Контроль размера, формы и стабильность супрамолекулярных полимеров в воде

Резюме

Целью этого эксперимента является определение и контроль размеров, формы и устойчивость самоорганизующихся дискотических амфифилов в воде. Для водной основе супрамолекулярных полимеров, уровень контроля очень сложно. Мы применяем стратегию, используя как отталкивания и притяжения взаимодействия. Экспериментальные методы, применяемые для характеристики этой системы широко применимы.

Аннотация

For aqueous based supramolecular polymers, the simultaneous control over shape, size and stability is very difficult¹. At the same time, the ability to do so is highly important in view of a number of applications in functional soft matter including electronics, biomedical engineering, and sensors. In the past, successful strategies to control the size and shape of supramolecular polymers typically focused on the use of templates^2,3, end cappers⁴ or selective solvent techniques⁵.

Here we disclose a strategy based on self-assembling discotic amphiphiles that leads to the control over stack length and shape of ordered, chiral columnar aggregates. By balancing electrostatic repulsive interactions on the hydrophilic rim and attractive non-covalent forces within the hydrophobic core of the polymerizing building block, we manage to create small and discrete spherical objects^6,7. Increasing the salt concentration to screen the charges induces a sphere-to-rod transition. Intriguingly, this transition is expressed in an increase of cooperativity in the temperature-dependent self-assembly mechanism, and more stable aggregates are obtained.

For our study we select a benzene-1,3,5-tricarboxamide (BTA) core connected to a hydrophilic metal chelate via a hydrophobic, fluorinated L-phenylalanine based spacer (Scheme 1). The metal chelate selected is a Gd(III)-DTPA complex that contains two overall remaining charges per complex and necessarily two counter ions. The one-dimensional growth of the aggregate is directed by π-π stacking and intermolecular hydrogen bonding. However, the electrostatic, repulsive forces that arise from the charges on the Gd(III)-DTPA complex start limiting the one-dimensional growth of the BTA-based discotic once a certain size is reached. At millimolar concentrations the formed aggregate has a spherical shape and a diameter of around 5 nm as inferred from ¹H-NMR spectroscopy, small angle X-ray scattering, and cryogenic transmission electron microscopy (cryo-TEM). The strength of the electrostatic repulsive interactions between molecules can be reduced by increasing the salt concentration of the buffered solutions. This screening of the charges induces a transition from spherical aggregates into elongated rods with a length > 25 nm. Cryo-TEM allows to visualise the changes in shape and size. In addition, CD spectroscopy permits to derive the mechanistic details of the self-assembly processes before and after the addition of salt. Importantly, the cooperativity -a key feature that dictates the physical properties of the produced supramolecular polymers- increases dramatically upon screening the electrostatic interactions. This increase in cooperativity results in a significant increase in the molecular weight of the formed supramolecular polymers in water.

протокол

Схема 1. Самосборка БТА на основе цитрата дискотиков в буфер в сферические агрегаты показывает диаметром около 5 нм, в мМ концентрации блока. Увеличение ионной силы при добавлении NaCl приводит к образованию удлиненных стержней диаметром около 3 нм и длиной> 25 нм. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

1. Подготовка БТА-Б (III) DTPA Решения для CD спектроскопии и измерения в зависимости от температуры CD спектров как функция концентрации NaCl

1. Подготовьте 100 мМ цитратном буфере (рН 6.0).
2. Подготовьте 100 мМ цитратном буфере (рН 6,0) с 2 М NaCl.
3. Растворите 0,254 мг БТА-Б (III) DTPA (MW = 3184 г • моль ^-1) в 10 мл 100 мМ цитратном буфере, тЦелевые концентрации 8 • 10 ^{-3 мм} БТА-Б (III) DTPA.
4. Разрушать ультразвуком решение в течение 5 минут.
5. Заполнить 1 см УФ кювете с раствором и измерить спектр КД от 230 до 350 нм и кривой CD охлаждения на самом высоком группа CD интенсивности (например, λ = 269 нм) от 363 - 283 К со скоростью 1 К мин ^{- 1.}
6. Добавьте такой же объем 2 М NaCl буферный раствор цитрата в буферном растворе БТА-Б (III) DTPA в целях увеличения ионной силы до 1 М NaCl, разбавляя дискотиков половине концентрации целевой концентрации 4 • 10 ^-3 мМ БТА-Б (III) DTPA.
7. Vortex решение с повышенной ионной силой в течение 5 минут.
8. Повторные измерения спектра КД от 230 до 350 нм и кривой CD охлаждения на самом высоком интенсивности полосы CD от 363 - 283 К со скоростью 1 K мин ^-1.

