Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

Resumen

La extensión de la tienda que funciona con Ca ^{2 +} Entrada (SOCE) se puede controlar usando fluorescentes Ca ^{2 +} Indicadores. Minnesota ^{2 +} Temple de tales indicadores SOCE ensayos en células cultivadas y las fibras del músculo esquelético. Una técnica que permite la resolución espacial y temporal de SOCE por la imagen confocal de las fibras musculares mecánicamente aisladas, también se describe.

Resumen

Tienda operada de Ca ^{2 +} entrada (SOCE), antes denominado capacitiva de entrada de Ca ^{2 +,} es un mecanismo estrictamente regulado por la afluencia de Ca ^{2 +} extracelular en las células para reponer retículo agotado endoplasmático (ER) o retículo sarcoplásmico (SR) de Ca ^{2 +} tiendas ^1,2. Desde Ca ^{2 +} es un segundo mensajero en todas partes, no es sorprendente ver que SOCE juega un papel importante en una variedad de procesos celulares, incluyendo la proliferación, la apoptosis la transcripción de genes, y la motilidad. Debido a su gran incidencia en casi todos los tipos de células, incluyendo las células epiteliales y de los músculos esqueléticos, esta vía ha recibido un gran interés ^3,4. Sin embargo, la heterogeneidad de las características de Soce en diferentes tipos de células y la función fisiológica aún no están claras ^5-7.

Las propiedades funcionales de los canales de SOCE puede ser revelada por los estudios de patch-clamp, mientras que una gran cantidad de conocimiento acerca de thivía s se ha ganado por fluorescencia basados ​​en Ca ^{2 +} intracelular mediciones debido a su conveniencia y la viabilidad de selección de alto rendimiento. El objetivo de este informe es un resumen de algunos de fluorescencia basada en métodos para medir la activación de SOCE en la monocapa de células, células en suspensión y fibras musculares ^5,8-10. El más utilizado de estos métodos de fluorescencia es supervisar directamente la dinámica de la Ca ^{2 +} intracelular utilizando la relación de F y F _{340 nm 380 nm} (510 nm para la emisión de longitud de onda) de la radiométrica de Ca ^{2 +} indicador Fura-2. Para aislar la actividad de SOCE unidireccional de Ca ^{2 +} intracelular de liberación de Ca ^{2 +} de extrusión, un ensayo de Mn ^{2 +} enfriamiento se utiliza con frecuencia. Mn ^{2 +} se sabe que es capaz de penetrar en las células a través SOCE mientras que es impermeable a los procesos de extrusión de superficie de membrana o de la absorción de ER por Ca ^{2 +} bombas, debido a su ingenio afinidad muy altah Fura-2. Como resultado, el temple de Fura-2 fluorescencia inducida por la entrada de Mn ^{2 +} extracelular en las células representa una medición de la actividad de SOCE ^9. Medición radiométrico y el Mn ⁺² ensayos enfriamiento se puede realizar en un espectrofluorómetro cubeta basado en un modo de población de células o en un sistema basado en microscopio para visualizar las células individuales. La ventaja de las mediciones de una sola célula es que las células individuales sometidos a manipulaciones genéticas se pueden seleccionar con las buenas prácticas agrarias o de los periodistas RFP, lo que permite estudios en células modificadas genéticamente o mutado. Las características espacio-temporales de SOCE en el músculo esquelético estructuralmente especializado se puede lograr en las fibras musculares de piel por simultáneamente el control de la fluorescencia de dos baja afinidad Ca ^{2 +} indicadores destinados a los compartimientos específicos de la fibra muscular, tales como Fluo-5N en el RE y los Rhod 5N en la transversal túbulos ^9,11,12.

