自由レーザー回折を用いた微生物水泳の定量的ロコモーションスタディ

要約

自由遊泳性の線虫のような微細な生物 Cエレガンス住んでいると、複雑な3次元環境で動作します。我々は分析を提供斬新なアプローチを報告 Cエレガンス回折パターンを使用しています。このアプローチは、キュベットを通過するレーザ光を向けることによって、生成された回折パターンの時間的な周期性を追跡で構成されています。

要約

土壌や水生生物顕微鏡は、生きているし、複雑な3次元環境で動作します。微生物の挙動のほとんどの研究は、これとは対照的に、狭い、ほぼ2次元焦点フィールドへの移動や行動を制限する顕微鏡ベースのアプローチを使用して行われてきた^。1我々はのリアルタイム分析を提供しています小説分析的なアプローチを提示自由にCを泳ぐ顕微鏡ベースの機器に依存せずに、キュベット内エレガンス 。このアプローチは、キュベットを通過するレーザ光を向けることによって、生成された回折パターンの時間的な周期性を追跡で構成されています。私たちは、自由に泳いで線虫の発振周波数を測定する。

遠視野回折パターンの解析は、線虫の波形についての手がかりを明らかにする。回折は、オブジェクトの周りに曲げ光のプロセスです。この場合、光は生物によって回折される。光の波が干渉して、広告を形成することができるiffractionパターン。画面とオブジェクトの距離が回折物体よりもはるかに大きい場合、遠方界、またはフラウンホーファー、回折パターンが形成される。このケースでは、回折パターンは、フーリエ変換を用いて（モデル化）を算出することができる^。2

C. elegansのは、三次元的に移動する自由生活土壌中に生息する線虫である。彼らは、クロールや水泳と呼ばれる別のパターンで液体で呼び出さ正弦歩行パターンにおける土壌や寒天のような固体マトリックス上で両方を移動します。機械刺激、化学感覚、および運動器官における可塑的変化を支配thermosensory細胞によって提供される感覚情報が演じる³ロールパターン内のパターンとスイッチだけ解明され始めている。私たちは顕微鏡を必要としませんし、私たちは別の共同の下に線虫の運動の複雑さを探求し始めることを可能にする三次元で線虫の運動を測定する光学的ア ​​プローチを記述する⁴nditions。

プロトコル

1℃、ビデオ解析のためのエレガンス準備

1. 薄い、平らに白金線のピックを使用して新鮮なNGM寒天で満たされたペトリ皿に10-20妊娠成人虫を移動します。 NGM寒天でいっぱいペトリ皿は、 大腸菌の小さな円形のスポットを含む食べるために線虫用の大腸菌 （限られた成長株、OP50は、最良の結果を与える。）線虫は3-5時間の卵を産むことを許可してから、このようにして50から150線虫の小、発生的に同期化された文化を確立し、成人を削除します。線虫は4-5日間20℃ペトリプレートをインキュベートすることによって、成人早期に成長することができます。これらの培養方法は確立された手順（Stiernagle 2006）に基づいています⁵
2. ビデオ分析の日に、このように同期化された文化50から150ワームを集め、脱イオン蒸留水1mlで若い成人線虫のプレートをフラッシュします。 M9またはPBSのような緩衝液を使用することもできます。ワットをスピンさせて遠心を使用チューブの底にオームズ、またはそれらを約15分間、重力によって沈降することができます。管からの水の大部分を除去し、線虫から任意の付着細菌を洗い流すために、脱イオン蒸留水1mlに交換してください。
3. マイクロピペットを用いて石英キュベットに水または緩衝液で線虫を転送します。一度に1線虫は、レーザーで照らされる可能性があるように、それは1時間またはそれより少ない時、合計で5月10日線虫について、少人数で業務を進めることが重要である。培養プレート上に線虫の数が多すぎる場合は、所望の濃度に達するまで水または緩衝液中にワームを希釈します。それはそれらを洗うとキュベットに個別のワームを転送するために新鮮な寒天プレートに水または緩衝液の一滴まで個々の線虫を選ぶことも可能です。私たちの研究では、行動を泳いで物理的な制約の効果を調べるために1ミリメートル、2ミリメートルと5ミリメートルキュベットサイズを使用しました。

