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Method Article
Digital microscopía intravital epifluorescencia de vénulas post-capilares de la microcirculación cremastérico es un método conveniente para obtener información sobre la interacción leucocito-endotelio En vivo En la lesión por isquemia-reperfusión (IRI) de músculo estriado. Estamos aquí proporcionar un protocolo detallado para realizar con seguridad la técnica y discutir sus aplicaciones y limitaciones.
La isquemia-reperfusión (IRI) ha sido implicado en una gran variedad de condiciones patológicas tales como accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, isquemia intestinal, así como seguir. Trasplante y cirugía cardiovascular una reperfusión del tejido previamente isquémico, aunque es esencial para la prevención de la irreversible las lesiones de tejidos, provoca inflamación excesiva del tejido afectado. Adyacente a la producción de especies reactivas del oxígeno, la activación del sistema del complemento y el aumento de la permeabilidad microvascular, la activación de los leucocitos es uno de los principales actores en la cascada patológica de la lesión tisular inflamatoria durante la reperfusión. 2, 3 activación de leucocitos es un proceso de varias fases que consiste de material, la adhesión firme y la transmigración y está mediada por una compleja interacción entre las moléculas de adhesión en respuesta a factores quimiotácticos como factores del complemento, quimiocinas, o el factor activador de plaquetas. 4 <p class = "jove_content"> Mientras rodadura de leucocitos en las vénulas postcapilares está predominantemente mediado por la interacción de selectinas 5 con sus ligandos de venta libre, la adhesión firme de los leucocitos al endotelio es selectina-controlado a través de la unión a las moléculas de adhesión intercelular (ICAM) y celulares vasculares las moléculas de adhesión (VCAM). 6, 7
Estándar de oro para el estudio in vivo de leucocitos del endotelio interacción es la técnica de microscopía intravital, describió por primera vez en 1968. 8
Aunque varios modelos de IRI (isquemia-reperfusión) se han descrito para diversos órganos, 9-12 sólo unos pocos son adecuadas para la visualización directa de reclutamiento de leucocitos en el lecho microvascular en un alto nivel de calidad de imagen. 8
Estamos aquí, promover el digital de microscopía intravital epifluorescencia de la vénula postcapilares en la microcirculación cremastéricode la rata 13 como un método práctico para analizar cualitativa y cuantitativamente el reclutamiento de leucocitos por el IRI de investigación en el tejido muscular estriado y proporcionar un manual detallado para llevar a cabo la técnica. Nos ilustran aún más las trampas más comunes y proporcionar consejos útiles que deberían permitir al lector a apreciar de verdad, y con seguridad realizar el método.
En un paso a paso el protocolo que describen cómo empezar con anestesia respiración controlada bajo vigilancia suficiente para evitar que el animal anestesiado con firmeza durante períodos más largos de tiempo. A continuación, describen la preparación cremastérico como una delgada lámina plana para la resolución óptica excepcional y proporcionar un protocolo para obtener imágenes de leucocitos en el IRI que ha sido bien establecido en nuestros laboratorios.
1. Anestesia y Vigilancia
Las siguientes etapas de preparación se logra mejor utilizando un microscopio quirúrgico.
Para la aplicación intravenosa de tintes fluorescentes u otros fármacos of interés, haga lo siguiente:
2. Preparación del músculo Cremaster
3. Configuración intravital
La configuración básica intravital puede variar. Para imágenes de epifluorescencia los experimentos deben ser ejecutados en un cuarto oscuro.
4. Por isquemia-reperfusión (IIR)
5. Vídeo Análisis de reproducción en línea
6. Los resultados representativos
IRI del músculo cremáster no tiene ningún efecto sobre la presión arterial media (PAM), el ritmo cardíaco y pH de la sangre
Usando la preparación anterior (Figura 1), se determinó la microcirculación en el IRI en un protocolo de dos horas, sin embargo, un tiempo de observación mucho más tiempo de hasta 6 horas es posible. Como se muestra en la Figura 2, el IRI del músculo cremáster no tiene efectos significativos sobre la circulación macrohemodynamic rata como presión arterial media y la frecuencia cardíaca permanecer estable durante todo el período de investigación. Además, monitoreamos la homeostasis mediante mediciones frecuentes de la sangre arterial, pH que osciló dentro de los límites fisiológicos y no mostraron significativas entre los grupos entre las diferencias.
IRI induce leucocitos de rodadura en la circulación cremastérico
La interacción endotelial de leucocitos es una claveevento en la inflamación aguda. Por medio de microscopía intravital hemos observado un incremento en función del tiempo en el número de leucocitos de rodadura en el IRI del músculo cremáster (Figura 3) concordantes con los datos anteriores 21, 25. Balanceo montado sobre el tiempo de observación de dos horas para un máximo de 137,63 ± 22,55% del valor inicial después de 120 minutos de tiempo de reperfusión y luego alcanzó la significación estadística en comparación con los animales operación simulada (137,63 ± 22,55 frente a 99,43 ± 14,04% del valor basal).
