Morris Teste Maze Água para déficits de aprendizagem e memória em camundongos Alzheimer Disease Modelo

Resumo

O labirinto aquático de Morris é uma tarefa comportamental para testar hipocampo-dependente aprendizagem e memória. Tem sido amplamente utilizada no estudo da neurobiologia, neurofarmacologia e distúrbios cognitivos em modelos de roedores.

Resumo

O labirinto aquático de Morris (MWM) foi estabelecido pela primeira vez pelo neurocientista Richard G. Morris, em 1981, a fim de testar hipocampo-dependente de aprendizagem, incluindo a aquisição de espaço de memória a longo prazo memoryand espacial ^1. O MWM é um procedimento relativamente simples que consiste normalmente de seis ensaios dia, a principal vantagem é a diferenciação entre o espacial (plataforma escondida) e não-espaciais (visível plataforma) condições ^2-4. Além disso, o ambiente de teste MWM reduz a interferência odor trilha ^5. Isto levou a tarefa a ser amplamente utilizado no estudo da neurobiologia e neurofarmacologia da aprendizagem espacial ea memória. A MWM tem um papel importante na validação de modelos de roedores para transtornos neurocognitivos, como a Doença de Alzheimer ^{6, 7.} Neste protocolo, discutimos o procedimento típico da MWM para o aprendizado e memória teste e análise de dados comumente usados ​​na doença de Alzheimer camundongos transgênicos modelo.

Protocolo

1. Preparação

1. Preparação de equipamento
   1. Obtenção de uma piscina circular com um diâmetro de 150 centímetros e uma profundidade de 50cm (Fig. 1). Se estiver usando ratos pretos, uma piscina de branco deve ser usado, se utilizando ratos brancos, uma piscina de preto deve ser usado.
   2. Organizar a sala de tal forma que o animal a ser testado não pode ver o experimentador durante o teste. Isso pode ser feito com cortinas ou divisórias.
   3. Coloque sinais de alto contraste espacial sobre o quarto, e / ou no interior da piscina em um local que seria acima da superfície da água.
   4. Coloque uma plataforma de 10 centímetros de diâmetro na piscina - branco para uma piscina branco, plexiglass claras para uma piscina de preto. Encher a piscina com água até a plataforma é um centímetro acima da superfície da água. Deixe a água atingir a temperatura ambiente (22 ° C). Dependendo da temperatura da água isso pode demorar 1-3 dias, ou, alternativamente, a água quente pode ser adicionada para acelerar o equilíbrio.
2. Preparação de software
   1. Calibrar a piscina no software de computador para que a câmera pode criar informações distância física com base em pixel informações. Dividir a piscina em 4 quadrantes. Especificar a zona de plataforma como uma zona variável, que pode mudar com cada tentativa. Criar 5 subzones plataforma - um em cada quadrante, e um no centro da piscina. Salvar a calibração e usá-lo para os dias de teste restante. (Veja Fig. exemplo. 2).
   2. Definir o tempo de julgamento máximo de 60 seg. Se o mouse encontra a plataforma antes deste tempo, o programa de software para parar o teste quando a plataforma for encontrada.
   3. Especificar o programa para começar a acompanhar automaticamente, quando o pesquisador sai a área de testes. Utilizar qualquer "reflexão minimização" as suas opções de pacote de software fornece.
   4. Faixa de percurso, a latência de escape, eo tempo gasto em cada quadrante.

2. Dia 1: Plataforma Visible

1. Programa de computador
   1. Carregar a calibração piscina no software de rastreamento.
   2. Criar cinco ensaios, com um intervalo inter-julgamento apropriado para a sua experiência. Programa a localização da plataforma e direção começando a discordar de cada tentativa. Ver Tabela 1 para um protocolo de exemplo.
2. Procedimento de teste
   1. Transferir os ratos a partir de sua instalação para a sala de comportamento. Manter os ratos em uma área onde eles não podem ver a piscina ou de informações espaciais. Deixe-os ajustar ao novo ambiente por pelo menos 30 minutos antes do teste.
   2. Colocar uma bandeira na plataforma para aumentar a sua visibilidade.
   3. Para começar a testar, levante rato da gaiola casa pela base da cauda. Apoiar o mouse como você trazê-lo para a área de testes. Levantar o mouse pela base da cauda, ​​coloque delicadamente o mouse para dentro da água, de frente para a borda da piscina. Rapidamente deixar a área de testes.
   4. Se o mouse encontra a plataforma antes do sec 60 cut-off, deixe o mouse para ficar na plataforma durante 5 segundos e depois retorná-lo à sua gaiola. Se o mouse não encontrar a plataforma, coloque o mouse sobre a plataforma e permitir que ele fique lá por 20 segundos antes de voltar para sua gaiola em casa.
   5. Repita o procedimento para todos os ratos na trilha. Começam cada tentativa subsequente, com uma localização plataforma diferente e direção de partida, como você programou em seu software.
   6. Quando o teste estiver completo, o retorno dos ratos para as suas instalações de habitação. Os ratos são secas fora e normotermia é assegurada antes de retornar à facilidade animal.
   7. Em preparação para o dia seguinte, retire a bandeira da plataforma e adicionar água para a piscina para submergir a plataforma para um centímetro abaixo da superfície.