Protocolo

1. Ca ^{2 +} intracelular de medición de las células individuales

1. KYSE-150, un humano carcinoma de células escamosas de esófago (ECSS) línea celular se cultivaron en 5% de CO ₂ atmósfera a 37 ° C en medio RPMI mixto 1640/Ham 's F-12 (1:1) que contiene 5% de suero fetal bovino.
2. KYSE-150 células son transfectadas con los plásmidos que contienen cualquiera de ARNhc específicamente contra Orai1 o una secuencia codificada. Los plásmidos también incluye un gen que codifica la proteína roja fluorescente (RFP) como un reportero, que es impulsado por un promotor separado.
3. Las células se cultivan en placas de fondo de vidrio-(N 1,5 cubierta de vidrio, MatTek, MA) durante 48 horas.
4. Eliminar el medio y lavar las células con una solución salina equilibrada (BSS) (140 mM de NaCl, 2,8 mM de KCl, 2 mM de CaCl _2, 2 mM de MgCl _2, 10 mM HEPES, pH 7,2).
5. Añadir 1 ml de solución que contiene 2 mM BSS Fura-2 éster acetoximetilo (Molecular Probes) en el plato y envuelva todo el plato con papel aluminio para protect de la luz.
6. Se incuban las células durante 40 min a 37 ° C y luego se dejan durante un período adicional de 15 min a temperatura ambiente para permitir la hidrólisis del éster para ser completada. Se lavan las células dos veces con BSS.
7. Montar el plato en la etapa de Nikon TE200 microscopio invertido, el cual está conectado a PTI espectrofluorómetro, con longitudes de onda de excitación a 350 y 390 nm y emisión a 510 nm. Las longitudes de onda de excitación exactas para ser utilizados puede variar ligeramente dependiendo de la óptica de cada sistema individual. Los dos longitudes de onda con la mejor relación dinámica se determina por análisis de espectro de excitación Fura-2 sal en soluciones que contienen Ca ^{2 +} que van desde 0 a 39,8 micras (o mayor concentración a la que está saturado Fura-2 fluorescencia).
8. Establecer un sistema de perfusión por gravedad con 4 soluciones diferentes BSS: Ca ^{2 + (2} mM), EGTA (0,5 mM), EGTA-TG (thapsigargin, 5 M), Ca ^{2 +-2-APB} (un inhibidor de la SOCE, de 75 años M). Control computerizado y automatizado perfusisistemas de También se puede utilizar.
9. Seleccionar las células que expresan RFP en el modo de visualización.
10. Coloque la punta de la apertura del sistema de perfusión con un aumento de 10 veces hasta que la punta está justo encima de la región de interés en un ángulo de 45 grados.
11. Al mismo tiempo grabar las señales de fluorescencia F y F _{350nm 390nm.} Ratio (F _350nm / _390nm F) se muestra en la tercera ventana. Cambiar las soluciones de perfusión en el siguiente orden: Ca ^{2 +,} EGTA, Ca ^{2 +;} EGTA-TG, Ca ^{2 +,} Ca ^{2 +-2-APB.}

El protocolo anterior se puede modificar para la medición de Ca ^{2 +} intracelular en células del sistema de suspensión.

12. Cultura KYSE-150 células en un matraz T25 con la condición de cultivo mismo que el anterior.
13. Cuando las células alcanzan el 90% de confluencia, se elimina el medio y lavar las células con una solución BSS.
14. Añadir 2,5 ml de solución que contiene 2 mM BSS Fura-2 am y se incubalas células durante 40 min a 37 ° C seguido por desesterificación.
15. Retire el SRS, añadir 2,5 ml de tripsina en el matraz y se incuba a 37 ° C hasta que las células separar. Luego añadir 2,5 ml de medio de cultivo para detener la tripsinización y cosechar las células por centrifugación a 800 rpm durante 5 min.
16. Se lavan las células con medio de cultivo una vez más por centrifugación y se vuelva a suspender gránulos de las células en una solución BSS (sin adición de 2 mM CaCl _2, que contiene amplia mM Ca ^{2 +)} y contar el número de células por medio de un hematometer.
17. Añadir aproximadamente 10 ⁶ células en una cubeta de cuarzo (10 mm, las células Starna) y llenar el volumen de hasta 2 ml con BSS.
18. Colocar la cubeta (agitación con una barra magnética) en el espectrofluorómetro.
19. Simultáneamente grabar las señales de fluorescencia F _340nm y _380nm F con longitud de onda de emisión a 510 nm. El protocolo de ejecución es: BSS, la adición de 0,5 l EGTA (0,25 M de stock), la adición de 1 l thapsigargin(TG, 10 mM de existencias), la adición de 4 l de Ca ^{2 +} (1 M).