2. Установка Т-зависимых данных компакт-диска на модель Т-зависимостиЛОР самосборки

1. Исходные данные на CD были экспортированы в происхождении 8.5 и нормализовался. Это было достигнуто путем определения CD эффект на самых высоких измерений температуры, равной 0, а компакт-диск эффект при минимальных измерений температуры, равной 1. Поскольку величина CD-эффект пропорционален степени агрегации ^8, нормированные CD-кривых пропорциональны степени агрегации.
2. Нормализованные данные были установлены в рамках нелинейной вариант кривую в OriginPro 8.5 Использование Т-зависимый самостоятельной сборки модели, полученные ван-дер-Schoot ^8,9. В этой модели зарождения и удлинение режима отличаются. Первая степень агрегации в режиме растяжения (Т _<Т е) была установлена ​​с помощью следующего уравнения:

Над уравнении (рядом с переменной температурой, T, и степень aggregation, Φ _п) три параметра, т.е. энтальпии удлинение ч _е удлинение температуры Т _е (температура, при которой самостоятельной сборки начинается), а параметр Φ _СБ, который вводится, чтобы Φ _п / Φ _СБ делает не превышает единицы, что следует из ограничений, что степень агрегации не может превышать единицу.

Установка оказывает энтальпии удлинение ч _е (Дж / моль) и удлинение температуры _Т е (К), которые характеризуют самосборки молекул при данной концентрации. При установке, один ограничения необходимо соблюдать которых является то, что только степень агрегации при температурах ниже _Т е должны быть установлены, так как уравнение 2.1 распространяется только на удлинение режима.

Далее, экспериментально обнаружены степень агрегациизарождения режим может быть установлен, по следующей формуле:

Над уравнении (рядом с переменным Т и Φ _п) четыре параметра, которые уже три были определены с уравнением 2.1, т.е. энтальпии удлинение ч _е удлинение температуры _Т е и параметр Φ _SAT. Единственный неизвестный параметр К стоимости описания кооперативности зарождения фазы, которая находится по установке Экспериментально установлено, степень агрегации при температурах выше _Т е.

3. Подготовка БТА-Б (III) DTPA решения для электронной микроскопии и визуализации супрамолекулярных полимеров с помощью криогенного TEM

1. Приготовьте два буфера: 100 мМ цитратном буфере (рН 6,0) и 100 мМ цитратном буфере (рН 6,0) Wй 5 М NaCl.
2. Растворите 0,318 мг БТА-Б (III) DTPA (MW = 3184 г • моль ^-1) в 0,1 мл каждого подготовленного буфера, целевой концентрации 1 мМ БТА-Б (III) DTPA.
3. Пример стеклования для криогенных ТЕМ осуществляется с помощью автоматизированной робот стеклования (FEI Vitrobot Mark III). CryoTEM сетки (R2 / 2 Quantifoil Йена сетки из Quantifoil Micro Tools GmbH) являются поверхности плазмы рассматривается до стеклования процедуры с использованием углерода Cressington 208 для нанесения покрытий, работающих на 5 мА в течение 40 сек. Водный раствор наносится на сетку во время стеклования на автоматизированных FEI Vitrobot. Это связано с применением образца на сетке, блоттинга лишнюю жидкость для создания тонкой пленки из водного раствора на сетку и последующего стеклования путем погружения сетки очень быстро в жидкой этан. После остекловывания образца хранятся в жидком азоте и переносить вручную на автопогрузчик кассеты, а также Cooleг с жидким азотом. Кассета вставляется в автозагрузчик ТЕМ. Все это делается вручную.
4. CryoTEM Эксперименты проводились на ТУ / е cryoTITAN (FEI), ( www.cryotem.nl ). ТУ / е cryoTITAN оборудован полевой эмиссии пистолет (FEG), работающий на 300 кВ. Изображения были записаны с помощью 2к х 2к Gatan CCD камера оснащена сообщение колонке Gatan энергии фильтром (GIF).

