Controlando o tamanho, forma e estabilidade de Polímeros Supramoleculares na Água

Resumo

O objetivo desta experiência é determinar e controlar o tamanho, forma e estabilidade da auto-montagem anfifílicos discotic na água. Para aquosos baseados em polímeros supramoleculares tal nível de controle é muito difícil. Nós aplicamos uma estratégia usando ambas as interações repulsivas e atrativas. As técnicas experimentais aplicadas para caracterizar este sistema são amplamente aplicáveis.

Resumo

Para aquosas baseadas em polímeros supramoleculares, o controlo simultâneo sobre o tamanho, forma e estabilidade é muito difícil ^1. Ao mesmo tempo, a capacidade de fazer isso é altamente importante, tendo em conta um certo número de aplicações em matéria mole funcional, incluindo a electrónica, engenharia biomédica, e sensores. No passado, as estratégias de sucesso para controlar o tamanho ea forma dos polímeros supramoleculares tipicamente focado na utilização de modelos de ^2,3, tampadoras finais ⁴ ou selectiva técnicas de solvente ^5.

Aqui divulgamos uma estratégia baseada na auto-montagem anfifílicos discotic que leva ao controle sobre a duração da pilha e de forma ordenada, agregados colunares quirais. Ao equilibrar electrostáticas repulsivas interacções sobre o aro hidrófilo e atraentes forças não covalentes dentro do núcleo hidrofóbico do bloco de construção de polimerização, conseguimos criar pequenas e discreta objectos esféricos ^6,7. Aucantar a concentração de sal para examinar as acusações induz uma transição esfera de vara. Curiosamente, esta transição é expresso em um aumento de cooperatividade da temperatura dependente do mecanismo de auto-montagem, e agregados mais estáveis ​​são obtidos.

Para o nosso estudo, seleccionar uma benzeno-1 ,3,5-tricarboxamide núcleo (TBA) ligado a um quelato de metal hidrofílico através de um hidrófobo, o espaçador L-fenilalanina fluorado base (Esquema 1). O quelato de metal seleccionado é um complexo de Gd (III)-DTPA que contém dois globais cargas restantes por complexos e necessariamente dois contra-iões. O crescimento unidimensional do agregado é dirigido por π-π empilhamento e de ligação de hidrogénio intermolecular. No entanto, as forças repulsivas electrostáticas, que surgem a partir das taxas sobre o início Gd (III)-DTPA complexo limitar o crescimento unidimensional do discotic BTA baseado uma vez um certo tamanho é atingido. Em concentrações milimolares o agregado formado tem uma SPHEforma rical e um diâmetro de cerca de 5 nm como inferidas a partir de ¹ H-NMR, pequeno ângulo de espalhamento de raios-X e microscopia eletrônica de transmissão criogênico (crio-TEM). A força das interacções electrostáticas repulsivas entre as moléculas podem ser reduzidos através do aumento da concentração de sal de as soluções tamponadas. Este rastreio das cargas induz uma transição de agregados esféricos em hastes alongadas com um comprimento de menos de 25 nm. Cryo-TEM permite visualizar as alterações na forma e tamanho. Além disso, CD espectroscopia permite derivar os detalhes mecanísticos dos processos de auto-montagem antes e após a adição de sal. Importante, a cooperatividade-uma característica chave que determina as propriedades físicas do supramolecular produzido polímeros de aumentos dramaticamente na triagem das interacções electrostáticas. Este aumento nos resultados de cooperatividade em um aumento significativo no peso molecular dos polímeros formados supramoleculares em água.

Protocolo

Esquema 1. Auto-montagem de BTA baseados discotics em tampão de citrato em agregados esféricos mostrando diâmetros de cerca de 5 nm, em concentrações milimolares de bloco de construção. O aumento da força iónica pela adição de NaCl resultados na formação de hastes alongadas, com um diâmetro de cerca de 3 nm e comprimento de menos de 25 nm. para ver figura maior .

