longitud de la pista camino, la latencia de escape, y el tiempo dedicado en cada cuadrante.

2. Día 1: Plataforma Visible

1. Programa de ordenador
   1. Cargar la calibración de la piscina en el software de seguimiento.
   2. Crear cinco ensayos, con un intervalo entre ensayos apropiados para su experimento. Programa de la localización de la plataforma y la dirección de partida difieran con cada ensayo. Ver Tabla 1 para un protocolo de ejemplo.
2. El procedimiento de prueba
   1. La transferencia de los ratones de sus facilidades de vivienda a la sala de conducta. Mantener a los ratones en una zona donde no pueden ver la piscina o el entorno espacial. Vamos a adaptarse al nuevo entorno por lo menos 30 minutos antes del ensayo.
   2. Colocar una bandera en la plataforma para aumentar su visibilidad.
   3. Para comenzar la prueba, levantar el ratón de la jaula por la base de la cola. Apoyar el mouse a medida que llega a la zona de pruebas. Levantar el ratón por la base de la cola, coloque suavemente el ratón en el agua, frente a la orilla de la piscina. Rápidamente salir de la zona de pruebas.
   4. Si el ratón se encuentra la plataforma antes de la 60 segundos de corte, permiten el ratón para permanecer en la plataforma de 5 segundos y luego devolverlo a su jaula. Si el ratón no se encuentra la plataforma, coloque el ratón en la plataforma y permitir que permanezca allí durante 20 segundos antes de volver a su jaula.
   5. Repita este procedimiento para todos los ratones en el camino. Comience cada estudio posterior con una localización de la plataforma y dirección diferentes de partida, como usted ha programado en su software.
   6. Cuando finalice la prueba, volver a los ratones a los servicios de vivienda. Los ratones se secó y normotermia está asegurada antes de regresar a las instalaciones de los animales.
   7. En preparación para el día siguiente, quite la bandera de la plataforma y agregue más agua a la piscina para sumergir la plataforma de 1 cm por debajo de la superficie.

3. Días 2-5: plataforma oculta

1. Programa de ordenador
   1. Cargar la calibración de la piscina en el software de seguimiento.
   2. Crear cinco ensayos, con un intervalo entre ensayos apropiados para su experimento. Programa de la localización de la plataforma de permanecer en la misma posición en todas las pruebas y los días, pero la dirección de partida son diferentes en cada prueba, cada día.
2. El procedimiento de prueba
   1. Para los ratones negro, añade que no es tóxico, pintura blanca, en polvo temperatura de la piscina y mezclar bien. Use suficiente pintura de tal manera que la plataforma sumergida no es visible desde la superficie del agua. Para ratones blancos, un charco negro con agua limpia y una plataforma de plexiglás transparente debe ser utilizado.
   2. Siga los pasos 2.2.3 a 2.2.6.

4. Día 6: Sonda de prueba

1. Programa de ordenador
   1. Cargar la calibración de la piscina en el software de seguimiento.
   2. Crear una prueba con ninguna zona de la plataforma, y ​​una dirección de partida. La dirección de partida más lejano del cuadrante plataforma utilizada en los días 2-5 se prefiere. Establecer la longitud de pista a 60 segundos.
2. El procedimiento de prueba
   1. Retire la plataforma de la piscina.
   2. Siga los pasos 2.2.3 a 2.2.6.

5. Análisis de los datos

1. Para cada día y cada media del ratón, el 5 pruebas para dar una longitud de trayectoria única y la latencia de escape para cada sujeto de la prueba. Calcular el error combinado adecuadamente. Para el día 6, sólo tiene que recoger la longitud del camino, la latencia de escape, y el tiempo invertido en el cuadrante de la plataforma para cada ratón.
2. Si existe cualquier diferencia entre los grupos en el día 1, lo más probable es un problema de visión en lugar de aprendizaje y la memoria. Sólo procederá con el análisis si no se observan diferencias en el día 1.
3. Comparar las curvas de aprendizaje para los días 2-5 con estadísticas apropiadas para el conjunto de datos. Una curva más pronunciada representa más rápida adquisición de la tarea; una curva menos profunda representa un déficit en la adquisición de la tarea. Los datos del día 2 al día 5 se analizan mediante ANOWA.
4. Para el día 6, comparar el porcentaje de tiempo en el cuadrante de la plataforma previamente aprendidas, utilizando las estadísticas apropiadas para el conjunto de datos. Un mayor porcentaje de tiempo en el cuadrante de la plataforma se interpreta como un mayor nivel de retención de la memoria.

6. Resultados representante

Hemos utilizado la prueba del laberinto acuático de Morris para examinar el efecto hipoxia sobre patogénesis de la EA (7) y el ácido valproico (VPA) 's potencial farmacéutico para el tratamiento de EA (6) en ratones transgénicos modelo de AD. La Figura 3 es el resultado representativo que en nuestro estudio sobre el efecto de VPA en los déficits de memoria en el modelo AD APP23 ratón (6). El día 1 (pruebas visibles de la plataforma), no hay diferencia entre el VPA grupos de tratamiento y de control de la latencia (Fig. 3A) y la longitud del camino (Fig. 3) lo que indica que ambos grupos tienen motor similar y las capacidades visuales. De esto podemos suponer que los ratones son capaces de ver la bandera de la plataforma y las pistas en los alrededores de medio ambiente, y pueden nadar aceptablemente. Para los días 2-5 (Día 1 a 4 de los ensayos plataforma oculta), el ejemplo muestra una diferencia en la latencia de escape (Fig. 3C) y longitud de la trayectoria (Fig. 3D) entre los grupos, lo que sugiere que los ratones tratados con VPA se desempeñaron significativamente mejor que los controles con el tiempo. Los resultados rastro de la sonda en el último día (día 6) muestran que el número de veces que los ratones viajaron en el tercer cuadrante, donde se colocó la plataforma oculta con anterioridad, fue significativamente mayor con el tratamiento con VPA en comparación con el control (Fig. 3E). Estos datos indican que el tratamiento con VPA mejora significativamente el déficit de la memoria se ve en APP23 ratones.

