Quantitative Locomotion Study of Frei Schwimmen Mikroorganismen mittels Laserbeugung

Zusammenfassung

Mikroskopische Organismen wie die frei schwimmenden Nematoden C. elegans Leben und verhalten sich in einem komplexen dreidimensionalen Umgebung. Wir berichten über einen neuartigen Ansatz, der Analyse bietet C. elegans Mit Beugungsmuster. Dieser Ansatz umfasst die Verfolgung der zeitlichen Periodizität Beugungsmuster durch Richten von Laserlicht durch eine Küvette erzeugt.

Zusammenfassung

Böden und Gewässer mikroskopisch kleinen Organismen leben und verhalten sich in einem komplexen dreidimensionalen Umgebung. Die meisten Studien über mikroskopischen Organismus Verhalten, im Gegensatz, durchgeführt wurden, mit Mikroskop-basierte Ansätze, die die Bewegung und das Verhalten zu einem schmalen, fast zweidimensionalen Bildfeld zu begrenzen. ¹ Wir präsentieren einen neuartigen analytischen Ansatz, die Echtzeit-Analyse der bietet frei schwimmende C. elegans in einer Küvette ohne Abhängigkeit von Mikroskop-basierten Geräten. Dieser Ansatz umfasst die Verfolgung der zeitlichen Periodizität Beugungsmuster durch Richten von Laserlicht durch die Küvette erzeugt. Wir messen Schwingungsfrequenzen für frei schwimmen Nematoden.

Die Analyse der Fernfeld-Beugungsmuster zeigt Hinweise auf die Wellenformen der Nematoden. Beugungsordnung ist der Prozess der Biegung um Licht einem Objekt. In diesem Fall Licht gebeugt durch die Organismen. Die Lichtwellen interferieren und können ad bildeniffraction Muster. Ein Fernfeld-oder Fraunhofer, Beugungsmuster gebildet wird, wenn der Bildschirm-to-Objektabstand ist viel größer als der beugenden Objekts. In diesem Fall kann das Beugungsmuster berechnet (Model) werden unter Verwendung einer Fourier-Transformation. ²

C. elegans sind frei lebende Boden lebende Nematoden, die in drei Dimensionen zu navigieren. Sie bewegen sich beide auf einer festen Matrix wie Boden oder Agar in einer sinusförmigen Bewegungsapparates Muster genannt kriechen und in einer Flüssigkeit in einem anderen Muster als Schwimmen. ³ Die Rollen gespielt von sensorischen Informationen mechanosensorischen, chemosensorischen und thermosensory Zellen, die plastischen Veränderungen regieren Bewegungsapparates vorgesehen Muster und schaltet in den Mustern sind erst am Anfang geklärt werden. ⁴ Wir einen optischen Ansatz zu beschreiben, messen Nematoden Fortbewegung in drei Dimensionen, die nicht erfordert ein Mikroskop und wird es uns ermöglichen zu beginnen, um die Komplexität von Nematoden Fortbewegung unter verschiedenen co erkundennditions.

