Controlar el tamaño, forma y estabilidad de los polímeros supramoleculares en el agua

Resumen

El objetivo de este experimento es determinar y controlar el tamaño, la forma y la estabilidad de auto-ensambladas anfifilos discotic en el agua. Para polímeros supramoleculares acuosas a base de tal nivel de control es muy difícil. Nosotros aplicamos una estrategia con las dos interacciones de atracción y repulsión. Las técnicas experimentales aplicadas a caracterizar este sistema son ampliamente aplicables.

Resumen

Para polímeros supramoleculares acuosas basadas en el control simultáneo sobre la forma, el tamaño y la estabilidad es muy difícil ^1. Al mismo tiempo, la capacidad de hacerlo es muy importante en vista de un número de aplicaciones en la materia blanda funcional incluyendo la electrónica, la ingeniería biomédica y sensores. En las estrategias anteriores, el éxito para controlar el tamaño y la forma de polímeros supramoleculares general se centró en el uso de plantillas de ^{2,3, 4} o tapadoras finales selectivas técnicas de disolvente ^5.

Aquí damos a conocer una estrategia basada en la auto-montaje de anfifilos discotic que conduce a la pila de control sobre la longitud y la forma de agregados y ordenados en columnas quirales. Mediante el equilibrio de interacciones de repulsión electrostática en el borde hidrófilo y atractivos fuerzas no covalentes en el núcleo hidrofóbico de la polimerización de bloque de construcción, logramos crear objetos esféricos pequeños y discretos ^6,7. Aumencantar la concentración de sal para cribar los cargos induce una transición esfera a barra. Curiosamente, esta transición se expresa en un aumento de cooperatividad en la dependiente de la temperatura de auto-ensamblado mecanismo, y los agregados más estables se obtienen.

Para nuestro estudio seleccionar una benceno-1 ,3,5-tricarboxamide (BTA) núcleo conectado a un quelato metálico hidrófilo a través de un hidrófobo, fluorado L-fenilalanina espaciador basado (Esquema 1). El quelato de metal seleccionado es un complejo de Gd (III)-DTPA que contiene dos cargas generales restantes por complejos y necesariamente dos iones contrarios. El crecimiento de una dimensión de la suma está dirigida por π-π de apilamiento y el enlace de hidrógeno intermolecular. Sin embargo, las fuerzas electrostáticas, las repulsivas que surgen de los cargos en el Di-s (III)-DTPA inicio compleja que limita el crecimiento de una dimensión de la BTA discotic basada en vez de un cierto tamaño se alcanza. A concentraciones milimolares el agregado formado tiene una SPHEforma Rical y un diámetro de alrededor de 5 nm como se infiere a partir del ¹ H-RMN, dispersión pequeño ángulo de rayos X, y microscopía electrónica de transmisión criogénica (crio-TEM). La fuerza de las interacciones electrostáticas repulsivas entre las moléculas se puede reducir aumentando la concentración de sal de las soluciones tamponadas. Esta selección de los cargos induce una transición de agregados esféricos en barras alargadas con una longitud> 25 nm. Cryo-TEM permite visualizar los cambios en la forma y tamaño. Además, la espectroscopia de CD permite derivar los detalles mecánicos de los procesos de montaje auto-antes y después de la adición de sal. Es importante destacar que la cooperatividad-una característica clave que dicta las propiedades físicas de la supramolecular producido polímeros-aumenta dramáticamente en la detección de las interacciones electrostáticas. Este aumento en los resultados de cooperatividad en un incremento significativo en el peso molecular de los polímeros formados supramoleculares en agua.

Protocolo

Esquema 1. Auto-ensamblaje de BTA-basados ​​en discotics en tampón de citrato en agregados esféricos que muestran un diámetro de alrededor de 5 nm, en concentraciones milimolares de bloque de construcción. El aumento de la fuerza iónica mediante la adición de los resultados de NaCl en la formación de barras alargadas con un diámetro de alrededor de 3 nm y la longitud> 25 nm. Haga clic aquí para ampliar la figura .