2. Mn ensayo temple en células cultivadas

1. Realizar longitud de onda de excitación de exploración de Fura-2 en soluciones que contienen diversos Ca ^{2 +} concentración que oscila de 0 a 39,8 mM para determinar la longitud de onda concentración de Ca independiente como el punto isosbéstico. Normalmente, el punto isosbéstico está en o alrededor de 360 ​​nm.
2. KYSE-150 células se cultivaron en placas de fondo de vidrio y se cargó con Fura-2 AM.
3. Establecer el sistema de perfusión con 5 diferentes soluciones BSS: Ca ^{2 + (2} mM), EGTA / TG (0,5 mM y 5 mM, respectivamente), Mn ^{2 +} (0,5 mM, sin adición de EGTA o Ca ^{2 +,} que contiene al Ca ^{2 +} en el rango mM), Mn ^{2 +} / 2-APB (75 mM), EGTA / Triton X-100 (0,1%).
4. Montar el plato en la platina del microscopio y seleccione la opción "Relación de excitación" modo con longitudes de onda de excitación a 360 nm y 390 y la emisión a 510nm.
5. Al mismo tiempo grabar las señales de fluorescencia F y F _{360 nm 390nm} con una relación de _{360 nm} (F / F _390nm) que aparecen en la tercera ventana. El protocolo de ejecución es: Ca ^{2 +} durante 1 minuto para estabilizar la fluorescencia, Mn ^{2 +} durante 30 segundos, EGTA / TG durante 10 min, Mn ^{2 +} durante 2 min, EGTA-Triton X-100 (0,1%) durante 1 minuto para obtener la lectura de fondo. Mn ^{2 +} / 2-APB solución puede utilizarse en lugar de Mn ^{2 +} a examinar el temple abolido fluorescencia, lo que indica que la entrada de Mn ^{2 +} es a través de la vía SOCE.

3. Mn ensayo temple en las células musculares

1. C2C12, una línea celular de ratón miogénica, se cultivaron en placas de fondo de vidrio en 5% de CO ₂ atmósfera a 37 ° C en medio DMEM que contenía 10% de suero fetal bovino, 10% de suero de caballo.
2. Después de que las células alcanzan la confluencia, el medio de cultivo se cambió a medio de diferenciación (quitar suero bovino fetal y reduccióne suero de caballo al 2,5%). Los mioblastos C2C12 se diferencian en miotubos después de 4 días.
3. Cargar C2C12 miotubos con una concentración final de 5 mM Fura-2 AM como se describe en 1.4-1.6.
4. Añadir una concentración final de 20 mM de N-bencil-p-tolueno sulfonamida (BTS) para inhibir las contracciones musculares y los artefactos de movimiento causados ​​por ellos y permitir 15 minutos antes de iniciar el experimento.
5. Montar el plato sobre la platina del microscopio conectado al dispositivo de PTI y cargar las siguientes soluciones de SRS en el sistema de perfusión: 2 Ca ^{2 + (2} mM), 0 Ca ^{2 +,} Mn ^{2 +} (0,5 mM); ² Mn ⁺ / TG (0,5 mM, 20 uM, respectivamente).
6. Establecer el sistema de perfusión como se describió anteriormente.
7. Al mismo tiempo grabar las señales de fluorescencia F y F _{360 Nm} con la Relación de _{390nm (360nm} F / F _390nm) que aparece en la tercera ventana. El protocolo de ejecución es: 2 Ca ^{2 +} durante 1 minuto, 0 Ca ^{2 +} durante 1 minuto a bajaush lejos de Ca ^{2 +,} Mn ^{2 +} durante 0,5 min, Mn ^{2 +} / TG durante 10 min, y Mn ^{2 +} / EGTA-Triton X-100 (0,1%).