3. Dias 2-5: plataforma escondida

1. Programa de computador
   1. Carregar a calibração piscina no software de rastreamento.
   2. Criar cinco ensaios, com um intervalo inter-julgamento apropriado para a sua experiência. Localização do programa a plataforma a permanecer na mesma posição em todos os ensaios e dias, mas tem a direção de partida são diferentes com cada ensaio, a cada dia.
2. Procedimento de teste
   1. Para os ratos pretos, adicione atóxico, branco, pintura a têmpera em pó para a piscina e misture bem. Use bastante pintura de tal forma que a plataforma submersa não é visível a partir da superfície da água. Para ratos brancos, uma piscina de preto com água limpa e uma plataforma de plexiglass transparente deve ser usado.
   2. Siga os passos 2.2.3 a 2.2.6.

4. Dia 6: Trial Probe

1. Programa de computador
   1. Carregar a calibração piscina no software de rastreamento.
   2. Criar um julgamento sem zona de plataforma, e uma direção de partida. A direção de partida mais distante do quadrante plataforma utilizada em 2-5 dias é o preferido. Definir a duração trilha para 60 seg.
2. Procedimento de teste
   1. Remova a plataforma da piscina.
   2. Siga os passos 2.2.3 a 2.2.6.

5. Análise de dados

1. Para cada dia e cada rato média, os 5 estudos para dar um comprimento de caminho único e latência de escape para cada assunto de teste. Calcular o erro combinado de forma adequada. Para o dia 6, simplesmente recolher o comprimento do caminho, a latência de escape, eo tempo gasto no quadrante da plataforma para cada rato.
2. Se as diferenças existem entre os grupos no 1 º dia, é provavelmente um problema com a visão ao invés de aprendizado e memória. Apenas proceder com a análise se não houver diferenças são vistas no dia 1.
3. Compare as curvas de aprendizagem para os dias 05/02 usando estatísticas adequadas para o seu conjunto de dados. A curva mais íngreme aquisição representa mais rápido tarefa; uma menor curva representa um déficit na aquisição de tarefas. Os dados do dia 2 ao dia 5 são analisados ​​usando ANOWA.
4. Para o dia 6, compare o percentual de tempo gasto no quadrante da plataforma anteriormente aprendidas, usando estatísticas adequadas para o seu conjunto de dados. A maior porcentagem de tempo gasto no quadrante da plataforma é interpretado como um maior nível de retenção da memória.

6. Resultados representante

Temos utilizado o teste de labirinto aquático de Morris para examinar o efeito da hipóxia sobre a patogênese da AD (7) e ácido valpróico (VPA) 's potencial farmacêutico para o tratamento AD (6) em camundongos transgênicos modelo AD. Figura 3 é o resultado representante relatamos em nosso estudo sobre o efeito VPA sobre déficits de memória no modelo do rato APP23 AD (6). No dia 1 (ensaios plataforma visível), não há diferença entre o VPA tratados e grupo controle na latência (Fig. 3A) e comprimento do caminho (Fig. 3A), indicando que ambos os grupos têm motor semelhante e as capacidades visual. A partir disso, assume os ratos são capazes de ver a plataforma sinalizadas e as pistas no ambiente circundante, e pode nadar aceitável. Para os dias 05/02 (Dia 1-4 de ensaios plataforma escondida), o exemplo mostra a diferença na latência de escape (Fig. 3C) e comprimento do caminho (Fig. 3D) entre os grupos, sugerindo que os ratos tratados VPA desempenho significativamente melhor do que os controles ao longo do tempo. A sonda resultados fuga no último dia (dia 6) mostram que o número de vezes que os ratos viajou para o terceiro quadrante, onde a plataforma escondida foi previamente colocado, foi significativamente maior com VPA tratamento comparado ao grupo controle (Fig. 3E). Estes dados indicam que o tratamento VPA melhora significativamente a déficits de memória presentes no APP23 camundongos.