1. Preparando um BTA-Gd (III) DTPA Soluções para CD Espectroscopia e medição da temperatura-dependente Spectra CD como uma função da concentração de NaCl

1. Preparar um tampão de citrato 100 mM (pH 6,0).
2. Preparar um tampão de citrato 100 mM (pH 6,0) com 2 M de NaCl.
3. Dissolve-se 0,254 mg de BTA-Gd (III) DTPA (MW = 3184 g • mol ^-1) em 10 mL de tampão de citrato 100 mM, target concentração 8 • 10 mM ^-3 de BTA-Gd (III) DTPA.
4. Sonicar a solução durante 5 minutos.
5. Encher uma cuvete 1 centímetro de UV com a solução e medir um espectro de CD a partir de 230 a 350 nm e uma curva de arrefecimento CD na maior banda intensidade CD (por exemplo, lambda = 269 nm) 363-283 K, a uma taxa de 1 K min ^{- 1.}
6. Adicionar o mesmo volume de 2 M de NaCl tamponado solução para o citrato de solução tamponada de TBA-Gd (III) DTPA, a fim de aumentar a força iónica para 1 M de NaCl, diluindo as discotics a metade da concentração, a concentração alvo 4 • 10 ^-3 mM de TBA-Gd (III) DTPA.
7. Vortex da solução com o aumento da força iônica por 5 minutos.
8. Remensurar um espectro de CD a partir de 230 a 350 nm e uma curva de arrefecimento CD na maior banda intensidade CD 363-283 K, a uma taxa de 1 K min ^-1.

2. Ajuste dos dados T-dependentes de CD para um modelo para T-dependement Auto-montagem

1. Os dados do CD-primas foram exportados para Origin 8.5 e normalizado. Isto foi conseguido através da definição de o efeito de CD na maior temperatura medida como igual a 0, eo efeito de CD no nível mais baixo de temperatura medida como igual a 1. Uma vez que a magnitude do CD-efeito é proporcional ao grau de agregação ^8, as curvas normalizadas CD-se proporcional ao grau de agregação.
2. Os dados normalizados foram ajustados usando a opção de ajuste não-linear da curva em OriginPro 8.5 usando um T-dependente modelo de auto-montagem obtidos por van der Schoot ^8,9. Neste modelo, uma nucleação e um regime de alongamento são distinguidos. Primeiro, o grau de agregação do regime de alongamento (T e) foi montado, usando a seguinte equação:

Equação acima contém (próximo da temperatura variável, T, eo grau de AGGRegation e Φ _n) Três parâmetros; isto é, a entalpia de alongamento _e h, o alongamento temperatura T _e (a temperatura a que a auto-montagem é iniciado) eo parâmetro Φ _SAT, o qual é introduzido para assegurar que Φ _n / Φ _sab faz não pode exceder a unidade, o que resulta a restrição de que o grau de agregação não pode exceder a unidade.

Encaixe torna a entalpia de alongamento h _e (J / mol) e o alongamento temperatura T _e (K) que caracterizam a auto-montagem das moléculas de uma dada concentração. Na montagem, uma restrição que deve ser obedecido é que apenas o grau de agregação em temperaturas abaixo de T _e devem ser instalados, uma vez que a equação 2.1 é válida apenas no regime de alongamento.

Em seguida, o grau de agregação experimentalmente encontrados noregime de nucleação pode ser equipado, usando a seguinte equação:

Acima equação contém (ao lado das variáveis ​​T e Φ _n) quatro parâmetros dos quais já foram determinadas três com a equação 2,1; isto é, a entalpia de alongamento _e h, o alongamento temperatura T _e eo Φ parâmetro _SAT. O único parâmetro desconhecido é o K _um valor que descreve a cooperatividade da nucleação de fase que é encontrado pelo ajuste do grau de agregação experimentalmente encontrados para temperaturas acima de T _e.

3. Preparando BTA-GD Solutions (III) DTPA para Microscopia Eletrônica de Transmissão e Visualização de Polímeros Supramoleculares via criogênico TEM

1. Preparar dois tampões: um tampão de citrato 100 mM (pH 6,0) e um tampão de citrato 100 mM (pH 6,0) wom 5 M de NaCl.
2. Dissolve-se 0,318 mg de BTA-Gd (III) DTPA (MW = 3184 g • mol ^-1) em 0,1 mL de cada um dos tampões, preparados, alvo concentração de 1 mM de TBA-Gd (III) DTPA.
3. A vitrificação amostra para criogénico MET é realizada utilizando um robot de vitrificação automatizado (FEI Vitrobot Mark III). CryoTEM grades (R2 / 2 Quantifoil Jena grelhas de Quantifoil Micro Tools GmbH) são plasma superfície tratada antes do procedimento de vitrificação utilizando um Cressington 208 operacional revestidor de carbono a 5 mA durante 40 s. A solução aquosa é então aplicada sobre a grelha durante vitrificação em um automatizado FEI Vitrobot. Isto envolve a aplicação da amostra sobre a grade, blotting de líquido em excesso para criar uma película fina da solução aquosa na grelha e vitrificação subsequente por meio de imersão a grade muito rapidamente no etano líquido. Depois de vitrificação a amostra é mantida em azoto líquido e transferidas manualmente na cassete autoloader, também cooled com azoto líquido. A cassete é então inserido no carregador automático do MET. Tudo isso é feito manualmente.
4. Os experimentos são realizados cryoTEM na TU / e cryoTitan (FEI), ( www.cryotem.nl ). O cryoTitan TU / e está equipado com uma pistola de emissão de campo operacional (FEG) a 300 kV. As imagens foram gravadas usando um 2k x 2k Gatan câmera CCD equipado com um pós-coluna Gatan Energia Filter (GIF).

