Estudio cuantitativo de Locomotion libremente Piscina microorganismos utilizando la difracción láser

Resumen

Los organismos microscópicos como el nematodo de nado libre C. elegans, Viven y se comportan en un complejo entorno tridimensional. Se presenta un enfoque novedoso que proporciona un análisis de C. elegans El uso de patrones de difracción. Este enfoque consiste en el seguimiento de la periodicidad temporal de los patrones de difracción generados por dirigir la luz láser a través de una cubeta.

Resumen

Suelos y organismos acuáticos microscópicos viven y se comportan en un complejo entorno tridimensional. La mayoría de los estudios de comportamiento organismo microscópico, en contraste, se han realizado utilizando enfoques basados ​​en microscopio, que limitan el movimiento y comportamiento a un estrecho campo, casi bidimensional focal. ¹ Se presenta un enfoque novedoso analítico que proporciona análisis en tiempo real de nadar libremente C. elegans en una cubeta sin dependencia de microscopio basado en equipo. Este enfoque consiste en el seguimiento de la periodicidad temporal de los patrones de difracción generados por dirigir la luz láser a través de la cubeta. Medimos frecuencias de oscilación para los nematodos libre de natación.

Análisis de los patrones de difracción de campo lejano se revela pistas sobre las formas de onda de los nematodos. La difracción es el proceso de doblado luz alrededor de un objeto. En este caso, la luz es difractada por los organismos. Las ondas de luz interfieren y pueden formar anuncioiffraction patrón. Un campo lejano, o Fraunhofer, patrón de difracción se forma si la distancia de la pantalla a objeto es mucho más grande que el objeto de difracción. En este caso, el patrón de difracción se puede calcular (modelado), usando una transformada de Fourier. ²

C. elegans son de vida libre de nematodos viven en el suelo que navegan en tres dimensiones. Se mueven tanto en una matriz sólida como la tierra o el agar en un patrón sinusoidal locomotor llamado gatear y en líquido en un patrón diferente llamado natación. ³ Las funciones que desempeña la información sensorial proporcionada por mechanosensory, quimiosensorial, y las células thermosensory que rigen los cambios plásticos en la locomoción los patrones y los interruptores en los patrones están empezando a dilucidar. ⁴ Se describe un método óptico para medir la locomoción de nematodos en tres dimensiones que no requiere de un microscopio y nos permitirá comenzar a explorar las complejidades de la locomoción nematodo bajo co diferentenditions.

Protocolo

1. C. elegans Preparación de Análisis de Vídeo

1. Mueva 10-20 nematodos adultos grávidas a nuevos NGM llenos de agar placas de Petri con un pico delgado, aplanado alambre de platino. Las placas Petri llenas con el agar NGM contener una pequeña mancha circular de E. coli (una cepa de crecimiento limitado, OP50, da los mejores resultados) para los nematodos para comer. Permita que los nematodos para poner sus huevos durante 3-5 horas y luego retire los adultos, estableciendo así una pequeña cultura, de desarrollo sincronizado de 50-150 nematodos. Permitir que los nematodos a crecer a la edad adulta temprana mediante la incubación de las placas Petri a 20 ° C durante 4-5 días. Estos métodos de cultivo se basan en procedimientos establecidos (Stiernagle 2006). ⁵
2. En el día del análisis de vídeo, lavar una placa de nematodos adultos jóvenes con 1 ml de agua desionizada, destilada, por lo tanto recoger 50-150 gusanos del cultivo sincronizado. Una solución tampón de PBS como M9 o también se puede utilizar. Utilice una microcentrífuga para hacer girar la wORM a la parte inferior del tubo, o permitir que se asienten por gravedad durante aproximadamente 15 min. Eliminar la mayor parte del agua desde el tubo y reemplazarlo con 1 ml de agua desionizada, destilada con el fin de lavar las bacterias adheridas a partir de los nematodos.
3. Transferir los nematodos en agua o tampón a una cubeta de cuarzo con una micropipeta. Es importante trabajar con un pequeño número, sobre los nematodos 5-10 en total en una vez o incluso menos de modo que uno de nematodos a la vez es probable que sea iluminada por el láser. Si el número de los nematodos en las placas de cultivo es demasiado grande, diluir los gusanos en agua o tampón hasta una densidad deseada. También es posible recoger los nematodos individuales a una gota de agua o de tampón en una placa de agar fresco para lavar y transferir gusanos individuales a la cubeta. En nuestro estudio, hemos utilizado 1 mm, 2 mm y 5 mm tamaños de cubetas para examinar los efectos de las restricciones físicas en el comportamiento natatorio.