Protokoll

Ein. C. elegans Vorbereitung für Video Analysis

1. Bewegen 10-20 gravid adulte Nematoden an die frische NGM-Agar gefüllte Petrischalen mit einem dünnen, flachen Platindraht Wahl. Die Petrischalen mit der NGM-Agar gefüllt enthalten einen kleinen kreisförmigen Fleck von E. coli (ein Wachstum begrenzte Belastung, OP50, die besten Ergebnisse) für die Nematoden zu essen. Lassen Sie die Nematoden, um Eier für 3-5 Stunden zu legen und entfernen Sie dann die Erwachsenen, wodurch eine kleine, entwicklungspolitisch-synchronisierte Kultur 50-150 Nematoden. Lassen Sie die Nematoden zu frühen Erwachsenenalter durch Inkubation der Petrischalen bei 20 ° C für 4-5 Tage wachsen. Diese Kultur Methoden basieren auf etablierten Verfahren (Stiernagle 2006). ⁵
2. Am Tag der Videoanalyse, spülen eine Platte von jungen Erwachsenen Nematoden mit 1 ml deionisiertes, destilliertes Wasser, so sammeln 50-150 Würmer aus dem synchronisiert Kultur. Eine Pufferlösung wie M9 oder PBS können ebenfalls verwendet werden. Verwenden Sie eine Mikrozentrifuge die w Spinorms dem Boden des Röhrchens, oder es ihnen ermöglichen, durch Schwerkraft für etwa 15 min absetzen. Entfernen Sie den Großteil des Wassers aus der Tube und ersetzen Sie es mit 1 ml entionisiertem, destilliertem Wasser, um eventuell anhaftende Bakterien aus der Nematoden zu waschen.
3. Übertragen Nematoden in Wasser oder Puffer auf eine Quarzküvette mit einer Mikropipette. Es ist wichtig, mit einer geringen Anzahl arbeiten, etwa 5-10 Nematoden insgesamt auf einmal oder sogar weniger, so dass ein Fadenwurm zu einer Zeit ist, die wahrscheinlich vom Laser beleuchtet werden. Wenn die Anzahl von Nematoden auf den Kulturplatten zu groß ist, verdünnt den Würmern in Wasser oder Puffer, bis eine gewünschte Dichte erreicht ist. Es ist auch möglich, einzelne Nematoden zu einem Tropfen Wasser oder Puffer auf einer frischen Agarplatte holen, um sie zu waschen und zu übertragen einzelnen Würmer in die Küvette. In unserer Studie haben wir 1 mm, 2 mm und 5 mm Küvette Größen, die Auswirkungen von physischen Beschränkungen auf Schwimmen Verhalten zu untersuchen.

2. Optischer Aufbau für die Video Analysis

1. Führen Sie ein Setup wie in Abbildung 1 gezeigt, unter Verwendung eines 543 nm (grün) Helium-Neon (HeNe)-Laser, zwei Front-Oberfläche Aluminium Spiegel, einen Küvettenhalter, eine Leinwand, und eine High-Speed-Kamera (Casio High Speed ​​Exilim) Lage der Dreharbeiten bei ~ 240 fps. Die beiden Spiegel verwendet werden, um den Laserstrahl durch die Küvette zu lenken. Unterschiedliche Größen der Küvetten können verwendet werden, abhängig von der Art der Untersuchung sein. Als Beispiel verwendeten wir Küvetten, die 5 mm dick sein, um die Wirkungen von räumlichen Zwängen auf Schwimmen Frequenzen zu erhalten. Der Laserstrahl muss den Anforderungen für Oversampling;. Dh der Organismus nicht mehr als ein Drittel des Laserstrahls zu behindern. Für C. elegans, sollte der Laserstrahl etwa 2 mm im Durchmesser sein, wenn es mit einem Nematoden interagiert. Der Laserstrahl sollte nicht größer als 5 mm im Durchmesser, da das Beugungsmuster wird schwierig zu lokalisieren. Der Abstand von der beugenden Organismus auf dem Bildschirm sollte viel größer alsder Organismus selbst.
2. Ort Parafilm über die Oberseite der Küvette und invertieren Sie die Nematoden in die Wassersäule mischen. Setzen Sie die Küvette in einem Küvettenhalter so dass Würmer sind zunächst in der Nähe der Spitze der Küvette. Verwendung der Spiegel, Lenken des Laserstrahls durch die Mitte der Küvette. Weil die Nematoden dichter als Wasser sind, wird sie langsam zu dem Boden der Küvette fallen, während zur gleichen Zeit schwimmen innerhalb der Wassersäule.
3. Auf dem Projektionsschirm, Farbe der Fleck entsprechend dem übertragenen Laserstrahls schwarz zu reduzieren Streuung als der Sendestrahl trifft den Projektionsschirm (Abbildung 2). Alternativ setzen eine Öffnung in dem Projektionsschirm, damit der Sendestrahl durch das Sieb passieren. Eliminierung oder Reduzierung Streuung von der Sendestrahl hält den CCD-Arrays der Kamera von sättigenden aufgrund der Sendestrahl.
4. Um ein Maß für die Größe des Beugungsmusters erfassen, eine Linie vonetwa 5 cm auf dem Projektionsbildschirm neben der übertragenen Laserstrahlflecks ohne Störung des gebeugten Lichts Bildes.
5. Starten Sie die Aufnahme mit der Kamera während der Raum leuchtet auf, so dass die 5 cm Linie auf dem gleichen Material wie die Beugungsbilder ist. Schalten Sie das Raumlicht aus. Rekord Beugungsbilder auf dem Bildschirm mit der Kamera wie Würmer durch den Laserstrahl passieren.