Figura 1. La configuración del equipo para el agua de Morris laberinto visible días plataforma de pruebas. La piscina está a salvo de que el experimentador con separadores de ambiente. Entorno espacial se encuentran en las paredes, y tal vez colocado en el interior de la piscina, por encima de la superficie del agua, si lo desea. La piscina se llena de agua clara, con la plataforma situada 1 cm por encima de la superficie. Una bandera se ha colocado en la plataforma para mejorar la visibilidad.

Figura 2. Captura de pantalla del laberinto-Cualquier ™ Sistema de Seguimiento de vídeo que demuestra la calibración de la piscina. La piscina se ve desde arriba por una cámara de seguimiento en blanco y negro analógico con un digitalizador RTV24. Varias zonas se definen en el software y el total se divide en cuatro cuadrantes. Una quinta, zona de la plataforma se introduce que puede variar entre los ensayos, con cinco ubicaciones posibles: NO, NE, SW, SE o Centro. Una línea de calibración (línea marcada en el centro) se agrega para permitir que el software para convertir distancias de píxeles en las distancias físicas.

Figura 3. Los resultados representativos para el laberinto acuático de Morris. El 7 meses APP23 ratones transgénicos portadores de genes humanos mutantes sueco APP fueron probados después de un mes de la vida diaria VPA (n = 30 ratones) o una solución vehículo (n = 30 ratones) inyecciones. (A) Durante el primer día de pruebas de la plataforma visible, el VPA tratamiento y control de ratones expuestos APP23 una latencia similar a escapar a la plataforma visible. P> 0,05 por estudiante de la t-test. (B) El VPA-tratamiento y de control APP23 ratones tenían similares distancias de natación antes de escapar a la plataforma visible en la prueba de plataforma visible. P> 0,05 por estudiante de la t-test. (C) En las pruebas de plataforma oculta, VPA tratados APP23 ratones mostraron una latencia más corta para escapar a la plataforma oculta en el 3 ^º y 4 ^º día, P <0,001 por ANOVA. (D) VPA-tratados APP23 ratones tenía una longitud más corta nadar antes de escapar a la plataforma oculta en el 3 ^º y 4 ^º día, P <0.01 por ANOVA. (E) En el ensayo de la sonda en el día sexto, el VPA-tratados APP23 ratones viajó en el tercer cuadrante, donde se colocó la plataforma oculta anteriormente, los tiempos significativamente más que los controles. * P <; 0,005 por estudiante de la t-test. (Adaptado y reimpreso de la Revista de Medicina Experimental 205, 2781-2789, 2008, Rockefeller University Press, publicado originalmente en J. Exp Med doi:... 10.1084/jem.20081588) (6).

	Día 1		Día 2	Día 3	Día 4	Día 5	Día 6
	Plataforma de localización	Dirección de partida	Ubicación de la plataforma: SW ubicación inicial de la siguiente manera:				Ninguna otra plataforma.
Prueba 1	SO	S	W	N	N	E	N
Ensayo 2	Noroeste	N	S	W	E	S
Prueba de 3	NE	S	N	E	W	W
Ensayo 4	Centro	E	E	W	S	E
Prueba de 5	SE	W	S	S	N	N

Tabla 1. Muestra de agua laberinto del protocolo *
* Tenga en cuenta cómo tanto la posición de la plataforma y cambiar de dirección a partir del día 1, mientras que en los días 2-5 de la posición de la plataforma se mantiene constante, mientras que los cambios de dirección de partida. El día 6, no hay una plataforma y un único ensayo. La dirección de partida para el día 6 es el más alejado de la ubicación de la plataforma anterior (SW), de modo que los ratones tienen que viajar una cierta distancia antes de entrar en el cuadrante de la plataforma previamente aprendidas.

Discusión

Edad, sexo, especie, variedad y las diferencias influyen en el rendimiento MWM (8). Los estudios indican que los ratones de edad tienen un desempeño pobre en el MWM, mientras que los roedores machos se desempeñan mejor que las mujeres, además, flotante es más pronunciada en los ratones que las ratas (9, 10). Por lo tanto, estos elementos deben ser equiparados en todas las pruebas. La evidencia también sugiere que los animales estresados ​​tienen un rendimiento en el MWM (11), los factores ambientales que por lo tanto puede causar estrés, como la temperatura, la luz y el ruido, deben ser controlados y se mantiene constante durante la tarea.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Comentarios (opcional)
Vídeo AnyMaze Sistema de Seguimiento	Empresa Stoelting
Pintura al temple	Reeves y Poole Grupos	Blanco, en polvo