1. Preparación de un BTA-Gd (III) Soluciones DTPA de espectroscopia de CD y medición de los espectros de CD dependiente de la temperatura en función de la concentración de NaCl

1. Preparar un tampón citrato 100 mM (pH 6,0).
2. Preparar un tampón citrato 100 mM (pH 6,0) con 2 M de NaCl.
3. Disolver 0,254 mg de TBA-Gd (III) de DTPA (PM = 3184 g • mol ^-1) en 10 ml de tampón citrato 100 mM, tArget concentración de 8 • 10 ^{-3 mm} del BTA-Gd (III) DTPA.
4. Soníquelos la solución durante 5 minutos.
5. Llenar una cubeta 1 cm UV con la solución y medir un espectro CD a partir de 230 a 350 nm y una curva de enfriamiento CD en la banda de mayor intensidad de CD (por ejemplo, l = 269 nm) 363 a 283 K a una velocidad de 1 K min ^{- 1.}
6. Añadir el mismo volumen de 2 M de NaCl tamponada solución a la solución de citrato tamponado BTA-Gd (III) de DTPA con el fin de aumentar la fuerza iónica a 1 M de NaCl, diluyendo los discotics a la mitad de la concentración, concentración objetivo 4 • 10 ^-3 mM de BTA-Gd (III) DTPA.
7. Vortex la solución con mayor fuerza iónica durante 5 minutos.
8. Vuelva a medir un espectro CD a partir de 230 a 350 nm y una curva de enfriamiento CD en la banda de mayor intensidad de CD 363 a 283 K a una velocidad de 1 ^-1 K min.

2. Montaje de los CD de datos T-dependientes de un modelo de T-dependenent autoensamblaje

1. Los datos de CD primas en origen se exportaron 8,5 y normalizado. Esto se logró mediante la definición de los efectos de CD a la temperatura más alta medida como igual a 0, y el efecto de CD a temperatura más baja medido como igual a 1. Dado que la magnitud de la CD-efecto es proporcional al grado de agregación ^8, las normalizadas CD-curvas son proporcionales al grado de agregación.
2. Los datos normalizados se ajustaron utilizando la opción de ajuste de la curva no lineal en OriginPro 8,5 usando un T-dependiente de auto-ensamblaje modelo derivado de van der Schoot ^8,9. En este modelo, una nucleación y un régimen de elongación se distinguen. En primer lugar el grado de agregación en el régimen de elongación (T e) se ajustó, mediante la siguiente ecuación:

Ecuación anterior contiene (junto a la temperatura variable, T, y el grado de aggregation y Φ _n) tres parámetros, a saber la entalpía de alargamiento h _e, el alargamiento temperatura T _e (la temperatura a la que la auto-ensamblado comienza) y el parámetro _sáb Φ, que se introduce para garantizar que Φ _n / Φ _sáb hace no mayor que la unidad, que se deriva de la restricción de que el grado de agregación no puede exceder a la unidad.

Montaje hace que la entalpía de la elongación _e h (J / mol) y el alargamiento de la temperatura T _e (K) que caracterizan el auto-ensamblaje de las moléculas de una determinada concentración. Para el montaje, un sistema de retención debe ser obedecido y es que sólo el grado de agregación a temperaturas inferiores a T _e se instalarán, ya que la ecuación 2.1 es válida sólo en el régimen de elongación.

A continuación, el grado de agregación encontrado experimentalmente en elrégimen de nucleación puede estar provisto, utilizando la siguiente ecuación:

Por encima de la ecuación contiene (al lado de las variables T y _N) Φ cuatro parámetros de los cuales ya tres han sido calculados con la ecuación 2.1, es decir, la entalpía de la elongación _e h, la temperatura de elongación _e T y el parámetro Φ _SAT. El único parámetro desconocido es el _K-un valor que describe la cooperatividad de la nucleación de la fase-que se encuentra ajustando el grado de agregación experimentalmente para temperaturas superiores a T _e.