3. Video Data Preparation

1. Installieren Sie Video-Analyse-Programm (Logger Pro: http://www.vernier.com/products/software/lp/ ) auf dem Computer. Importieren Sie das Video in Video-Analyse-Programm
2. Stellen Sie den Ursprung mit dem übertragenen Laserpunkt zusammenfallen. Stellen Sie die Waage mit dem 5 cm Linie auf die Projektionsfläche.
3. Verfolgen der Winkelverschiebung des Beugungsbildes durch jeden Nematoden mit Hilfe der Video-Analyse-Software ausgebildet (Figur 3)
4. Um die Angulation findenr Verschiebung, indem sie die arctan (y / x), Kopieren und Einfügen von Daten in eine Tabellenkalkulation (Excel) und fügen Sie 180 Grad oder π für alle negativen Winkeln, um eine kontinuierliche Kurve (Figure. 4) zu produzieren.

4. Real Time Data Acquisition für Instant Beobachtung Schwimmen Frequenzen

1. Mit dem gleichen Setup wie bei der Video-Analyse, legen Sie eine Photodiode (DET10A von Thorlabs) mit einer kleinen Fläche (~ 1 mm ²⁾ aus der Mitte in dem Beugungsmuster direkt vor der Projektionsfläche.
2. Schließen Sie die Photodiode zur digitalen Oszilloskop (PicoScope von Pico Technology hergestellt), die an den Computer über USB-Anschluss verbindet. Beachten Sie die Prügel Muster auf dem Computer-Bildschirm.
3. Speichern erworbenen Datensätze im ASCII-oder Text-Format.

5. Data Analysis

1. Importieren Sie die erfassten Daten mit Hilfe von Video-oder die Photodiode in einen Daten-Analyse-Programm in der Lage passende Wellenformen mit Chi-Quadrat-Minimierung. Das Programm dient hier Origin ( http://www.originlab.com/ ). Montieren einer Sinuskurve, Bildfehler-Frequenz (4 und 5) zu bestimmen.
2. Durchschnittliche Schwimmen Frequenzen aus verschiedenen Proben und bestimmen Varianz. Für diese Studie wurden statistisch analysiert mittels eines Single-Faktor ANOVA, gefolgt von der Bonferroni multiple Vergleiche Tests beobachtet. Ein p-Wert von <0,05 wurde als statistisch signifikant.

6. Modell Beugungsmuster mit Mathematica als Beispiel

Hinweis: Beugungsmuster können modelliert mit vielen verschiedenen Rechenwerkzeuge werden. Dieses Verfahren wird für verschiedene Computational Tools wie MatLab, Excel, Origin usw. unterscheiden