4. ¹ H-DOSY As medições de RMN de esférico de auto-montagem BTA-Gd (III) DTPA em baixa força iónica

1. Prepara-se uma 50 mM de tampão d _6-succinato em D ₂ O («pH 6,0 '); o buffer é preparada por dissolução de ácido _6-d succínico em D ₂ O, seguido por ajustamento do pH para 6,0 usando 1 M ND ₄ OD em D ₂ O. A concentração final de 50 mM de succinato foi ajustado com adicional D ₂ O.
2. Uma vez que Gd (III) é altamente paramagnéticoe sinais de ¹ H seria assim aumentado significativamente, Gd (III) foi substituído por Y (III).
3. Dissolve-se 2,98 mg de TBA-Y (III) DTPA (MW = 2979 g • mol ^-1) em 1 mL de um tampão de 50 mM d _6-succinato em D ₂ O («pH 6,0 '), a concentração-alvo 1 mM BTA- Y (III) DTPA.
4. As medições de ¹ H-RMN DOSY são realizadas em um Varian Unity Inova 500 equipado com um espectrómetro de 5 mm ID PFG-sonda da Varian. Os experimentos DOSY foram realizados utilizando o DOSY one-shot (Doneshot, Varian) seqüência de pulsos. Os 90 graus vezes und pulso de mistura foram adaptados em conformidade. Os desvios químicos foram referenciados usando o desvio químico da 3 - (trimetilsilil)-propiónico-2, 2,3,3 - [D _4] sal de sódio de ácido (TMSP).
5. A auto-difusão de HDO foi utilizado para calibrar as medições, que é conhecido da literatura que a auto-difusão de HDO em D ₂ O a 298 K é 19,0 m × ^10-9 fevereiro • s ^-1. Como referência, a auto-difusão de HDO em D ₂ O foi medida num Hz 2 VARIAN D ₂ O padrão da amostra e calibrado para o seu valor padrão. O modelo utilizado para calcular o hidrodinâmico raios R _H dos agregados é a relação de Stokes-Einstein para a difusão de uma partícula esférica.

5. Os resultados representativos

¹ H-RMN DOSY e as medições de SAXS sobre DTPA-BTA-M (III): objectos esféricos, em tampão de citrato

O carácter iónico dos periféricos Gd (III) os complexos introduz frustração no crescimento unidimensional dos monómeros discotic cujo núcleo é concebido para polimerizar em alongadas haste-como agregados. O equilíbrio entre as interacções atractivas e repulsivas controla o tamanho ea forma dos agregados (Esquema 2).

Esquema 2.

Uma técnica poderosa para determinar o tamanho ea forma de partículas em solução é a fonte de sincrotrão pequeno ângulo de raios-X de espalhamento (SAXS). BTA-Gd (III)-DTPA foi dissolvido numa solução tampão de citrato e os perfis de SAXS foram gravadas e equipado na região 0,01 <0,1 Å ^-1. A inclinação se aproximando de zero na região baixo-q (q <0,06 Å ^-1) indica uma falta de anisotropia de forma, no total, sugerindo a presença de objetos esféricos (Figura 1). Os dados medidos em diferentes concentrações foram ajustados usando um homogénea monodispersos factor de forma esférica que conduz a um raio calculado, R, de 3,2 nm. O raio calculado geométrica de discotic monomérica BTA-Gd (III)-DTPA é de 3,0 nm, o que sugere a presença de agregados com uma relação de aspecto próxima de 1.

Figura 1. Perfis de SAXS para BTA-Gd (III)-DTPA em tampão citrato (100 mM, pH 6), 0,5 e 1,0 mM (em cima). DOSY RMN de BTA-Y (III)-DTPA em 50 mM tampão d _6-succinato a 1,0 mm (inferior). Clique aqui para ver maior figura .