2. Configuración óptico para el vídeo Analysis

1. Realice la configuración como se muestra en la Figura 1, utilizando un 543 nm (verde) El helio-neón (HeNe) láser, dos espejos de superficie frontal de aluminio, un soporte de la cubeta, una pantalla de proyección, y una cámara de alta velocidad (Casio Exilim High Speed) capaces de rodaje en ~ 240 fps. Los dos espejos se utilizan para dirigir el haz láser a través de la cubeta. Diferentes tamaños de cubetas se pueden utilizar dependiendo de la naturaleza del estudio. Como ejemplo, se utilizó cubetas que son 5 mm de espesor para mostrar los efectos de las restricciones espaciales en las frecuencias de natación. El rayo láser debe satisfacer los requisitos de sobremuestreo;. Es decir, el organismo debe obstruir no más de un tercio del haz de láser. Para C. elegans, el rayo láser debe ser de aproximadamente 2 mm de diámetro cuando interactúa con un nematodo. El rayo láser no debe ser mayor que 5 mm de diámetro ya que el patrón de difracción será difícil de localizar. La distancia desde el organismo de difracción de la pantalla debe ser mucho mayor queel propio organismo.
2. Place Parafilm sobre la parte superior de la cubeta y se invierte para mezclar los nematodos en la columna de agua. Colocar la cubeta en un soporte de cubeta de modo que los gusanos son inicialmente cerca de la parte superior de la cubeta. Uso de los espejos, dirigir el haz láser a través del centro de la cubeta. Debido a que los nematodos son más densos que el agua, lentamente se caen al fondo de la cubeta, mientras que al mismo tiempo nadando dentro de la columna de agua.
3. En la pantalla de proyección, el color de la mancha correspondiente al haz de láser transmitido negro para reducir la dispersión como el haz transmitido cumple la pantalla de proyección (Figura 2). Alternativamente poner una abertura en la pantalla de proyección para permitir que el haz transmitido a pasar a través de la pantalla. La eliminación o reducción de la dispersión de haz transmitido mantendrá la matriz CCD de la cámara de saturación debido al haz transmitido.
4. Para capturar una medida del tamaño del patrón de difracción, dibujar una línea deaproximadamente 5 cm sobre la pantalla de proyección junto al punto del láser de haz transmitido sin interferir con la imagen de luz difractada.
5. Inicio de la grabación con la cámara mientras la luz de la habitación se encuentra en modo que la línea de 5 cm se encuentra en el mismo metraje que las imágenes de difracción. Apague la luz de la habitación. Grabar imágenes de difracción en la pantalla con la cámara como gusanos pasan a través del haz de láser.

3. Datos de Vídeo Preparación

1. Instalar el programa de análisis de vídeo (Logger Pro: http://www.vernier.com/products/software/lp/ ) en el equipo. Importe el vídeo en el programa de análisis de vídeo
2. Establecer el origen para coincidir con el punto de láser transmitida. Ajuste la escala utilizando la línea de 5 cm en la pantalla de proyección.
3. Seguir el desplazamiento angular de la imagen de difracción formada por cada nematodo utilizando el software de análisis de vídeo (Figura 3)
4. Para encontrar la angulaciónr desplazamiento tomando el arctan (y / x), copiar y pegar datos en una hoja de cálculo (Excel) y añadir 180 º o π para todos los ángulos negativos para producir un gráfico continuo (Figura. 4).

4. Adquisición de datos en tiempo real para la observación inmediata de las frecuencias de Natación

1. Usando la misma configuración que para el análisis de vídeo, coloca un fotodiodo (DET10A de Thorlabs) con un área pequeña (~ 1 mm ²⁾ fuera del centro en el patrón de difracción justo en frente de la pantalla de proyección.
2. Conecte el fotodiodo al osciloscopio digital (PicoScope realizada por Pico Technology) que se conecta al ordenador a través del puerto USB. Observar los patrones paliza en la pantalla del ordenador.
3. Guardar adquiridos conjuntos de datos en formato ASCII o de texto.

