Producción y la detección de especies reactivas del oxígeno (ROS) en los cánceres

Resumen

Aquí proponemos métodos sencillos para probar y evaluar la presencia de especies reactivas del oxígeno en las células.

Resumen

Las especies reactivas del oxígeno incluyen una serie de moléculas que dañan el ADN y ARN, y se oxidan las proteínas y los lípidos (peroxidación lipídica). Estas moléculas reactivas contienen un átomo de oxígeno y son H ₂ O ₂ (peróxido de hidrógeno), NO (óxido nítrico), O ₂ ^- (anión), peroxinitrito (ONOO ^-), ácido hydrochlorous (HOCl), y el radical hidroxilo (OH ^-) .

Especies reactivas de oxígeno se producen no sólo en situaciones patológicas (cáncer, isquemia reperfusión /, patologías neurológicas y cardiovasculares, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias ^{1, 2} enfermedades autoinmunes, etc ...), sino también en situaciones fisiológicas (no patológicas), tales como el metabolismo celular ^{3 , 4.} De hecho, ROS juegan un papel importante en muchas vías de señalización celular (proliferación, activación de las células ^{5, 6, 7} migración, etc.). ROS puede ser perjudicial (entonces se conoce como"El estrés oxidativo y nitrosativo") cuando se produce en grandes cantidades en los compartimentos intracelulares y las células responden en general a ROS por upregulating antioxidantes como la superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT), glutatión peroxidasa (GPx) y glutatión (GSH), que protege ellas mediante la conversión de los peligrosos radicales libres a las moléculas inofensivas (por ejemplo, agua). Las vitaminas C y E también se han descrito como basureros ROS (antioxidantes).

Los radicales libres son beneficiosos en pequeñas cantidades ^3. Macrófagos y neutrófilos respuestas inmunes mediadas por involucrar a la producción y liberación de NO, que inhibe virus, patógenos y la proliferación del tumor ^8. El NO también reacciona con otros ROS y por lo tanto, también tiene un papel como un desintoxicante (scavenger ROS). Por último, no actúa sobre los vasos para regular el flujo de sangre que es importante para la adaptación del músculo al ejercicio prolongado ^{9, 10.} Varias publicaciones han demostrado también que las ROS participan en sens insulinapositividad ^{11, 12.}

Numerosos métodos para evaluar la producción de ROS se encuentran disponibles. En este artículo nos proponemos varias pruebas sencillas, rápidas y asequibles, estos ensayos han sido validadas por numerosas publicaciones y se usan rutinariamente para detectar ROS o sus efectos en células de mamíferos. Aunque algunos de estos ensayos de detección de múltiples ROS, otros detectan un solo ROS.

Protocolo

1. La detección de ROS con carboxi-H ₂ DCFDA

Carboxi-H ₂ DCFDA no es fluorescente, pero en presencia de ROS, cuando este reactivo se oxida, se convierte en verde fluorescente.

1. Inmediatamente antes de su uso, preparar una solución de frescos de carboxi-H ₂ DCFDA en dimetilsulfóxido estéril (DMSO) o el 100% de etanol. Evitar la repetición descongelar / congelar los ciclos de su tinte.
2. Se lavan las células con solución salina tamponada con HEPES (HBSS) o tampón fosfato salino (PBS) para eliminar los restos del medio original.
3. La carga de las células con el colorante (y el tinte de control, véase el punto la nota). En este ensayo hemos utilizado Jurkat, una línea celular de leucemia humana. Use carboxi-H ₂ DCFDA a una concentración final de 1μM en medio de cultivo regular con suero reducido (2%).
4. Incubar los cultivos durante 30 minutos en la oscuridad, en una incubadora convencional (37 ° C, 5% CO2). Descartar las soluciones colorantes utilizados.
5. Quitar carboxi-H ₂ DCFDA que contienen medio y lavar dos veces con HBSS o PBS. A partir de este paso adelante, a proteger las células de la luz.
6. Añadir un nuevo soporte de la droga de elección para la carboxi-H ₂ DCFDA células cargadas e incubar como se desee. Para este ejemplo vamos a usar H ₂ O ₂ (0,03%) durante 1 hora.
7. ROS evaluar de inmediato el análisis de las células por citometría de flujo a través del canal FL1 (fluorescencia verde), o mediante un lector de placas de fluorescencia, o por microscopía de fluorescencia. La fluorescencia se puede detectar mediante el uso de longitudes de onda de excitación y emisión que son apropiados para la fluorescencia verde.