4. SOCE espacial y temporalmente resuelta en las fibras musculares de piel

1. Prepare las siguientes soluciones.
   Isotónica tampón de Tyrode: 140 mM de NaCl, KCl 5 mM, HEPES 10 mM, 2 mM de MgCl _2, 2,5 mM de CaCl _2, pH 7,2, 290 mOsm
   El medio de cultivo: DMEM con suero de caballo al 2% y 1% de penicilina y estreptomicina
   La solución de lavado # 1: 109,6 mM de K-glutamato, 2 mM EGTA-KOH, 6,7 mM de MgCl _2, 2 mM de ATP, 6 mM de fosfato de creatina (CP), 20 mM de N, N-bis (2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico ácido (BES)-KOH, pH 7,0
   La solución de lavado # 2: 140 mM de K-glutamato, 5 mM EGTA-KOH, 6,5 mM de MgCl _2, 2 mM de ATP, 6 mM de CP, 20 mM de BES-KOH, pH 7,0
   Skinning solución: 140 mM de K-glutamato, 6,5 mM de MgCl _2, 2 mM de ATP, 6 mM de CP, 20 mM de BES-KOH, pH 7,0
   TT-cargasolución: 90,6 mM de K-glutamato, 18 mM Na-glutamato, 0,55 mM CaCl _2, 2 mM EGTA-KOH, 6,7 mM de MgCl _2, 5,4 mM de ATP, 15 mM PB, 0,0025 mg / ml de creatina quinasa (CK), 20 mM BES-KOH, 5 mM carbonilo cianuro de p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP), pH 7,0, PCA 7,0
   SR carga de solución: 107,8 mM de K-glutamato, 0,98 mM CaCl _2, 2 mM de EGTA-KOH, 6,6 mM MgCl _2, 5,4 mM de ATP, 15 mM de CP, 0,0025 mg / ml de CK, 20 mM de BES-KOH, 5 mM FCCP, pH 7,0, PCA 6,6
   SR agotan solución: 100 mM de K-glutamato, 40 mM Na-glutamato, 10 mM EGTA-KOH, 10 mM de 1,2-bis (o-aminofenoxi) etano-N, N, N ', N'-tetraacético (BAPTA ), 0,35 mM de MgCl _2, 0,5 mM de ATP, 1 mM de CP, 20 mM de BES-KOH, 5 mM FCCP, pH 7,0. 25 mM mM caffeine/20 thapsigargin (TG) se añaden antes de los experimentos.
2. Para diseccionar el extensor largo de los dedos (EDL) del músculo, en primer lugar establecer los ratones y los arreglos de la pierna en posición lateral, a continuación, retire la piel de la zona del tobillo hasta la rodilla, cortelas capas musculares superficiales de tejido para exponer la EDL, y cortar tanto los tendones superior e inferior para liberar el músculo EDL intacto, es importante mantener los tendones el mayor tiempo posible. La EDL se transfiere a una solución de Tyrode que contenía 0 Ca ^{2 +} y 0,1 mM EGTA a impedir la realización de las contracciones.
3. Bajo un microscopio estereoscópico, utilice dos pinzas para mantener bajos los tendones de inserción y dividir el músculo EDL en dos paquetes. Repita el proceso para obtener 4 y 8 paquetes. Es crítico que los tendones permanecen para cada uno de los 8 paquetes al final del proceso. Si se pierden de algunos paquetes, deshacerse de ellos.
4. Bajo un microscopio estereoscópico, cada tira paquete EDL se quejó en ambos tendones y se estira con cuidado hasta 3 ó 4 separadas las fibras musculares individuales se dejan intactos de un tendón en ambos lados.
5. Ponga una gota de Ca ^{2 +} tampón Tyrode libre en el medio del plato de fondo de vidrio, establecer las tiras EDL directamente en el plato, eliminar rápidamente la medida de lo posible de lasolución, entonces la cinta a ambos tendones con cinta adhesiva resistente al agua, y asegúrese de que la cinta esté bien apretada. Lavar la primera fibra con el 0 Ca ^{2 +} solución y luego con un 2,5 mM de Ca ^{2 +} solución 2 veces. Si la fibra hiper-contratos y el daño se nota, deseche la fibra.
6. Si es necesario, la fibra puede ser cultivado durante 96 horas, lo que permite manipulaciones genéticas. Lávese las de fibra de 3 veces con medio de cultivo completo y añadir 2 ml de medio en el plato, colocar las emisiones de CO ₂ y el 37 5% incubadora ° C. Antes de cada experimento, examinar las fibras musculares y descartar los que no tienen estrías claras o con signos de contaminación, o con señales de daños tales como contracción de la membrana del sarcolema. Buenas fibras responden a la estimulación de KCl, eléctrica, y la estimulación de la cafeína.
7. Las fibras individuales del músculo se lavan 3 veces con la solución de lavado # 1 y se bañó en solución desollar intracelular similar con 500 mM Rhod-5N y 0,5 mM de Ca ^{2 +} durante 5 min.
8. Usando una aguja de tungsteno unido a un soporte de pasador, mecánicamente la piel de la fibra bajo un microscopio estereoscópico, lo que permite túbulos transversales (TT) a volver a cerrar de forma automática y para atrapar el conjugado Rhod-5N con Ca ^{2 +} en el TT, lavar las fibras de piel dos veces al con solución de lavado # 2. El proceso de pelado mecánico es óptimo cuando menos del 25% de la anchura de la celda se elimina durante el proceso de pelado.
9. Para cargar el SR, fibras de piel se incuban con la solución de pelado que contiene 20 mM Fluo-5N AM durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido por lavados extensos utilizando solución de lavado # 2, y se incuba durante 30 minutos adicionales para permitir completa de desesterificación del colorante.
10. Después de 30 minutos, las fibras de piel se visualizan en el objetivo 60X del microscopio confocal. Imágenes de fluorescencia se adquieren en longitudes de onda de los colorantes correspondientes (excitación a 543 nm y de emisión más larga que 570 nm para Rhod-5N; excitación a 488 nm y emisión a 530-560 nm para Fluo-5N). Regicomplementos de interés (ROI) se seleccionan para cada uno de las zonas cargadas de tinte.
11. El protocolo experimental es la siguiente: TT-120 de carga solución para s, SR-carga de la solución durante 120 s, SR-solución para el agotamiento de 400-750 s de agotamiento de la SR de Ca ^{2 +} tienda. Durante este proceso, los cambios en Rhod-5N intensidad (TT Ca ^{2 +)} y Fluo-5N intensidad (SR Ca ^{2 +)} se registran, creando una determinación curso temporal de los cambios relativos de fluorescencia en el TT y SR. Valores medios de intensidad de fluorescencia de múltiples fibras se analizan más. La intensidad de carga máxima en el extremo de TT / SR-carga se normaliza a 100%.