3. Preparación de BTA-Gd (III) Soluciones DTPA para microscopía electrónica de transmisión y visualización de los polímeros supramoleculares a través Criogénico TEM

1. Preparar dos tampones: un tampón citrato 100 mM (pH 6,0) y un tampón citrato 100 mM (pH 6,0) wIth 5 M de NaCl.
2. Disolver 0,318 mg de TBA-Gd (III) de DTPA (PM = 3184 g • mol ^-1) en 0,1 ml de cada uno de los tampones preparados, concentración objetivo 1 mM de BTA-Gd (III) de DTPA.
3. La vitrificación de la muestra para criogénico TEM se lleva a cabo utilizando un robot de vitrificación automatizado (FEI Vitrobot marca III). Rejillas CryoTEM (R2 / 2 Quantifoil rejillas Jena de Quantifoil Micro Tools GmbH) son de plasma superficie tratada antes del procedimiento de vitrificación utilizando un recubridor Cressington 208 operativo de carbono a 5 mA durante 40 s. La solución acuosa se aplica entonces sobre la red durante la vitrificación en un sistema automatizado de Vitrobot FEI. Esto implica la aplicación de la muestra en la parrilla, secante del exceso de líquido para crear una película delgada de la solución acuosa en la rejilla y la vitrificación posterior por inmersión de la rejilla muy rápidamente en etano líquido. Después de la vitrificación de la muestra se conserva en nitrógeno líquido y se la traslada a mano en el casete cargador automático, también cooled con nitrógeno líquido. El casete se inserta entonces en el cargador automático de la TEM. Todo esto se realiza manualmente.
4. Los experimentos cryoTEM se realizan en la TU / e cryoTitan (FEI), ( www.cryotem.nl ). El cryoTitan TU / e está equipado con una pistola de emisión de campo (FEG) que opera a 300 kV. Las imágenes fueron grabadas con un 2k x 2k Gatan cámara CCD equipada con un puesto en la columna de la Energía Gatan filtro (GIF).

4. ¹ H-RMN DOSY Las mediciones de la esférica auto-ensamblado BTA-Gd (III) de DTPA a baja fuerza iónica

1. Preparar un 50 mM d _6-succinato tampón en D ₂ O ("pH 6,0 '); el tampón se prepara disolviendo d _6-succínico en D ₂ O, seguido por el ajuste del pH a 6,0 utilizando 1 M ND ₄ OD en D ₂ O. La concentración final de 50 mM de succinato se ajustó con adicional O. D ₂
2. Desde Gd (III) es altamente paramagnéticoy ¹ señales H con ello se ampliaría significativamente, Gd (III) se sustituyó por Y (III).
3. Disolver 2,98 mg de ABT-Y (III) DTPA (MW = 2.979 g • ^mol-1) en 1 ml de 50 mM d _6-succinato de búfer en el D ₂ O ("pH 6,0 '), la concentración de la meta 1 mM BTA- Y (III) de DTPA.
4. Los ¹ H-RMN DOSY mediciones se llevan a cabo en un Varian Unity Inova 500 equipado con un espectrómetro de 5 mm ID-PFG sonda de Varian. Los experimentos se llevaron a cabo DOSY utilizando el DOSY one-shot (Doneshot, Varian) secuencia de pulsos. Los 90 grados tiempos und pulso de mezcla se han adaptado en consecuencia. Los desplazamientos químicos se hace referencia mediante el desplazamiento químico de la 3 - (trimetilsilil) propiónico-2, 2,3,3 - _[4 D] sal sódica del ácido (TMSP).
5. La auto-difusión de los HDO se utiliza para calibrar las mediciones, se sabe de la literatura que la propia difusión de la HDO en D ₂ O a 298 K es 19,0 × 10-9 m ² • ^s-1. Como referencia, la auto-difusión de la HDO en D ₂ O se midió en un VARIAN 2 Hz D ₂ O de la muestra estándar y calibrado a su valor normal. El modelo utilizado para calcular la hidrodinámica radios R _H de los agregados es la relación de Stokes-Einstein para la difusión de una partícula esférica.