IRI induce la adhesión de leucocitos en la circulación cremastérico
Para la evaluación adicional de la interacción leucocito-endotelio se analizó la adhesión de leucocitos en una sección de 200 m del vaso. IRI indujo un incremento en el número de leucocitos adherentes que superaron significativamente los valores de operación simulada animales después de 60 minutos (118,33 ± 6,83 vs 96,27 ± 5,78% del valor basal) y ASCE másnded por 120 minutos de reperfusión (Figura 3B).
En resumen, el descrito en el modelo in vivo proporciona datos consistentes de activación leucocitaria aguda en la supervivencia de los animales, mientras que el IRI y la estabilidad de la circulación está garantizada.
Figura 1. Diagrama de flujo para un rendimiento A. intravital microscopía de epifluorescencia en la lesión por isquemia-reperfusión del músculo cremáster de la rata. A raíz de los preparativos necesarios para la anestesia y el control, el músculo cremáster ratas se expone para la imagen. Los registros de activación de los leucocitos se toman antes y después de la isquemia tisular. Tras el análisis de vídeo se realiza mejor en línea. B. La figura esquemática de la configuración intravital propuesta. Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 2. IRI del músculo cremáster no tiene ningún efecto sobre la presión arterial media (PAM), frecuencia cardíaca y pH de la sangre. La presión arterial media (A) y la frecuencia cardíaca (B) fueron monitoreados cada 30 minutos durante todo el experimento a través del transductor de presión después de la canulación del derecho la arteria carótida. Medición de la sangre arterial de pH (C) se realizó después de 0, 60 y 120 minutos. Los valores son medias ± SEM de 6 ratas diferentes, oscilando en los niveles fisiológicos, sin diferencias significativas entre los grupos. Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 3. IRI aumenta los leucocitos-Endotelial interacción en la circulación cremastérico. Después de etiquetado de los leucocitos con rodamina 6G (0,4 mg / kg de peso corporal) microscopía de epifluorescencia intravital se utilizó para determinar leucocitos del endotelio interacción en la lesión por reperfusión en un protocolo de 120 minutos después de 30 minutos de isquemia tisular. Los registros fueron llevados a un aumento de aproximadamente × 800. A. IRI aumenta significativamente el número de leucocitos de rodadura en vénulas post-capilares del músculo cremáster por 120 minutos de reperfusión, mientras que de leucocitos de rodadura se mantiene estable durante todo el experimento en el tejido cremastérico que no se sometieron a la isquemia. Los valores son medias ± SEM de 6 ratas observadas. # P <0,05 con la prueba de t no apareada. B. El número de leucocitos adherentes es significativamente mayor en un escogido de forma aleatoria la sección 200μm vasos postcapilares después de 30 minutos de isquemia cremastérico y posteriores 60 minutos de la reperfusión del tejido. Resultados vengarse mesesre pronunciada después de un período de reperfusión dos horas. Los valores son medias ± SEM de 6 ratas observadas. # P <0,05 con la prueba de t no apareada. C. imágenes representativas de una vénula poscapilar antes de la isquemia (izquierda) y 120 minutos después de que el IRI (derecha). Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Leucocitos del endotelio interacción, la producción de especies reactivas del oxígeno y la activación del sistema del complemento son las principales características de la disfunción del tejido inducido por el IRI. 26 La microcirculación del tejido afectado es considerado como el sitio integral para el inicio inflamatoria. Aparte de los experimentos ex vivo, como los ensayos de la cámara de flujo 27, 28, es obligatorio proporcionar modelos bien establecidos de imagen intravital par...
No hay conflictos de interés declarado.
Este trabajo fue apoyado por una beca de la "Deutsche Forschungsgemeinschaft" a SU Eisenhardt (IE 866/1-1).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nombre del equipo: | Empresa: | Artículo número: | Comentarios: |
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Terylene sutura | Serag Weissner | OC108000 | |
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0,9% de solución salina | Fresinus Kabi | 808771 | |
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Microscopio quirúrgico OPMI 6-SDFC | Carl Zeiss | ||
Microcirugía de los instrumentos de laboratorio de set | S & T | 767 | |
Biemer clip de buques | Diener | 64.562 | |
La aplicación de fórceps | Diener | 64.568 | para el clip de buques Biemer |
Rodamina 6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
Vaselina blanca DAB | Winthrop | 2726853 | |
Cubreobjetos | 32x32 mm | ||
Configuración intravital | |||
Zeis Axio Scope A-1 MAT | Carl Zeis | 490036 | microscopio de epifluorescencia |
470 nm LED | Carl Zeis | 423052 | fuente de luz fluorescente |
2 Sistema de Colibri | Carl Zeis | 423052 | |
W Plan-Apochromat 20x / 1,0 DIC | Carl Zeis | 421452 | objetivo de inmersión en el agua |
AxioCam MRM Rev. 3 FireWire | Carl Zeis | 426509 | cámara digital de alta resolución |
Axio LE software de la visión | Carl Zeis | 410130 | utilizar para análisis fuera de línea |
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