A fim de proporcionar evidência adicional para a forma esférica e nanómetro tamanho dos objectos de auto-montagem, foi realizada ^uma difusão H-ordenada espectroscopia de RMN ⁽¹ H-RMN DOSY) (Figura 1). DOSY-RMN permite a determinação dos coeficientes de difusão de agregados, a partir do qual o raio hidrodinâmico (R _H) pode ser calculada. Uma vez que Gd (III) é altamente paramagnético e ¹ sinais H seria assim aumentado significativamente, mudamos Gd (III) para diamagnético Y (III). Os coeficientes de difusão do anfifilo diamagnético agregado discotic em um tampão de succinato deuterado (50 mM, PH 6, c = 1 mM) foi determinado para ser 0.69x10-10 m ² s ^-1. Via a relação de Stokes-Einstein, calcula-se um raio R hidrodinâmico _H de 2,9 nm para os objectos discretas de tamanho esférica (Tabela 1). Este tamanho é em excelente concordância com o valor obtido a partir de dados de SAXS para BTA-Gd (III)-DTPA.

BTA-M (III)-DTPA [Mm]	D t a [10 -10 m 2 s -1]	R H uma [Nm]	R b [Nm]
1	0,69	2,9	3,2

^um de DOSY; ^b de SAXS

Tabela 1. Resultados de SAXS e medições DOSY para DTPA-BTA-M (III).

Cryo-TEM em BTA-Gd (III)-DTPA: a partir de objectos esféricos para nanorods alongadas

Outra evidência para o sucesso do controle sobre unidimensional comprimento pilha foi obtido a partir de crio-micrografias TEM. Devido à vitrificação das soluções aquosas criogénico MET preserva a morfologia estrutural dos agregados de auto-montagem e evita a secagem afecta relacionada com a preparação convencional MET amostra. Figura 2 (à esquerda) mostra que BTA-Gd (III)-DTPA produz o esférica esperado objectos com diâmetros cerca de 6 nm, a uma concentração 1 mM, o que confirma os resultados de SAXS e medições DOSY. De acordo com estes resultados, temos sido capazes de obter auto-montagem de objetos discretos que podem ser considerados o equivalente supramolecular de macromoléculas dendríticas ^10.

. Figura 2 Cryo-TEM imagens para BTA-Gd (III)-DTPA (à esquerda) 1 mM vitrificados a 298 K em tampão citrato (100 mM, pH 6), uma barra de escala representa 50 nm;(À direita) 1 mM vitrificados a 298 K em tampão citrato (100 mM, pH 6) e uma concentração total de NaCl de 5 M, barra de escala representa 50 nm.

Até agora, só trabalhou em soluções tamponadas de baixa força iônica. No entanto, se electrostáticas forças repulsivas do periférica carregada M (III)-DTPA complexos em BTA-Gd (III)-DTPA estão na origem do crescimento unidimensional frustrado, esperávamos que o aumento da força iónica do meio tamponado, usando um sal 1:1 inerte com contra-iões altamente hidratadas, deve reduzir as interacções electrostáticas e, portanto, um tipo diferente de auto-montagem objecto deve ser formada. Em tampão de citrato compreendendo 5 M de NaCl este efeito foi realmente observada (Figura 2, direita). A formação de relação de aspecto alto haste-como polímeros supramoleculares é claramente observado na crio-MET micrografias em força iónica elevada. Blindagem electrostática é a explicação mais provável para este achado. As alterações de forma a partir de uma SPHEagregada rical de cerca de 6 nm de diâmetro para hastes alongadas, com um diâmetro de 6 nm e comprimento de até várias centenas de nanómetros.

Medições de CD de DTPA-BTA-Gd (III): comutação em cooperação auto-montagem, aumentando a força iónica

Dicroísmo circular, espectroscopia (CD) mede a diferença de absorção entre canhotos e destros luz polarizada circularmente. Quando um objecto helicoidal tem um sentido preferido helicoidal, deixou-e destros luz polarizada circularmente será absorvido em diferentes graus, portanto, dando origem a um CD-efeito. Uma vez que as ligações de hidrogénio intermoleculares formado entre consecutivo BTA-Gd (III)-DTPA, dentro dos agregados, são alinhados em uma forma helicoidal eo centro estereogénico na porção L-fenilalanina favorece um sentido helicoidal sobre o outro, espera-se uma clara CD espectro de BTA-Gd (III)-DTPA agregados baseados ^11,12. Além disso, dependente da temperatura espectroscopia de CD é um poderosoferramenta para avaliar o mecanismo de auto-montagem de BTA-Gd (III)-DTPA polimerização e permite tirar conclusões sobre a estabilidade dos agregados formados ^13.