Nota: Los controles deberán incluir carboxi-H ₂ DCFDA cargado las células no tratadas y teñidas las células no tratadas. Carboxi-H ₂ DCFDA se conoce para detectar peróxidos, pero también podría ser oxidado por otros ROS. Este reactivo también puede ser modificado por otros medios, colorantes de oxidación de control insensible como el 5 - (y-6)-carboxi-2 ', 7'-diclorodiacetato ofluorescein (carboxi-DCFDA) por lo tanto, deben incluirse en la prueba.

2. La medición del óxido nítrico (NO)

Usted tendrá que sulfanilamida y N-1-napthylethylenediamine soluciones dihidrocloruro (NED), y el nivel de nitritos. Este ensayo se denomina ensayo de Griess.

Solución NED: Haga una solución al 0,1% de diclorhidrato de N-1-napthylethylenediamine diluida en solución estéril water.Sulfanilamide: Haga una solución al 1% de sulfanilamida diluido en ácido fosfórico al 5%. Estándar de nitrito: Diluir el 0,1 M de patrón de nitrito de sodio a 100μM en medio estéril, hacer una serie de dilución en el mismo medio.

Condiciones de almacenamiento: Almacene los productos químicos según las instrucciones del fabricante a temperatura ambiente. Una vez reconstituido, la NED y las soluciones de sulfanilamida se almacenan inmediatamente después de su uso a 4 ° C, en la oscuridad, y por un máximo de 3 meses.

1. Las células de cultivo en una placa de 96 pocillos,uso por triplicado para cada condición, e incluyen controles adecuados de acuerdo con sus experimentos.
2. Tratamiento de las células para inducir la producción de NO. En nuestro experimento utilizamos lipopolisacárido (LPS) (100 ng / ml) e IL-4 recombinante para el tratamiento de las células. En este protocolo, el RAW 264.7, una línea celular de macrófagos de ratón (mouse leucémicas línea celular de macrófagos monocitos).
3. En el día de la determinación, tanto de los reactivos a temperatura ambiente.
4. Girar el plato, recoger los sobrenadantes celulares y la transferencia de 50μl con una nueva placa de 96 pocillos. Prepare limitar los pozos de dilución de la solución madre de patrón para hacer una curva estándar.
5. Añadir 50μl de la solución de sulfanilamida a cada muestra y control, así y mezclar bien.
6. Incube a temperatura ambiente durante 10 minutos en la oscuridad.
7. Añadir 50μl de solución de clorhidrato de N-1-napthylethylenediamine a cada muestra y control, así y mezclar bien.
8. Incube a temperatura ambiente durante 10 minutos en la oscuridad.
9. Medida Absorbana inmediatamente con un lector de placas con filtro de 520 nm de longitud de onda entre 550 nm y.

Si usted utiliza diferentes plato / plato de tamaño, el uso 1/1/1 volumen para cada solución y el sobrenadante de la muestra.

Un color violeta aparecerá en los pozos positivos. Los resultados obtenidos con el estándar le ayudará a comprobar la estabilidad de sus soluciones.

3. La detección de ROS acción: proteínas oxidadas

Un método diferente para identificar la producción de ROS es ver el resultado final mediante la detección de la oxidación de las proteínas. De hecho, ROS modificar el glutatión, un antioxidante que se expresa en la mayoría de las células y juega un papel protector contra las ROS. Después de la oxidación por ROS, la modificación del glutatión reducido (GSH) se traduce en la sulfhidrilo (tiol) del grupo de la cisteína estar vinculado a un glutatión segundo a través de un puente disulfuro. Esto lleva a la formación de una proteína dimerizados (GSSG oxidada proteína). GSH puede ser restaurada a través de la modificación de GSSG por la enzima glutatión reductasa. El aumento en el cociente GSSG / GSH refleja el estrés oxidativo. El siguiente ensayo se basa en la detección y cuantificación de estas proteínas oxidadas. Este método no es selectivo para ROS específicos, sino más bien detecta los efectos del NO, H ₂ O _2, O ₂ ^- y otros ROS. Aquí se mide la cantidad total de oxidado (GSSG) y reducido (GSH) glutatión con señales bioluminiscentes.

1. Semillas de las células en una placa de 96 pocillos (blanco / transparente, fondo plano), como de costumbre. Para nuestro experimento, se utilizó 1x10 ⁴ células por pocillo de adherentes y Raw 264.7 A549 y células Jurkat suspensión. Dependiendo del tamaño de sus células estos números podrían ser ajustados. Recomendamos a las células de la placa adherida al día antes de la prueba que les permita conectar a la placa. Suficientes pozos deben estar preparados para la detección de proteínas oxidadas y reducidas, así como de "único medio" ylas células no tratadas como controles. Use triplicado en todas las condiciones.
2. Tratar las células con su medicamento durante el tiempo necesario. Aquí se tratan las células Jurkat y las células A549 durante 1 hora con H ₂ O ₂ (a 5 mm y 2,5 mm respectivamente). Raw 264,7 células fueron tratadas con 200ng/ml de LPS durante 16 h. Durante este tiempo de incubación, llevar a todos los reactivos a temperatura ambiente (TA). Hacer todos los reactivos no más de 30 minutos antes de realizar la prueba. La tabla siguiente muestra los volúmenes de los reactivos por pozo. Cuando sea posible, es importante para eliminar los medios de comunicación que contiene el agente reductor antes de proceder con la prueba.