4. ¹ H-ЯМР DOSY измерений сферических самоорганизующихся БТА-Б (III) DTPA при низкой ионной силы

1. Подготовьте 50 мМ г _{6-сукцинат} буфера в D ₂ O ("рН 6,0), буфер готовят, растворяя г _{6-янтарной} кислоты в D ₂ O, а затем, регулируя рН до 6,0 с помощью 1 М ND ₄ OD в D ₂ O. Конечной концентрации 50 мМ сукцинат была скорректирована с дополнительными D ₂ O.
2. С Gd (III) сильно парамагнитныхи ¹ Н сигналов будет тем самым значительно расширить, Gd (III) был заменен на Y (III).
3. Растворить 2,98 мг БТА-Y (III) DTPA (MW = 2979 г • моль ^-1) в 1 мл 50 мМ г _{6-сукцинат} буфера в D ₂ O ("рН 6,0), цель концентрации 1 мМ БТА- Y (III) DTPA.
4. ¹ H-ЯМР DOSY измерения проводятся на Varian Unity Inova 500 Спектрометр оснащен 5 мм ID-PFG зонда от Varian. DOSY эксперименты проводились с использованием DOSY одного выстрела (Doneshot, Varian) импульсной последовательности. 90 градусов, пульс унд перемешивания были адаптированы соответственно. Химические сдвиги ссылаться, используя химический сдвиг 3 - (триметилсилил) пропионовой-2, 2,3,3 - [D _4] натриевая соль (ТСГУ).
5. Самодиффузии HDO был использован для калибровки измерений; известно из литературы, что самодиффузии HDO в D ₂ O при 298 К составляет 19,0 × 10-9 м ² • с ^-1. В качестве примера можно самодиффузии HDO в D ₂ O была измерена в VARIAN 2 Гц D ₂ O стандартных образцов и калибровка к стандартному значению. Модель, используемая для расчета гидродинамических радиусов R _Н агрегатов Стокса-Эйнштейна соотношение для распространения сферической частицы.

5. Представитель Результаты

¹ H-ЯМР и DOSY МУР измерений на БТА-M (III)-DTPA: сферические объекты в цитратном буфере

Ионный характер периферической Gd (III) комплексов представляет разочарование в одномерном росте дискотических мономеров, основной предназначен для полимеризации в удлиненные палочковидные агрегатов. Баланс между притяжения и отталкивания взаимодействия контролирует размер и форму агрегатов (схема 2).

Схема 2.

Мощная техника, чтобы определить размер и форма частиц в растворе синхротронного источника малый угол рассеяния рентгеновских лучей (МУР). БТА-Б (III)-DTPA растворяли в буферном растворе цитрата и МУР профили были записаны и установлены в области 0,01 <д <0,1 Å ^-1. Наклон к нулю в области низких д региона (д <0,06 Å ^-1) указывает на отсутствие анизотропии формы в совокупности, что свидетельствует о наличии сферического объекта (рис. 1). Данных, измеренных в различных концентрациях были установлены помощью однородного монодисперсных сферических форм-фактора приводит к рассчитаны радиуса R, 3,2 нм. Рассчитанные геометрические радиус мономерных дискотических БТА-Б (III)-DTPA составляет 3,0 нм, что свидетельствует о наличии агрегатов с соотношением сторон близким к 1.

Рисунок 1. МУР профили для БТА-Б (III)-DTPA в цитратном буфере (100 мМ, рН 6) в 0,5 и 1,0 мм (сверху). DOSY ЯМР БТА-Y (III)-ДТПА в 50 мМ г _{6-сукцинат} буфера в 1,0 мм (снизу). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

В целях обеспечения дополнительных доказательств для сферической формы и нанометровых размеров самоорганизующихся объектов, мы провели ¹ H диффузии упорядоченная спектроскопия ЯМР ⁽¹ H-ЯМР DOSY) (рис. 1). DOSY ЯМР позволяет определить коэффициенты диффузии агрегатов, из которых гидродинамического радиуса (R _H) может быть вычислена. С Gd (III) сильно парамагнитных и ¹ H сигналов будет тем самым значительно расширить, мы изменили Gd (III) для диамагнитных Y (III). Коэффициентов диффузии агрегированных диамагнитных дискотических амфифила в дейтерированном буфер сукцинат (50 мМ, РН 6, с = 1 мм) была определена в 0.69x10-10 м ² с ^-1. Через Стокса-Эйнштейна отношения, мы вычисляем гидродинамического радиуса R _H 2,9 нм для дискретных объектов сферической размеров (табл. 1). Эта величина находится в прекрасном согласии с величиной, полученной по данным МУР для БТА-Б (III)-DTPA.