5. Los resultados representativos

¹ H-NMR y DOSY mediciones SAXS en BTA-M (III)-DTPA: objetos esféricos en tampón citrato

El carácter iónico de los periféricos de Di-s (III) presenta la frustración en el crecimiento de una dimensión de los monómeros discotic cuyo núcleo está diseñado para polimerizarse en alargadas en forma de bastoncillos agregados. El equilibrio entre las interacciones de atracción y repulsión controla el tamaño y la forma de los agregados (Esquema 2).

Esquema 2.

Una técnica potente para determinar el tamaño y la forma de las partículas en solución es sincrotrón fuente pequeño ángulo de rayos X (SAXS). BTA-Gd (III)-DTPA Se disolvió en una solución tampón de citrato y los perfiles de SAXS se registraron y equipado en la región 0,01 <0,1 Å ^-1. Una pendiente se acerca a cero en la región baja-q (q <0,06 Å ^-1) indica una falta de forma de la anisotropía en el agregado, lo que sugiere la presencia de objetos esféricos (Figura 1). Los datos medidos a diferentes concentraciones se ajustaron utilizando un factor de homogénea monodispersas forma esférica conduce a un radio calculado, R, de 3,2 nm. El radio calculado geométrica de monómero discotic BTA-Gd (III)-DTPA es de 3,0 nm, lo que sugiere la presencia de agregados con una relación de aspecto cercano a 1.

Figura 1. Perfiles SAXS para BTA-Gd (III)-DTPA en tampón citrato (100 mM, pH 6) en 0,5 y 1,0 mm (superior). DOSY RMN de BTA-Y (III)-DTPA en 50 mm d _6-succinato de tampón a 1,0 mm (inferior). Haga clic aquí para ver más grande la figura .

A fin de proporcionar evidencia adicional de la forma esférica y tamaño nanométrico-de los objetos auto-ensamblado, se realizó ^una difusión H-ordenó espectroscopía de RMN ⁽¹ H-RMN DOSY) (Figura 1). DOSY-RMN permite la determinación de los coeficientes de difusión de los agregados, de los cuales pueden ser el radio hidrodinámico (R _H) calculados. Desde Gd (III) es altamente paramagnético y ¹ señales H con ello se ampliaría significativamente, cambiamos Gd (III) para diamagnético Y (III). Los coeficientes de difusión de la anfifilo diamagnético discotic agregados en un tampón de succinato deuterado (50 mM, PH 6, c = 1 mM) se determinó que era 0.69x10-10 m ² s ^-1. A través de la relación de Stokes-Einstein, calculamos una hidrodinámica radio R _H de 2,9 nm para los objetos discretas de tamaño esférico (Tabla 1). Este tamaño se encuentra en excelente acuerdo con el valor obtenido a partir de los datos de SAXS de BTA-Gd (III)-DTPA.

BTA-M (III)-DTPA [MM]	D t un [10 -10 m 2 s -1]	R H una [Nm]	Rb [Nm]
1	0,69	2.9	3.2

^una de DOSY; ^b de SAXS

Tabla 1. Los resultados de SAXS y mediciones DOSY para BTA-M (III)-DTPA.

Cryo-TEM de BTA-Gd (III)-DTPA: a partir de objetos esféricos que nanorods alargados

Otra prueba de éxito en el control sobre la longitud de la pila de una dimensión se obtuvo de la crio-TEM micrografías. Debido a la vitrificación de las soluciones acuosas criogénico TEM conserva la morfología estructural de los agregados auto-ensamblado y evita el secado afecta relacionados con la preparación convencional de la muestra de TEM. Figura 2 (izquierda) muestra que la BTA-Gd (III)-DTPA produce la esperada esférica objetos con diámetros cercanos a 6 nm a una concentración 1 mM, lo que confirma los resultados de SAXS y mediciones DOSY. De acuerdo con estos resultados, hemos sido capaces de obtener auto-ensambladas objetos discretos que pueden ser considerados el equivalente supramolecular de macromoléculas dendríticas ^10.