	Células adherentes		Células en suspensión
	Lisis total de Glu	Oxidado Glu Lisis	Lisis total de Glu	Oxidado Glu Lisis
NEM, 25 mM	ninguno	0.5μl	ninguno	0.5μl
Luciferina-NT	1 l	1 l	1 l	1 l
Tampón de lisis pasiva, 5X	10μl	10μl	10μl	10μl
Agua destilada	39.0μl	38.5μl	14μl	13.5μl
El volumen final por pocillo	50μl	50μl	25μl	25μl

3. Quitar medio de pozos con células adherentes. No quite medio de pozos con células en suspensión.
4. Añadir el reactivo reducido lisis glutatión glutatión oxidado o reactivo de lisis de los pozos correspondientes y agitar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
5. Añadir el reactivo luciferina y la generación de incubate durante 30 minutos a temperatura ambiente.
6. Añadir el reactivo de detección luciferina y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente.
7. Lea la señal bioluminiscente en el momento de la integración de 0,25-1 por segundo y con un luminómetro lector de placas.

	Células adherentes	Células en suspensión
El número de células por pozo	1x10 4	1x10 4
De células en suspensión por drogas y +	100 l, para ser removido antes de 3,4	25μl, para no ser eliminado
El glutatión reducido reactivo de lisis	50 l	25μl
Reactivo de lisis glutatión oxidado	50 l	25μl
Luciferina reactivo generación	50 l	50 l
Luciferina reactivo de detección	100 l	100 l

4. Los resultados representativos:

Figura 1 La detección de ROS con carboxi-H2DCFDA tinte. Células Jurkat (línea celular humana de leucemia) tratados con H ₂ O ₂ se compararon con las células no tratadas. ROS induce la modificación de carboxi-H ₂ DCFDA que verde fluorescente detectada por citometría de flujo, el pico fluorescente H ₂ O ₂ células tratadas cambio en comparación con los picos en los controles (H ₂ O ₂ células tratadas teñidas con colorantes de oxidación insensible y no tratados con las células teñidas con carboxi-H ₂ DCFDA). Los resultados confirman la presencia de ROS en las células tratadas.

Figura 2 Detección of NO utilizando reactivos de Griess. RAW 264.7 (macrófago de ratón) fueron tratados con LPS e IL-4. Un aumento significativo en la producción de NO se detectó en las células tratadas en comparación con el control de las células no tratadas.

Las líneas celulares	No tratados	Tratados
Raw 264,7	13.0	8.3
A549	21.6	10.5
Jurkat	5.2	2.8

Tabla 1 La detección de ROS mediada por la oxidación de las proteínas. RAW 264,7 células fueron tratadas con LPS, Jurkat y A549 (cáncer de pulmón humano), las células fueron tratadas con H ₂ O _2. Los resultados se expresan como el cociente reducido (GSH) / oxidado (GSSG) glutatión. Cocientes más bajos de glutation (GSH) / (GSSG) se detectaron en las células tratadas en comparación concontrol de las células no tratadas, dejando al descubierto que las proteínas eran más oxidados en las células tratadas.

Discusión

Varias situaciones patológicas, como enfermedades inflamatorias, cáncer, isquemia / reperfusión, y también tratamientos como la radioterapia o la quimioterapia (cisplatino por ejemplo) induce una sobreproducción de ROS. Por lo tanto, la detección y medición de los niveles de ROS es importante en muchos estudios básicos, pre-clínicos y clínicos. Sin embargo, ROS tienen una vida media muy corta y puede ser complicado de detectar. Aquí, proponemos pruebas simples que se utilizan habitualmente y ampliamente acept...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
5 - (y-6)-carboxi-2 ', 7'-diacetato diclorofluoresceína (carboxi-DCFDA)	Las sondas moleculares	C369	control
carboxi-H 2 DCFDA	Las sondas moleculares	C400
Sulfanilamida	Sigma	S9251-100G
N-1-napthylethylenediamine dihidrocloruro	Sigma	N9125-10G
Nitrito estándar	Sigma	237213-100G
GSH / GSSG-Glo ensayo	Promega	V6612	Para cuantificar oxidado, reducido u oxidado / glutatión reducido