5. Análisis de Datos

1. Importe los datos obtenidos utilizando el vídeo o el fotodiodo en un programa de análisis de datos capaz de formas de onda de ajuste mediante chi-cuadrado minimización. El programa utilizado es de origen ( http://www.originlab.com/ ). Ajustar una curva sinusoidal para determinar la frecuencia paliza (Figuras 4 y 5).
2. Frecuencias promedio de natación de diversas muestras y determinar la varianza. Para este estudio, los datos se analizaron estadísticamente usando un ANOVA de un solo factor seguido por el test de Bonferroni comparaciones múltiples. Un valor de p de <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

6. Patrones Modelo de difracción utilizando Mathematica como ejemplo

Nota: Los patrones de difracción se puede modelar usando muchas herramientas computacionales diferentes. Este procedimiento será diferente para diferentes herramientas computacionales como Matlab, Excel, origen, etc

1. Crear imagen: Tomar imágenes de nematodos en un portaobjetos de microscopio utilizando un microscopio tradicional.
2. Binarización imagen: Importar 'gusano' la imagen gusano into Mathematica arrastrando la imagen en Mathematica. Convertir la imagen en una imagen en blanco y negro (binarización). Esto se puede lograr con la 'binarización' comando en Mathematica: BlackandWhiteImage = binarización [Gusano]. La imagen puede ser vista como una imagen en blanco y negro.
   También puede utilizar el comando 'EdgeDetect' para crear un BlackandWhiteImage: EdgeDetect [Worm, 6.0,0.035], donde los dos números finales controlar el grosor de los bordes resultantes.
3. Convertir la imagen en una matriz de ceros y unos: Esto se puede lograr con el 'ImageData' comando en Mathematica: Matrix = ImageData [BlackandWhiteImage].
4. Transformada de Fourier matriz: Usa el enlace 'Fourier' comando en Mathematica para transformar la matriz de Fourier utilizando los FourierParameters indicados: FTransform = Fourier [Matrix, FourierParameters -> {0, -2}].
5. Square módulo de matriz para obtener la matriz de difracción y mejorar el contraste de la imagen: Cuadrado del absolutovalor de la matriz y visualizar la imagen resultante, que es el patrón de difracción correspondiente a la imagen original. Además, utilice la opción 'Conectar' función escalar el contraste de la imagen: ImageContrast = Imagen [Log [1 + (Abs [FTransform]) ^ 2] / 0,5].
6. Cambiar el tamaño de la imagen para facilitar su visualización: Recortar el patrón de difracción central y cambiar el tamaño como desee: ImageResize [ImageContrast [y, 100], 500].
7. Comparar los patrones de difracción modelados con patrones de difracción obtenidos a partir de los gusanos libre de natación. (Figura 6)

Resultados

Como ejemplo, se estudió C. elegans en una cubeta de cuarzo de 1 cm de ancho, 5 mm de espesor y 4 cubetas cm de altura. El muestreo de un solo gusano utilizando el análisis de vídeo, la frecuencia de natación media obtenida a partir de análisis de vídeo en una cubeta de 5 mm de espesor es de aproximadamente 2,5 Hz (Figura 4). Del mismo modo, el muestreo de un solo gusano utilizando el método de tiempo real de adquisición de datos, se obtiene una frecuencia de natación de aproximadamente 2,7 Hz (Figura 5), usando el osciloscopio digital (PicoScope). Este procedimiento se puede repetir para muchos gusanos. Un estudio detallado de los gusanos libremente natación reveló una frecuencia de natación media de 2,37 Hz en una cubeta de 5 mm. ⁶ Como era de esperar, la frecuencia de la piscina es más alta que para un gusano que se arrastra (~ 0,8 Hz). ³ El uso de este método de difracción, la frecuencias medias Natación de una C. elegans, que se limita a un portaobjetos de microscopio, se ha encontrado que coincide con el valor previamente publicado de 2 Hz. ^1,7

ve_content "> Siguiendo los procedimientos 3.) y luego 6.) permite el modelado de natación patrones de difracción con la ayuda de imágenes de gusano obtenidos con un microscopio convencional. Los patrones de difracción de modelado se utilizan para simular un ciclo de natación de la C. elegans ( Figura 6). Un modelo de éxito consiste en patrones de natación físicamente factibles sucesivas emparejan las frecuencias de natación. El gusano debe estar en la misma forma al final de un ciclo de baño como lo fue en el comienzo de un ciclo de natación.