. Figura 2 Cryo-TEM imágenes para BTA-Gd (III)-DTPA (izquierda) 1 mM vitrificado a 298 K en un tampón de citrato (100 mM, pH 6), barra de escala representa 50 nm;(Derecha) 1 mM vitrificado a 298 K en tampón de citrato (100 mM, pH 6) y una concentración total de NaCl de 5 M, barra de escala representa 50 nm.

Hasta ahora sólo hemos trabajado en soluciones tampón de baja fuerza iónica. Sin embargo, si las fuerzas de repulsión electrostática de la periférica cargado M (III)-DTPA complejos en BTA-Gd (III)-DTPA están en el origen de la frustrada unidimensional crecimiento, se espera que el aumento de la fuerza iónica del medio tamponado, usando un inerte 01:01 sal con contraiones altamente hidratadas, debería reducir las interacciones electrostáticas y por lo tanto un tipo diferente de auto-ensamblado objeto debe ser formado. En tampón citrato que comprende 5 M de NaCl este efecto se observó efecto (Figura 2, a la derecha). La formación de alta relación de aspecto de varilla como polímeros supramoleculares se observa claramente en la crio-TEM micrografías a alta fuerza iónica. Detección electrostática es la explicación más probable para este hallazgo. Los cambios en la forma de un ámbiagregado Rical de alrededor de 6 nm de diámetro para barras alargadas con un diámetro de 6 nm y la longitud de hasta varios cientos de nanómetros.

Mediciones de CD de BTA-Gd (III)-DTPA: encender la cooperativa de auto-ensamblaje mediante el aumento de la fuerza iónica

Dicroísmo circular (CD) espectroscopia mide la diferencia de absorción entre la mano izquierda y mano derecha la luz polarizada circularmente. Cuando un objeto tiene un sentido helicoidal preferido helicoidal, a la izquierda y la mano derecha la luz polarizada circularmente serán absorbidos en diferentes grados, por lo tanto, dando lugar a un CD-efecto. Desde los enlaces de hidrógeno intermoleculares formado entre consecutiva BTA-Gd (III)-DTPA dentro de los agregados, se alinean en forma helicoidal y el centro estereogénico en el resto de la L-fenilalanina favorece un sentido helicoidal sobre el otro, se espera que un CD clara espectro de BTA-Gd (III)-DTPA agregados basados ​​en ^11,12. Además, la temperatura dependiente de la espectroscopía de CD es un poderosoherramienta para evaluar el mecanismo de auto-ensamblaje de BTA-Gd (III)-DTPA polimerización y permite derivar conclusiones sobre la estabilidad de los agregados formados ^13.