1. Image erstellen: Nehmen Sie Bilder von Nematoden auf einem Objektträger mit einem herkömmlichen Mikroskop.
2. Binarisieren Bild: Importieren des Wurms image 'Worm' into Mathematica, indem Sie das Bild in Mathematica. Wandeln Sie das Bild in ein Schwarz-Weiß-Bild (Binärisierungsverfahren). Dies kann mit der 'Binarisieren' Befehl in Mathematica erreicht werden: BlackandWhiteImage = Binarisieren [Worm]. Das Bild kann dann als eine Schwarz-Weiß-Bild angezeigt werden.
   Alternativ können Sie auch den "EdgeDetect 'Befehl, um eine BlackandWhiteImage erstellen: EdgeDetect [Worm, 6.0,0.035], wobei die beiden hinteren Ziffern steuern die Grobheit der entstehenden Kanten.
3. Wandelt Bilder in eine Matrix aus Nullen und Einsen: Dies kann mit dem "ImageData 'Befehl in Mathematica erreicht werden: Matrix = ImageData [BlackandWhiteImage].
4. Fourier-Transformations-Matrix: Verwenden Sie die 'Fourier-Befehl in Mathematica eine Fourier-Transformation der Matrix unter Verwendung der angegebenen FourierParameters: FTransform = Fourier [Matrix, FourierParameters -> {0, -2}].
5. Platz Elastizitätsmodul der Matrix zu erhalten die Beugung Matrix und verbessert den Bildkontrast: Square die absoluteWert der Matrix und das resultierende Bild anzuzeigen, welches das Beugungsmuster entsprechend dem Originalbild ist. Auch die 'Log' Funktion, um den Kontrast des Bildes zu skalieren: ImageContrast = Image [Log [1 + (Abs [FTransform]) ^ 2] / 0,5].
6. Resize Bild für einfache Betrachtung: Crop die zentrale Beugungsmuster und die Größe wie gewünscht: ImageResize [ImageContrast [y, 100], 500].
7. Vergleichen Sie die modellierten Beugungsmuster mit Beugungsmuster von frei schwimmende Würmer erhalten. (Abbildung 6)

Ergebnisse

Als Beispiel untersuchten wir C. elegans in einer Quarzküvette 1 cm breit, 5 mm dicke und 4 cm hoch Küvette. Abtasten eines einzigen Wurm mit Video-Analyse, ist die durchschnittliche Schwimmen Frequenz von Video-Analyse in einem 5 mm dicken Küvette erhalten etwa 2,5 Hz (Abbildung 4). Ebenso Abtasten eines einzigen Wurm mit dem Echtzeit-Datenerfassung Methode erhalten wir einen Swimming Frequenz von etwa 2,7 Hz (Abbildung 5), mit dem digitalen Oszilloskop (PicoScope). Dieser Vorgang kann für viele Würmer wiederholt werden. Eine detaillierte Studie der frei schwimmende Würmer ergab einen durchschnittlichen Schwimmen Frequenz von 2,37 Hz in einem 5 mm Küvette. ⁶ Wie erwartet, ist das Schwimmen höheren Frequenz als bei einer kriechenden Schnecke (~ 0,8 Hz). ³ Mit dieser Beugung Methode, die durchschnittliche Schwimmen Frequenzen eines C. elegans, die auf einen Objektträger eingeschlossen ist, wurde festgestellt, dass die zuvor publizierte Wert von 2 Hz übereinstimmen. ^1,7

ve_content "> folgenden Prozeduren 3.) und dann 6.) erlaubt für die Modellierung des Schwimmens Beugungsmuster mit Hilfe von Schnecken Bilder mit einem herkömmlichen Mikroskop erhalten. Die modellierten Beugungsmuster verwendet werden, um ein Bad Zyklus der C. elegans simulieren ( Abbildung 6). Ein erfolgreiches Modell besteht aus physikalisch Machbaren aufeinander schwimmen Mustern passend zu den Swimming-Frequenzen. Die Schnecke sollte in der gleichen Form am Ende des baden-Zyklus sein, wie es am Anfang des baden-Zyklus war.

Abbildung 1. Ein grüner HeNe-Laser wurde verwendet, um eine dynamische Beugungsmuster mit Live-C erstellen elegans. Dieses Beugungsmuster wurde bei 240 fps gefilmt.

Abbildung 2. Dra Flügel ein schwarzer Punkt erhöht die Absorption des transmittierten Strahls. Sättigung der Kamera durch Streulicht reduziert wird und das Beugungsmuster sichtbar wird.

Abbildung 3. Screen shot der Video-Analyse-Software (Logger Pro) mit einem Wurm Beugungsmuster, das wird verfolgt wird. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 4. Video-Daten entsprechend dem Schwimm-Zyklus eines Nematoden in einem 5 mm Küvette. Die Kurvenanpassung zeigt einen Swimming Frequenz von ~ 2,5 Hz.

"/>
Abbildung 5. Echtzeitdaten entsprechend dem Schwimm-Zyklus eines Nematoden in einem 5 mm Küvette. Die Kurvenanpassung zeigt einen Swimming Frequenz von ~ 2,7 Hz.