2。ビデオAnalysi用の光学セットアップの

1. できる543 nm（緑）ヘリウム-ネオン（ヘリウムネオン）レーザ、2つのフロント表面アルミニウムミラー、キュベットホルダ、投影スクリーン、高速カメラ（カシオハイスピードEXILIM）を使用して、 図1に示すように、セットアップを実行〜240 fpsで撮影中。 2ミラーは、キュベットを通してレーザービームを操縦するために使用されています。キュベットの異なるサイズは、研究の性質に応じて使用することができます。例として、私たちは水泳の周波数で空間的制約の効果を示すために厚さ5mmアールキュベットを使用していました。レーザービームは、オーバーサンプリングの要件を満たさなければならない、 すなわち 、生物がレーザービームの3分の1を超えないを妨害する必要があります。 Cのそれが線虫と対話するときelegansは 、レーザビームは直径約2mmでなければなりません。回折パターンを見つけることが困難になりますので、レーザービームは、直径5ミリメートルを超えるべきではありません。画面に回折生物からの距離よりもはるかに大きくする必要があります生物そのもの。
2. キュベットの上にパラフィルムを置き、水柱に線虫を混ぜて、それを反転させる。ワームは、キュベットの上部付近になるように最初にキュベットホルダーにキュベットを置きます。ミラーを使用して、キュベットの中心を通ってレーザービームを導くことができます。線虫は水よりも密度が高いので、同時に水柱内で泳いでいるうちに、彼らはゆっ​​くりと、キュベットの底に落ちるでしょう。
3. 送信ビームが投影画面（ 図2）を満たしているとして、投影スクリーン、色に黒透過したレーザ光 ​​に対応するスポットは、散乱を低減します。あるいは、送信ビームが画面を通過するように、投影スクリーンの開口部を置く。透過ビームからの散乱を排除または低減すること、透過ビームに起因する飽和からカメラのCCDアレイを維持します。
4. 回折パターンのサイズの基準をキャプチャするには、の線を引く回折光像に干渉することなく透過したレーザビームスポットの隣に投影スクリーン上に約5cm。
5. 部屋の明かりが5cmラインは回折像と同じ映像になるように入っているときにカメラで記録を開始します。室内灯の電源をオフにします。カメラを使用して、画面上でレコードの回折像ワームは、レーザービームを通過する。

3。ビデオ·データの準備

1. ：映像解析プログラム（ロガーProのインストールhttp://www.vernier.com/products/software/lp/をコンピュータ上で）。ビデオ解析プログラムにビデオをインポートする
2. 透過したレーザスポットと一致するように原点を設定します。投写画面に5cmのラインを使用してスケールを設定します。
3. ビデオ解析ソフトウェアを使用して、それぞれの線虫によって形成された回折像の角変位（ 図3）を追跡
4. アングラを検索するにはスプレッドシート（エクセル）にアークタンジェント（y / x）が 、コピーと貼り付けデータを取得し、継続的なグラフ（Figure. 4）を作製するために、すべての負の角度は180度またはπを追加することによりrの変位。

4。スイミング周波数の即時観測のリアルタイムデータ収集

1. ビデオ分析の場合と同じ設定を使用すると、投写画面の前面に回折パターンの右側の中央にある小さな領域（〜1ミリメートル^2）とフォトダイオード（ThorLabsからDET10A）を置きます。
2. USBポート経由でコンピュータに接続する、デジタルオシロスコープ（ピコ·テクノロジー社製PicoScope）にダイオードを接続してください。コンピュータの画面上でスラッシングパターンを観察する。
3. ASCIIまたはテキスト形式で取得したデータセットを保存します。