5. Los resultados representativos

Hemos examinado la actividad SOCE en KYSE-150 células por medio de Ca ^{2 +} intracelular de medición (Fig. 2.). Uso de SP como reportero, podríamos seleccionar las celdas individuales transfectadas con el plásmido que contiene shRNA específica contra la orai1, un gen que codifica la c SOCEHannel. En comparación con las células transfectadas con plásmidos que contienen rebatiña ARNhc (negro traza), el derribo de Orai1 proteína resulta en actividad SOCE disminuyó (rojo traza).

SOCE en KYSE-150 células se confirmó también con el Mn ^{2 +} ensayo temple (Fig. 3.). La longitud de onda de excitación de 360 nm informa del punto de isosbéstico Fura-2, donde la fluorescencia es independiente de la concentración de Ca ^{2 +.} Después de TG completamente agotada ER Ca ^{2 +} tiendas, la perfusión de Mn ^{2 +} como resultado una disminución significativa de fluorescencia. La actividad SOCE general se puede medir por la tasa de disminución de Fura-2 intensidad de fluorescencia con una pendiente más pronunciada que indica una SOCE más activo, mientras que un significado más somero pendiente una SOCE menos activo. La pendiente de disminución de fluorescencia en 2-APB células tratadas parecían ser mucho más superficial, lo que indica que la actividad SOCE fue bloqueado por este compuesto. El Mn^{2 +} tasas de enfriamiento se determina a partir del registro de los primeros 10 segundos, donde la extinción se encontraba aún en rango lineal, sin saturación.

Un similares Mn ^{2 +} ensayo temple se realizó en el músculo (Fig. 4.). En este caso Mn ^{2 +} se aplica junto con TG. Mientras que TG se agotan los SR Ca ^{2 +} tiendas, la pendiente de extinción de fluorescencia fue cambiando paulatinamente hasta alcanzar su velocidad máxima. La curva sigmoidea indica la activación graduada de SOCE bajo estas condiciones experimentales.