Abbildung 6. Die obere Zeile repräsentiert die tatsächliche Beugungsmuster ist und mit den modellierten Beugungsmuster in der unteren Reihe abgestimmt. Die modellierten Beugungsmuster wurden mit Würmern auf einem Objektträger (mittlere Reihe).

Diskussion

Wir haben einen neuartigen Ansatz zur Echtzeit-Messung von Bewegung und einfachen motorischen Verhaltensweisen in mikroskopischen Organismen wie Nematoden, die nicht erfordert den Einsatz von Mikroskopen entwickelt. ⁸ Dieser methodologische Ansatz könnte auch für das Studium zahlreiche mikroskopische Organismen wie Protisten genutzt werden. Diese Methode wird nur durch die Wellenlänge des verwendeten Lichts begrenzt. Der Organismus sollte nicht kleiner sein als die Wellenlänge des Lichts. Zusätzlich zu den Kosteneinsparungen und Portabilität der Geräte benötigt wird, ist ein wesentlicher Vorteil dieses Ansatzes die Fähigkeit, Verhalten in Echtzeit und in drei Dimensionen zu messen, ohne die engen Grenzen von Bildebenen unter dem Mikroskop. Es ist auch möglich mit dieser Technik Einflüsse der Gravitation oder zahlreiche andere Bedingungen auf Verhalten, das nicht studiert mit Mikroskop-basierten Ansätzen werden können zu prüfen. ⁹ So können wir ein besseres Verständnis der Mikroorganismen natürlichen Bewegungsapparates beha zu erreichenviors aus der Enge Objektträger Tröpfchen oder spezialisierte mikrofluidischen Kammern (Park et al, 2008) befreit. ¹⁰

Das Fehlen von Informationen in einer Phase Beugungsmuster nicht zum direkten Abrufen des Bildes entsprechend der beugenden Objekts da das Fernfeld-Beugungsmuster proportional zum Quadrat des Absolutwerts der Fouriertransformation ist erlauben. Wir werden daher Berechnen Beugungsmuster von Schnecke Bilder, so daß sie mit den Beugungsstrukturen der frei schwimmende Nematoden (Abbildung 6) zugeordnet werden kann.

Dieses Verfahren hat für wirklich frei schwimmende C ergab elegans und kann zu jeder mikroskopischen Arten aufgebracht werden, dass Manöver in einem optisch transparenten Umgebung wie Wasser oder viele verschiedene ionische Lösungen. Konventionelle Mikroskope erlauben nur Studien mit einer fokalen Tiefe in der Größenordnung von Mikrometern. ¹¹ Dies ist aufgrund der begrenztenSchärfentiefe beim Fokussieren Licht:

wo die f-Zahl N hat eine wechselseitige Beziehung mit dem Kreis der Verwirrung (c), so dass ein kurzer Brennweite mit einer großen c verbunden ist. ^12,13 Während diese Beugung Methode ist sicherlich kein Ersatz für herkömmliche Mikroskopie ist es in der Lage quantitative Ergebnisse schnell, so dass Arten können sogar in Echtzeit bei niedrigen Kosten manipuliert werden liefern. Die Beugungsmuster kann mit jedem Laserpointer erhältlich. Die Beugungsmuster können zu einem reduzierten zeitlichen Auflösung mit einer normalen Digitalkamera gefilmt werden. Während der Benutzer möglicherweise nicht über ein Mikroskop oder eine Fotodiode ohne weiteres verfügbar sind, können wesentliche Teile dieses Experiments wie das Messen und Auswerten Thrashing Frequenzen Beugungsmuster zu extrem niedrigen Kosten durchgeführt werden.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
543 nm HeNe Laser	Melles Griot	LGX1	Jeder Laser im sichtbaren Bereich bei weniger als 5 mW verwendet werden.
2 Front Surface Aluminum Spiegel	Thorlabs	PF10-03-F01
High Speed ​​Exilim Kamera	Casio
Quarzküvette	Starna Cells	21/G/5
LoggerPro (Software)	Vernier		http://www.vernier.com/products/software/lp/
Mathematica 8	Wolfram		http://www.wolfram.com/