5。データ解析

1. ビデオやカイ二乗最小化を用いたフィッティング波形のできるデータ解析プログラムにフォトダイオードを使用して取得したデータをインポートする。ここで使用されるプログラムは、（原点ですhttp://www.originlab.com/ ）。スラッシング周波数（ 図4、図5）を決定する正弦曲線にフィット。
2. 平均様々な試料から水泳周波数と偏差値を算出する。この研究では、データは統計的にBonferroniの多重比較検定に続く単一因子分散分析を用いて分析した。 <0.05のp値は統計的に有意であると考えられた。

6。例として、Mathematicaを使ってモデルの回折パターン

注：回折パターンは多くの異なった計算ツールを使ってモデル化することができます。この手順では、このようなMATLAB、Excelなどの別の計算ツール、原産地などに異なります

1. イメージを作成します：伝統的な顕微鏡を用いて顕微鏡スライド上に線虫の画像を撮影。
2. 画像を2値化：輸入ワーム画像'ワーム' iは、Mathematicaに画像をドラッグすることにより、MathematicaはNTO。黒と白の画像（二値化）に画像を変換する。これはMathematicaで "二値化"コマンドを使用して達成することができます：BlackandWhiteImage =値化[ワーム]。画像は、白黒画像として表示することができます。
   EdgeDetect [ワーム、6.0,0.035]、2つの末尾の数字は、結果エッジの粗さを制御：別の方法として、BlackandWhiteImageを作成するために 'EdgeDetect'コマンドを使用します。
3. 0と1の行列に画像を変換する：これは、Mathematicaで'ImageDataを'コマンドを使って達成することができます：マトリックス= ImageDataを[BlackandWhiteImage]。
4. フーリエ変換行列：示さFourierParametersを使用して行列をフーリエ変換し、Mathematicaで"フーリエ変換"コマンドを使用します。FTransform =フーリエ[マトリックス、FourierParameters - > {0、-2}]。
5. 回折行列を取得し、画像のコントラストを向上させるための行列の広場率：絶対値の2乗行列の値と元の画像に対応する回折パターンで得られた画像を、表示します。また、画像のコントラストをスケーリングするために "ログ"機能を使用します。ImageContrast =イメージ[ログ[1 +（ABS ​​[FTransform]）^ 2] / 0.5]。
6. クロップ中央回折パターンを、必要に応じてサイズを変更する：簡単に鑑賞するために画像のサイズを変更する ImageResize [ImageContrast [Y、100]、500]。
7. 自由に泳いでワームから得られた回折パターンとモデル化された回折パターンを比較してください。 （図6）

結果

例として、我々はCを勉強広い石英キュベット1センチ、厚さ5mmと4センチキュベットでエレガンス 。ビデオ分析を使用して単一のワームをサンプリングし、5mm厚のキュベットでのビデオ解析から得られた平均的な水泳周波数は約2.5 Hzのです（ 図4）。同様に、リアルタイムのデータ取得方法を使用して単一のワームをサンプリングし、我々はデジタルオシロスコープ（PicoScope）を使用して、約2.7ヘルツ（ 図5）の水泳周波数を得る。この手順は、多くのワームを繰り返すことができます。自由にワームを泳いでの詳細な研究は、5 mmキュベットで2.37 Hzの平均水泳頻度を明らかにした^。6期待されるように、水泳周波数がクロールワーム（〜0.8 Hz）でのそれよりも高くなっています^。3この回折法を用いて、 Cの平均水泳周波数顕微鏡スライドに限定されている虫は 、2Hzの以前に発行された値と一致することが判明している^。1,7

ve_contentは">次の手順3。）、その後6）従来の顕微鏡を用いて得られたワーム画像の助けを借りて、回折パターンを泳いでのモデリングを可能にします。モデル化された回折パターンは線虫C. elegansのスイムサイクルをシミュレートするために使用されます（ 図6）。成功したモデルでは、水泳の周波数に一致する物理的に実現可能な連続した泳ぎのパターンで構成されていますそれは水泳サイクルの初めにあったようにワームが泳いサイクルの終わりに同じ形状でなければなりません。