БТА-M (III)-DTPA [Мм]	D т [10 -10 м 2 с -1]	R H [Нм]	R б [Нм]
1	0,69	2,9	3,2

от DOSY ^б от МУР

Таблица 1. Результаты МУР и DOSY измерений для БТА-M (III)-DTPA.

Cryo-TEM на БТА-Б (III)-DTPA: от сферических объектов удлиненной наностержни

Еще одним свидетельством успешного контроля над одномерной стек длина была получена из крио-TEM микрофотографии. В связи с стеклования водных растворов криогенных ТЕМ сохраняет структурную морфологию самоорганизующихся агрегатов и позволяет избежать высыхания влияет, связанных с обычными пробоподготовки ТЕА. 2 (слева) показывает, что БТА-Gd (III)-DTPA производит ожидаемого сферической объектов с диаметром около 6 нм при концентрации 1 мМ, что подтверждает результаты МУР и DOSY измерений. Согласно этим данным, мы смогли получить самоорганизующихся дискретных объектов, которые можно считать эквивалентными супрамолекулярных дендритных макромолекул ^10.

На рис. 2 Cryo-TEM изображения для БТА-Б (III)-DTPA (слева) и 1 мМ керамический при 298 К в цитратном буфере (100 мМ, рН 6), линейка представляет собой 50 нм;(Справа), 1 мМ керамический при 298 К в цитратном буфере (100 мМ, рН 6) и общее NaCl концентрацией 5 M, линейка составляет 50 нм.

До сих пор мы работали только в буферных растворах с низкой ионной силой. Однако, если электростатические силы отталкивания периферической взимается M (III)-DTPA комплексов на БТА-Б (III)-DTPA находятся на происхождение несостоявшегося одномерный рост, мы ожидали, что увеличение ионной силы буферной среды, с использованием инертного 1:01 соли с высокой гидратированных противоионов, следует уменьшить электростатических взаимодействий и, следовательно, различные типы самоорганизующихся объект должен быть сформирован. В цитратного буфера, включающий 5 М NaCl, этот эффект действительно наблюдается (рис. 2, справа). Формирование высокой пропорции палочковидных супрамолекулярных полимеров отчетливо наблюдается в крио-TEM микрофотографии при высокой ионной силой. Электростатическое экранирование является наиболее вероятным объяснением этого вывода. Форма меняется от spherical совокупности около 6 нм в диаметре с удлиненными стержнями диаметром 6 нм и длиной до нескольких сотен нанометров.

CD измерения БТА-Б (III)-DTPA: переключение на кооперативных самоорганизации за счет увеличения ионной силы

Кругового дихроизма (КД) спектроскопии измеряет разницу в поглощении между левой и правой круговой поляризации света. При спиральной объект предпочтительным винтовой смысле, левой и правой циркулярно поляризованный свет будет поглощаться в разной степени, следовательно, что приводит к CD-эффект. Поскольку межмолекулярные водородные связи образуются между последовательными БТА-Б (III)-DTPA в агрегатах, которые выстроились в винтовой моды и stereogenic центром в L-фенилаланин фрагмент винтовой Позитивные чувства по сравнению с другими, мы ожидаем четкого CD Спектр из БТА-Б (III)-ДТПА на основе агрегатов ^11,12. Кроме того, зависит от температуры CD спектроскопия является мощныминструмент для оценки самосборки механизм БТА-Б (III)-DTPA полимеризации и позволяет получить выводы об устойчивости образовавшегося агрегатов ^13.