Saludables fibras intactas solo músculo en cultivo mostraron estrías claro y uniforme, sin signos de contaminación, y no hay signos de contracción inducida por el daño. Estas fibras eran capaces de contraerse en respuesta a la estimulación eléctrica o soluciones despolarizantes. En la imagen confocal, captura de animales de piel de fibra de Rhod-5N de colorante en el compartimiento TT demostró el patrón característico de los mamíferos doblete (visuindustrializados en el canal rojo). Después de la carga de la SR con Fluo-5N de la mañana, el típico patrón de marcada SR era visible (en el canal verde). Tras la perfusión de la fibra de piel con solución de carga de TT / SR, la intensidad de fluorescencia de ambos Rhod-5N y Fluo 5N-aumentado; a perfusión con una solución de agotamiento SR, los niveles de fluorescencia en el compartimiento de SR y el compartimiento de TT comenzó a disminuir, lo que indica estrecho acoplamiento entre SR Ca ^{2 +} el agotamiento de la tienda y la activación SOCE, respectivamente (Fig. 5)..

Figura 1. La activación de la tienda que funciona con la entrada de Ca ^{2 +} (SOCE). Orai1, un poro del canal que forma la unidad, se encuentra en la membrana plasmática (PM) y STIM1, un sensor de Ca ^{2 +,} se encuentra en el retículo endoplásmico o sarcoplásmico (ER / SR) las membranas. Cuando ER / SR Ca ^{2 +} tiendas se reducen, ya sea debido al bloqueo de ER / SR Ca ^{2 +} de la bomba (SERCA) o Ca ^{2 +} liberación a través de IP ₃ receptor o receptor de rianodina, STIM1 está activado. Activado STIM1 moléculas forman parches e inducir la agregación de Orai1, que además conduce la activación de SOCE.

Figura 2. La medición de Ca ^{2 +} intracelular en las células KYSE-150. Intercambio de solución extracelular de 0 Ca ^{2 +} (0,5 mM EGTA) a 2 mM Ca ^{2 +} no presentaron ningún cambio en la Ca ^{2 +} intracelular. 5 mM de TG en 0 Ca ^{2 +} inducida por el baño de solución pasiva ER liberación de Ca ^{2 +.} Después de ER Ca ^{2 +} tiendas se agotaron (> 10 min), la adición de Ca ^{2 +} extracelular (2 mM) activó un sostenido Ca ^{2 +} intracelular a través de la elevación SOCE, que puede ser bloqueado por los inhibidores de Soce, por ejemplo, SKF-96365 y 2 - APB (datos no muestran). Las células transfectadas con plásmidos que contienen ARNhc específicamente contraorai1 (rojo), ha demostrado de manera significativa SOCE reducido que las células transfectadas con la secuencia de lucha (negro).

Figura 3. Mn ^{2 +} ensayo de temple SOCE en KYSE-150 células. El temple de Fura-2 fluorescencia por Mn ^{2 +} (0,5 mM) se midió en el Ca ^{2 +-independiente} de longitud de onda de excitación de Fura-2 (360 nm). Las células fueron tratadas con 5 mM de TG durante 10 minutos para agotar completamente ER Ca ^{2 +} tiendas. La pendiente de la caries Fura-2 fluorescencia sobre Mn ² Además ⁺ (líneas de trazos, en el primero 10 seg) representa la activación de SOCE, que se expresó como porcentaje de disminución de la fluorescencia por unidad de tiempo (el valor inicial como 100%). La señal de fluorescencia máximamente inactivada se estableció al final del experimento por lisis de las células con 0,1% de Triton X-100 (como 0%). Las células tratadas con 2-APB (75 mM) demostró un somero muchopendiente, lo que sugiere SOCE está bloqueada por este compuesto en KYSE-150 células.

Figura 4. La activación gradual de la SOCE en las células musculares revelados por Mn ^{2 +} ensayo de enfriamiento. La activación de SOCE podrían estar registrado, mientras que TG se agotan SR Ca ^{2 +} tiendas. La aplicación simultánea de Mn ^{2 +} (0,5 mM) y TG (20 mM) indujo una disminución gradual y sigmoidal de intracelular Fura-2 fluorescencia (línea cian tablero para mostrar el punto más rápido enfriamiento), que era distinta de la inicial Mn ^{2 +} temple tasa (línea discontinua azul). Mn ^{2 +} pendiente de enfriamiento se mantuvo casi el mismo nivel basal en las células tratadas 2-APB (75 M), lo que sugiere que SOCE se inhibió.