図1：グリーンHeNeレーザーは、ライブCを使用して動的な回折パターンを作成するために使用されたエレガンス 。この回折パターンは240 fpsで撮影されました。

図2。ドラ翼は黒のドットは、送信ビームの吸収を増加させる。散乱光によるカメラの彩度が低下し、回折パターンが見えるようになるされています。

図3は、追跡されているワームの回折パターンを持つビデオ解析ソフトウェアのスクリーンショット（ロガープロ）。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図4、図 5 mmのキュベットで線虫のスイムサイクルに対応した映像データ。カーブフィットは〜2.5 Hzの周波数水泳を明らかにする。

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図5。5 mmのキュベットで線虫のスイムサイクルに対応しリアルタイムデータ。カーブフィットは〜2.7 Hzの周波数水泳を明らかにする。

図6は、一番上の行は実際の回折パターンを表し、下の列のモデル化された回折パターンと照合されます。モデル化された回折パターンを顕微鏡スライド（中段）のワームを使用して製造した。

ディスカッション

我々は。リアルタイム運動の測定と顕微鏡の使用を必要としない線虫のような微細な生物の単純な運動器官の行動への新しいアプローチを開発してきた⁸この方法論的アプローチは、原生生物のような多数の微細な生物を研究するために利用することができる。このメソッドは、使用する光の波長によって制限される。生物は光の波長よりも小さくするのも避けるべきでしょう。必要な機器のコスト削減と移植性に加えて、このアプローチの主要なメリットの1つは、顕微鏡下の画像平面の狭い制約を受けることなく、リアルタイムでかつ3次元で動作を測定する機能です。これは、顕微鏡ベースのアプローチを用いて研究することができません行動に対する重力やその他多数の条件の影響を調べるために、この手法でも可能です^。9したがって、私たちは微生物自然歩行behaのより良い理解を得ることができます顕微鏡スライド水滴や特殊なマイクロ流体室（Park ら 、2008）の範囲から解放viors ¹⁰

回折パターンにおける位相情報の欠如は、遠方界回折パターンは、フーリエ変換の絶対値の二乗に比例するので、回折オブジェクトに対応した画像を直接検索することができません。彼らは自由に泳いで線虫（ 図6）の回折パターンと一致させることができるように我々は、したがって、ワーム画像から回折パターンを計算している。

この方法では、本当に自由で水泳の結果が得られているエレガンスとは、水または多くの異なるイオン性溶液のような光学的に透明な環境で演習その任意の微視的な種に適用することができます。従来の顕微鏡は、マイクロメートルのオーダーの焦点深度を用いた研究のみを許可^。11これが限られたためである被写界深度光の焦点を合わせる：

この回折法は、確かに従来の顕微鏡に代わるものではありませんここで、f ナンバーN（C）短い焦点距離が大きいCに関連付けられているように、 錯乱円との相互関係を持っています^。12,13が、それは可能である短期間に種があっても低コストでリアルタイムに操作することができる定量的な結果を提供します。回折パターンは、任意のレーザーポインターを使って取得できます。回折パターンは、通常のデジタルカメラを用いて還元時間分解能で撮影することができます。ユーザが容易に利用可能な顕微鏡またはフォトダイオードを持っていないかもしれないが、そのようなスラッシング周波数を測定し、回折パターンを評価するように、この実験の主要な部分は、非常に低コストで完成させることができる。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
名前	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
543 nmのHe-Neレーザ	メレスグリオ	LGX1	5mW未満の可視範囲内の任意のレーザを用いることができる。
2前面アルミミラー	Thorlabs	PF10-03-F01
ハイスピー​​ドEXILIMカメラ	カシオ
石英キュベット	Starna細胞	21/G/5
LoggerPro（ソフトウェア）	バーニア		http://www.vernier.com/products/software/lp/
Mathematicaの8	ウォルフラム		http://www.wolfram.com/