Como un ejemplo, la temperatura ambiente espectros de CD de TBA-Gd (III)-DTPA (8x10 ^-3 mM mM o 4x10 ^-3 en un tampón citrato 100 mM) con aumento de la concentración de sal (0 M de NaCl a 1,0 M de NaCl) se dan en la Figura 3A. Aunque una concentración significativamente menor se aplica para las mediciones de CD, el efecto de algodón claro indica la presencia de agregados intactos, incluso a concentraciones micromolares. La forma de los cambios de CD espectro al aumentar la concentración de sal, que es una buena indicación de interacciones reducidos en la periferia de las pilas y una mejor utilización de los discotics. Además, las curvas de enfriamiento de CD de las mismas soluciones (363 a 283 K, medido a λ = 269 o 278 nm) muestran claras diferencias en la forma (Figura 3B). El APpadre T _e-la temperatura a la que la agregación se inicia-desplaza a temperaturas más altas en la concentración de sal más alto y un mecanismo cada vez más cooperativo, caracterizado por un aumento más abrupto en el CD-efecto, se hace evidente. Considerando que la curva de enfriamiento a 0 M NaCl se describe mejor por una isodésmica auto-ensamblado proceso, la curva de enfriamiento a 1,0 M de NaCl es típico para una cooperativa de auto-ensamblado proceso ^14. En el primer caso, todas las constantes de asociación se supone que es igual, mientras que en el último caso de auto-ensamblado se produce en al menos dos etapas distintas. En el primer paso, un "núcleo" necesita ser formado que es energéticamente muy desfavorable. Después de enfriar por debajo de una temperatura de polimerización crítico, el alargamiento y el crecimiento exponencial en polímeros supramoleculares de alto peso molecular sigue. La cuantificación de los parámetros termodinámicos de la auto-ensamblaje de BTA-Gd (III)-DTPA en 0 y 1 M de NaCl utilizando un modelo de cooperación revela claramente la disminución de K <sub> una, que es la activación adimensional constante ^8. Los valores más bajos de K _un indican un mayor grado de cooperatividad en el proceso de auto-ensamblado, que se expresa en la formación de polímeros supramoleculares muy alargadas como se observa en crio-TEM.

BTA-Gd (III)-DTPA	C NaCl	K una
8 x 10 -3 mM	0 M	5 10 -2
4 x 10 -3 mm	1 M	1 -4 10

Tabla 2. Grado de cooperatividad expresada por _una K en la temperatura dependiente de la auto-ensamblaje de TBA-Gd (III)-DTPA como una función de la concentración de NaCl (C _NaCl).

Figura 3. BTA-Gd (III)-DTPA en un tampón citrato 100 mM (c = 8 mM x10 ^-3 a baja fuerza iónica y 4 mM x10 ^-3 a alta fuerza iónica) A] espectros CD grabado a 293 K en función de la fuerza iónica , c = 0 M _NaCl - 1,0 M, la Δε elipticidad molar se calcula como sigue: Δε = CD-efecto / (CXL) en la que c es la concentración de BTA en mol L ^-1 y L es la longitud del camino óptico en cm ; B] correspondiente curvas de enfriamiento CD medidos a λ = 269 nm para 0 M NaCl y 278 nm para 1 M soluciones de NaCl expresado como el grado de agregación Φ _n como una función de la concentración de NaCl _NaCl c = 0 M - 1,0 M, Φ _n se calcula dividiendo el valor medido de CD-efecto por el máximo de CD-efecto.

Discusión

Los anfífilos discotic auto-montaje discutidos en este trabajo que contiene el Gd (III)-DTPA complejo son actualmente objeto de investigación en nuevas imágenes por resonancia magnética (MRI) los agentes que combinan un alto contraste con los tiempos de la excreción sintonizables. ¹⁵ Por lo tanto, los detalles de su auto- montaje de comportamiento y su estabilidad en diferentes condiciones son de importancia crítica. La combinación de la RME (CD y RMN), (SAXS) y microscopía (crio-TEM), técnicas permite la visualización de las estructuras formadas y la cuantificación de los parámetros termodinámicos. Esta combinación de técnicas es aplicable en general para el auto-ensamblaje de moléculas, siempre y cuando el sentido preferencial helicoidal en el sistema estudiado permite una diferencia en la absorción de la luz polarizada circularmente de izquierda y derecha con las manos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo / equipo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BTA-Gd (III)-DTPA			Hecho en casa
BTA-Y (III)-DTPA			Hecho en casa
La espectroscopia de CD	Jasco	Jasco J-815 espectropolarímetro
RMN	Varian	Varian Inova 500 espectrómetro de la Unidad	5-mm DI-PFG sonda de Varian
Cryo-TEM	FEI	cryoTitan TEM
SAXS	Belga-holandés línea de luz (BM26B) en la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón (ESRF) en Grenoble, Francia