Figura 5. Espacial y temporalmente resuelta SOCE en la fibra muscular de piel. (A) Rhod-5N sal se cargan en TT y AM Fluo-5N se cargó en SR. (B) Después de la aplicación de Ca ^{2 +} solución de agotamiento, la fluorescencia en el TT y compartimentos SR disminuido. La pérdida de Fluo-5N fluorescencia indicado libera rápidamente SR Ca ^{2 +} contenido y la pérdida de Rhod-5N fluorescencia sugirió la activación de SOCE.

Discusión

Aunque las longitudes de onda de excitación para el Ca ^{2 +-unión} y Ca ^{2 +} libre Fura-2 son 340 nm y 380 nm, respectivamente, el rango dinámico mejor relación de Fura-2 para el Ca ^{2 +} medición concentración puede ocurrir en otras longitudes de onda en un determinado microscopio sistema. Estos cambios en la longitud de onda son por lo general debido a los cambios en la trayectoria óptica con la adición de diversos componentes ópticos. En este estudio, las longitudes de onda de excitación para Fura-2 se determinó como 350 nm y 390 nm mediante la realización de análisis espectral de Fura-2 fluorescencia.

El nivel intracelular de Ca ^{2 +} en el citosol de los resultados de un saldo de varias fuentes, incluyendo intracelular de Ca ^{2 + en} libertad, extracelular de Ca ^{2 +} de entrada, así como de Ca ^{2 +} mecanismo de exclusión en la membrana del RE y de plasma. Para aislar el unidireccional SOC mediada por Ca ^{2 +} afluencia de Ca ^{2 +} intracelular de liberación de Ca ^{2 +} extrusion, el Mn ² ensayo temple ⁺ puede utilizarse. Mn ^{2 +} se sabe que es capaz de penetrar en las células a través SOCE pero es impermeable a la extrusión superficie de la membrana o la absorción de ER por Ca ^{2 +} bombas. Por lo tanto, extinción de fluorescencia representa una medición de unidireccional Mn ^{2 +} flujo en células que calcula el grado de activación de SOCE. Mn ^{2 +} ensayo enfriamiento se realiza en el punto isosbéstico, en tal longitud de onda Fura-2 intensidad de fluorescencia es independiente de la concentración de Ca ^{2 +.} El punto isosbéstico para cada sistema debe ser determinada por análisis de espectro. Alternativamente, Mn ^{2 +} temple puede ser registrada por fluorescencia ajustada en cualquiera de las dos longitudes de onda de tal manera que el valor final es independiente de la concentración de Ca ^{2 + 13.}

Para obtener la información espacial y temporal de la actividad de SOCE en los músculos esqueléticos, se empleó un método de doble medio de contraste, que permite MeasureMe simultáneant de la actividad SOCE y SR Ca ^{2 +} en el contenido de piel de mamíferos adultos fibras musculares EDL. La correlación entre los cambios en la SR Ca ^{2 +} contenido y la actividad SOCE se pueden trazar para indicar el umbral y la sensibilidad de activación de SOCE al agotamiento de la Ca ^{2 +} almacenamiento SR. La solución de TT de carga está optimizado para cargar, además, los túbulos T con Ca ^{2 +} y para la maduración de los túbulos T y la solución de SR de carga está diseñada para promover la máxima SR Ca ^{2 +} y de carga para cargar, además, los túbulos T con aproximadamente 500 mM de Ca ^{2 +.} FCCP está incluido en la solución de TT / SR-carga y la solución SR agotan para eliminar los efectos de las mitocondrias.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
RPMI 1640	Mediatech	10 a 040 CV
Ham F-12	Mediatech	10 a 080 CV
DMEM	Mediatech	10 a 013 CV
Vidrio placa inferior	MatTek	P35G-1.5-14-C
Fura-2 PM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	-20 ° C, sellado hermético, protegido de la luz, se disolvió en DMSO
Fluo-5N AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F14204	-20 ° C, sellado hermético, protegido de lDERECHO
Rhod-5N	Invitrogen (Molecular Probes)	R14207	-20 ° C, sellado hermético, protegido de la luz
Cubeta de cuarzo	Las células Starna	3-Q-10
thapsigargin	Tocris	1138
2-Aminoethoxydiphenylborane (2-APB)	Tocris	1224
N-bencil-p-tolueno sulfonamida (BTS)	Sigma-Aldrich	435600
Colagenasa tipo I	Sigma	C0130