Figura 1. Configuração de equipamentos para a Água dias Maze teste Morris visível plataforma. A piscina está protegido contra o experimentador usando divisores de quarto. Pistas espaciais estão localizados nas paredes, e talvez colocados no interior da piscina, acima da superfície da água, se desejar. A piscina está cheia com água limpa, com a plataforma situado 1cm acima da superfície. A bandeira foi colocada na plataforma para melhorar a visibilidade.

Figura 2. Captura de tela a partir do Qualquer Maze-Tracking System ™ Video demonstrando calibração piscina. A piscina é visto de cima por uma câmera de monitoramento analógico a preto e branco com uma Digitizer RTV24. Várias zonas são definidas dentro do software e do pool total é dividido em quatro quadrantes. Um quinto, zona plataforma está inserida, que pode variar entre ensaios, com cinco localizações possíveis: NW, NE, SW, SE, ou Centro. Uma linha de calibração (linha assinalada através do centro) é adicionado para permitir que o software para converter distâncias pixel em distâncias físicas.

Figura 3. Resultados representativos para o labirinto aquático de Morris. O 7 meses APP23 camundongos transgênicos suporte humano sueco gene mutante APP foram testados após um mês de diária VPA (n = 30 ratos) ou solução veículo (n = 30 ratos) injeções. (A) Durante o primeiro dia de testes da plataforma visível, o VPA tratados e controle APP23 camundongos apresentaram uma latência semelhante ao escapar para a plataforma visível. P> 0,05 por aluno t-teste. (B) O VPA-tratados e controle APP23 ratos tiveram semelhante distâncias de natação, antes de fugir para a plataforma visível no teste de plataforma visível. P> 0,05 por aluno t-teste. (C) Em testes plataforma escondida, VPA tratados APP23 ratos mostraram um menor latência para escapar para a plataforma escondida no 3 ^º e 4 ^º dia, P <0,001 por ANOVA. (D) A VPA-tratados APP23 ratos tiveram um comprimento menor de natação, antes de fugir para a plataforma escondida no 3 ^º e 4 ^º dia, P <0,01 por ANOVA. (E) No julgamento da sonda no dia 6, o VPA-tratados APP23 ratos viajou no terceiro quadrante, onde a plataforma escondida foi previamente colocado, significativamente mais vezes do que os controles. * P <; 0,005 por aluno t-teste. (Adaptado e reproduzido a partir de The Journal of Experimental Medicine 205, 2781-2789, 2008, Rockefeller University Press, Originalmente publicado em Exp Med J. doi:... 10.1084/jem.20081588) (6).

	1 dia		Dia 2	Dia 3	Dia 4	Dia 5	6 º dia
	Localização da plataforma	Direção de partida	Localização da plataforma: SW Começando Localização da seguinte forma:				Nenhuma plataforma.
Ensaio 1	SW	S	W	N	N	E	N
Ensaio 2	NW	N	S	W	E	S
Experimento 3	NE	S	N	E	W	W
O ensaio 4	Centro	E	E	W	S	E
Julgamento 5	SE	W	S	S	N	N

Tabela 1. Amostra de água * protocolo labirinto
* Observe como tanto a posição da plataforma e começar mudar de direção no dia 1, enquanto que nos dias 05/02 a posição da plataforma permanece constante, enquanto as mudanças de direcção partida. No dia 6, não existe uma plataforma e um único ensaio. A direção de partida para o dia 6 está mais distante do local da plataforma anterior (SW), para que os ratos devem viajar a alguma distância antes de entrar no quadrante da plataforma previamente aprendido.

Discussão

Idade, sexo, espécie e diferenças tensão influenciar o desempenho MWM (8). Estudos indicam que os ratos idosos têm um desempenho ruim na MWM, enquanto roedores machos têm melhor desempenho que as fêmeas, além disso, flutuante é mais pronunciada em ratos do que os ratos (9, 10). Portanto, esses elementos devem ser equiparados em todos os testes. Evidência também sugere que animais estressados ​​desempenho mais fraco no MWM (11), fatores ambientais, portanto, o que pode causar estresse, tais como temperatura, luz e ruído, deve ser monitorado e mantido constante ao longo da tarefa.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Comentários (opcional)
AnyMaze Sistema de Rastreamento de Vídeo	Empresa Stoelting
Tinta Tempera	Grupos Reeves & Poole	Branca, em pó