Например, компакт-диск комнатной температуре спектры БТА-Б (III)-DTPA (8х10 ^{-3 мм} или 4x10 ^{-3 мм} в 100 мМ буфера цитрата) при увеличении концентрации соли (0 М NaCl до 1,0 М NaCl) приведены В 3А. Несмотря на значительно более низкой концентрации применяют для CD измерения, эффект хлопка ясно указывает на наличие неповрежденных агрегатов, даже в микромолярных концентрации. Форма изменения спектра КД при увеличении концентрации соли, которая является хорошим показателем для уменьшения взаимодействия на периферии трубы и лучше упаковки дискотиков. Кроме того, CD кривых охлаждения одного и того же решения (363 - 283 К, измеренные при λ = 269 или 278 нм), показывают существенные различия в форме (рис. 3В). APродитель Т _{электронной} температуры, при которой начинается агрегация, переходит на более высокие температуры при более высокой концентрации соли и более механизмом сотрудничества, характеризуются более резкое увеличение CD-эффект, становится очевидной. В то время как кривая охлаждения при температуре 0 М NaCl, лучше всего описывается isodesmic процесса самосборки, кривая охлаждения в 1,0 М NaCl является типичным для совместного процесса самосборки ^14. В первом случае все константы ассоциации считаются равными, а в последнем случае самосборка происходит по крайней мере в два этапа. На первом этапе, "ядро" должно быть сформировано что энергетически очень невыгодным. После охлаждения ниже критической температуры полимеризации, удлинение и экспоненциальный рост в супрамолекулярные полимеры с высоким молекулярным весом ниже. Количественная оценка термодинамических параметров самосборки БТА-Б (III)-DTPA в 0 и 1 М NaCl помощью кооперативной модели четко показывает снижение K <SUB>, который является безразмерной постоянной активации ^8. Более низкие значения для К указывают на высокую степень кооперативности в процесса самосборки, которая выражается в формировании сильно вытянутых супрамолекулярных полимеров наблюдается в крио-TEM.

БТА-Б (III)-DTPA	С NaCl	К
8 x10 -3 мм	0 M	5 10 -2
4 x10 -3 мм	1 M	1 10 -4

Таблица 2. Степень кооперативности выраженное K в интервале температур зависит от самосборки БТА-Б (III)-DTPA в зависимости от концентрации NaCl (C _NaCl).

Рисунок 3. БТА-Gг (III)-DTPA в 100 мМ цитратном буфере (с = 8 x10 ^{-3 мм} при низкой ионной силы и 4 x10 ^{-3 мм} с высокой ионной силой)] CD спектров, снятых при температуре 293 К в зависимости от ионной силы , в _NaCl = 0, М - 1,0 М, молярное Δε эллиптичности рассчитывается следующим образом: Δε = CD-эффекта / (CXL), в котором в это концентрация БТА в моль л ^-1 и л является длина оптического пути в см ; B] CD-корреспондент кривых охлаждения измеряется на λ = 269 нм для 0 М NaCl и 278 нм для 1 М NaCl решения выразил также степень агрегации Φ _л в зависимости от концентрации NaCl в _NaCl = 0, M - 1,0 M, Φ _п рассчитывается путем деления измеренных CD-эффекта максимальной CD-эффект.

Обсуждение

Самоорганизации дискотических амфифилов обсуждались в этот вклад содержащих Gd (III)-DTPA комплекс в настоящее время расследования нового магнитно-резонансной томографии (МРТ) средства, которые сочетают в себе высокую контрастность с перестраиваемой раз выделение ^15. Таким образом, детали их самостоятельно монтаж поведения и их устойчивости в различных условиях, имеют решающее значение. Сочетание спектроскопических (CD и ЯМР), рассеяния (МУР) и микроскопии (крио-TEM) методов визуализации позволяет образовавшейся структуры и количественного их термодинамических параметров. Такое сочетание методов, как правило, применяется для самосборки молекул тех пор, пока льготные винтовой смысла в исследуемой системе позволяет разница в поглощении левой и правой круговой поляризации света.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента / оборудование	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
БТА-Б (III)-DTPA			Сделано в доме
БТА-Y (III)-DTPA			Сделано в доме
CD-спектроскопии	Jasco	Jasco J-815 спектрополяриметра
ЯМР	Varian	Varian Unity Inova 500 спектрометр	5 мм, ID-PFG зонд Varian
крио-TEM	FEI	cryoTITAN TEM
МУР	Голландско-бельгийский beamline (BM26B) на европейском радиационной Synchotron фонда (ESRF) в Гренобле, Франция