Figura 1. Un verde láser HeNe se utilizó para crear un patrón de difracción dinámica utilizando vivo C. elegans. Este patrón de difracción fue filmado a 240 fps.

Figura 2. Dra ala un punto negro aumenta la absorción del haz transmitido. La saturación de la cámara debido a la dispersión de la luz se reduce y el patrón de difracción se hace visible.

Figura 3. Captura de pantalla del software de análisis de vídeo (Logger Pro) con un patrón de difracción de gusano que se está siguiendo. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 4. Los datos de vídeo correspondientes al ciclo de natación de un nemátodo en una cubeta de 5 mm. El ajuste de la curva muestra una frecuencia de natación de ~ 2,5 Hz.

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Figura 5. Datos en tiempo real correspondientes al ciclo de natación de un nemátodo en una cubeta de 5 mm. El ajuste de la curva muestra una frecuencia de natación de ~ 2,7 Hz.

Figura 6. La fila superior representa los patrones de difracción reales y se adapta a los patrones de difracción de modelado en la fila inferior. Los patrones de difracción de modelos fueron producidos usando gusanos en un portaobjetos de microscopio (fila del medio).

Discusión

Hemos desarrollado un nuevo enfoque para la medición en tiempo real de movimiento y comportamientos locomotores simples en organismos microscópicos como los nematodos que no requiere el uso de microscopios. ⁸ Este enfoque metodológico se podrían utilizar también para el estudio de numerosos organismos microscópicos como protistas. Este método sólo está limitado por la longitud de onda de la luz utilizada. El organismo no debe ser menor que la longitud de onda de la luz. Además del ahorro de costes y la portabilidad del equipo necesario, una ventaja clave de este método es la capacidad para medir el comportamiento en tiempo real y en tres dimensiones, sin las limitaciones estrechas de planos de imagen bajo un microscopio. También es posible con esta técnica para examinar las influencias de las fuerzas gravitacionales u otras numerosas condiciones en el comportamiento que no pueden ser estudiados utilizando microscopio basados ​​en enfoques. ⁹ Por lo tanto, se puede lograr una mejor comprensión de microorganismo natural locomotriz BEHAviors liberados de los confines de las gotas de portaobjetos de microscopio o cámaras especializadas de microfluidos (Park et al, 2008). ¹⁰

La falta de información de fase en un patrón de difracción no permite la recuperación directa de la imagen correspondiente al objeto de difracción desde el patrón de difracción de campo lejano es proporcional al cuadrado del valor absoluto de la transformada de Fourier. Estamos por lo tanto, el cálculo de los patrones de difracción de imágenes gusano de modo que se pueden combinar con los patrones de difracción de nematodos libremente natación (Figura 6).

Este método ha dado resultados verdaderamente libre para nadar C. elegans y se puede aplicar a cualquier especie microscópicas que las maniobras en un entorno ópticamente transparente como el agua o muchas soluciones iónicas diferentes. Microscopios convencionales sólo permiten estudios con una profundidad focal en el orden de los micrómetros. ¹¹ Esto es debido a la limitadaprofundidad de campo cuando se enfoca la luz:

donde el número-f N tiene una relación recíproca con el círculo de confusión (c) de modo que una longitud focal corta se asocia con un gran c. ^12,13 Aunque este método de difracción ciertamente no es un sustituto para la microscopía convencional, es capaz para obtener resultados cuantitativos rápidamente de modo que incluso las especies se pueden manipular en tiempo real a bajo coste. Los patrones de difracción se puede obtener con cualquier puntero láser. Los patrones de difracción se puede filmar con una resolución reducida temporal con una cámara digital normal. Mientras que el usuario puede no tener un microscopio o un fotodiodo fácilmente disponibles, las partes fundamentales de este experimento como la medición de frecuencias de volteo y evaluar los patrones de difracción se puede realizar a un costo extremadamente bajo.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
543 nm láser HeNe	Melles Griot	LGX1	Cualquier láser en el rango visible con menos de 5 mW se puede utilizar.
2 delanteros Espejos superficie de aluminio	Thorlabs	PF10-03-F01
High Speed ​​Exilim cámara	Casio
Cubeta de cuarzo	Las células Starna	21/G/5
LoggerPro (Software)	Vernier		http://www.vernier.com/products/software/lp/
Mathematica 8	Wolfram		http://www.wolfram.com/