Como um exemplo, o quarto espectros de CD temperatura de BTA-Gd (III)-DTPA (mM 8x10 ^-3 ou mM 4x10 ^-3 num tampão de citrato 100 mM) com aumento da concentração salina (0 M de NaCl a 1,0 M de NaCl) são dadas na Figura 3A. Embora uma concentração significativamente inferior é aplicada para as medições de CD, o efeito de algodão claro indica a presença de agregados intactas, mesmo em concentrações micromolares. A forma das alterações espectro de CD sobre o aumento da concentração de sal, que é uma boa indicação para interacções reduzidas na periferia das pilhas e melhor de embalagem das discotics. Além disso, as curvas de CD de arrefecimento das mesmas soluções (363-283 K, medido a λ = 269 ou 278 nm) mostram diferenças distintas de forma (Figura 3B). O appai T _e-a temperatura à qual a agregação inicia-se desloca para temperaturas mais elevadas na maior concentração de sal e um mecanismo de cada vez cooperativa, caracterizada por um aumento mais abrupta na CD-efeito, torna-se aparente. Considerando que a curva de arrefecimento a 0 M de NaCl é melhor descrita por um processo de auto-montagem isodésmicas, a curva de arrefecimento a 1,0 M de NaCl é típico para um processo de auto-montagem cooperativa ^14. No primeiro caso, todas as constantes de associação são assumidos como sendo igual ao passo que no último caso, a auto-montagem ocorre em pelo menos duas fases distintas. No primeiro passo, um "núcleo" precisa de ser formado, que é energeticamente altamente desfavorável. Após arrefecimento abaixo de uma temperatura de polimerização crítico, alongamento e de crescimento exponencial em polímeros supramoleculares de alto peso molecular segue. Quantificar os parâmetros termodinâmicos do auto-montagem de BTA-Gd (III)-DTPA em 0 e 1 M de NaCl, utilizando um modelo de cooperativa revela claramente a diminuição na K <sub> um, que é a activação adimensional constante ^8. Os valores mais baixos para K _uma indicam um grau mais elevado de cooperatividade no processo de auto-montagem, que é expresso na formação de polímeros altamente alongadas supramoleculares como observado em crio-MET.

BTA-Gd (III)-DTPA	C NaCl	K um
8 mM x10 -3	0 M	5 10 -2
4 mM x10 -3	1 M	1 10 -4

Tabela 2. Grau de cooperatividade expressa por _um K na dependente da temperatura de auto-montagem de BTA-Gd (III)-DTPA como uma função da concentração de NaCl (C _NaCl).

Figura 3. BTA-Gd (III)-DTPA em um tampão de citrato 100 mM (c = 8 mM x10 ^-3 em força iónica baixa e 4 mM x10 ^-3 em força iónica elevada) A] espectros de CD registada a 293 K como uma função da força iónica , c _NaCl = 0 M - 1,0 M, a Δε elipticidade molar é calculada como se segue: Δε = CD efeito-/ (cxl), em que c é a concentração de TBA em mol L ^-1 e l é o comprimento do percurso óptico em centímetros ; B] curvas CD correspondente arrefecimento medidos em λ = 269 nm para 0 M de NaCl e 278 nm para soluções 1 M de NaCl expressa como o grau de agregação Φ _n como uma função da concentração de NaCl c _NaCl = 0 M - 1,0 M, Φ _n é calculado dividindo o efeito medido CD-pelo máxima CD-efeito.

Discussão

Os anfifílicos de auto-montagem discotic discutidos nesta contribuição que contém o Gd (III)-DTPA complexo estão atualmente sob investigação como novos Ressonância Magnética (MRI) agentes que combinam alto contraste com tempos ajustáveis ​​de excreção ^15. Assim, os detalhes de sua auto- montagem comportamento e da sua estabilidade em diferentes condições são de importância crítica. A combinação de espectroscópica (CD e RMN), espalhamento (SAXS) e microscopia (crio-TEM) de técnicas permite a visualização das estruturas formadas ea quantificação dos seus parâmetros termodinâmicos. Esta combinação de técnicas é geralmente aplicável para a auto-montagem de moléculas, desde que um sentido preferencial helicoidal no sistema estudado permite uma diferença na absorção de esquerda e destro luz polarizada circularmente.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente / equipamentos	Companhia	Número de catálogo	Comentários
BTA-Gd (III)-DTPA			Feito em casa
BTA-Y (III)-DTPA			Feito em casa
CD espectroscopia	Jasco	Jasco J-815 espectropolarímetro
NMR	Varian	Varian Unity Inova 500 espectrômetro	5-mm sonda ID PFG de Varian
crio-TEM	FEI	cryoTitan TEM
SAXS	Holandês-belga beamline (BM26B) no Laboratório Europeu de Radiação Synchotron (ESRF) em Grenoble, França