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Method Article
La muerte fetal y perinatal es una característica común en el estudio de las alteraciones genéticas que afectan el desarrollo cardíaco. Alta frecuencia de imágenes por ultrasonido ha mejorado en 2-D y resolución pueden proporcionar información relevante sobre el desarrollo cardíaco temprano y es un método ideal para detectar el impacto en la estructura y función cardíaca antes de la muerte.
Los ratones transgénicos que muestran anormalidades en el desarrollo y la función cardíaca representan una herramienta poderosa para la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la función cardiovascular normal y la base fisiopatológica de la enfermedad cardiovascular humano. La muerte fetal y perinatal es una característica común en el estudio de las alteraciones genéticas que afectan el desarrollo cardíaco 1-3. Con el fin de estudiar el papel de las alteraciones genéticas o farmacológicas en el desarrollo inicial de la función cardiaca, la ecografía del feto vivo se ha convertido en una herramienta importante para la detección temprana de anomalías y longitudinal de seguimiento. Imágenes por ultrasonido no invasiva es un método ideal para la detección y el estudio de las malformaciones congénitas y el impacto en la función cardiaca antes de la muerte 4. Se permite el reconocimiento precoz de anormalidades en el feto de vida y de la progresión de la enfermedad puede ser seguida en el útero con estudios longitudinales 5,6.Hasta hace poco, la imagen del corazón de ratón fetal frecuentemente involucrados métodos invasivos. El feto tenía que ser sacrificado para realizar microscopía de resonancia magnética y microscopía electrónica o quirúrgicamente entregado por microscopía transiluminación. Una aplicación de sondas de alta frecuencia convencional con 2-D y pulsos de onda Doppler se ha demostrado para proporcionar mediciones de la contracción cardíaca y la frecuencia cardiaca durante el desarrollo embrionario con bases de datos de los cambios normales de desarrollo disponibles actualmente 6-10. Modo M proporciona además importantes datos funcionales, aunque, los planos de imagen adecuados son a menudo difíciles de obtener. Alta frecuencia de imágenes por ultrasonido del feto ha mejorado la resolución 2-D y puede proporcionar información relevante sobre el desarrollo temprano de las estructuras cardiacas 11.
1. Preparación Ratones de Imagen
Consideraciones técnicas
La adquisición de ecocardiogramas fetales puede ser un reto. Los datos obtenidos de estos estudios pueden confundirse debido a la respuesta al estrés tanto de la madre y el feto. Idealmente, la temperatura del animal debe ser mantenida usando una plataforma de imágenes calentada, circulando almohadilla de calentamiento, el calentamiento lámparas, o mantas autorregulado de calefacción. Además, el uso rutinario de un gel acústico calentada se recomienda. Alaunque la principal preocupación en materia de control de la temperatura corporal es evitar la hipotermia, la hipertermia desarrollo debe ser igualmente preocupante. Un aparato de calentamiento sin control tal como una almohadilla de calentamiento simple o la presencia de cerca de iluminación de halógeno puede resultar en elevación rápido y peligroso de la temperatura corporal. Desde considerables fluctuaciones de la temperatura del cuerpo en cualquier dirección pone al animal en peligro todos los esfuerzos deben hacerse para mantener la temperatura normal del cuerpo.
El ecografista adquisición de las imágenes tiene que evitar una presión excesiva en la cavidad con el transductor, ya que el peso del transductor por sí solo puede resultar en la función cardiaca alterada. La duración de la adquisición de la imagen también debe mantenerse a un mínimo (idealmente menos de una hora) con el fin de reducir los cambios fisiológicos y hemodinámicos resultantes de sedación prolongada. Además, la longitud de tiempo y la exposición al isoflurano para cada estudio debe mantenerse a un minimudebido a los posibles efectos teratogénicos de isoflurano 12 m.
2. Identificación de embriones
Consideraciones técnicas
Mientras que la operación del dispositivo de la sonda es factible en ecocardiografía ratón adulto, no operación manual en formación de imágenes fetal en recomendado. Identificación de los fetos se complica por la naturaleza variable de la ubicación uterino, tortuosidad, y el movimiento. Para minimizar las dificultades con localización feto, el uso del transductor estacionario (Figura 1) con un movimiento mínimo más allá del plano horizontal de la presa es esencial.
3. Evaluación de la Estructura y Función
Consideraciones técnicas
Identificación de los cham izquierda y derechabros puede ser difícil la formación de imágenes cardiaca fetal debido a las dimensiones similares de cámaras ventriculares durante el desarrollo. Una estrategia consiste en establecer la orientación fetal derecha e izquierda en tiempo real moviendo la plataforma de formación de imágenes en el plano horizontal. Identificación del hocico, yemas de las extremidades y la columna vertebral le ayudará a identificar la orientación let / derecha del feto. Si es posible, el seguimiento de la pista de salida para el arco o la visualización de la bifurcación principal de la arteria pulmonar permitirá la identificación del tracto de salida ventricular izquierdo o tracto de salida derecho respectivamente. Para cada feto estudiado, es importante tener en cuenta la decidida orientación de izquierda a derecha en las imágenes guardadas.
Mensaje de imágenes de Animal Control y Cuidado
Después de la terminación de formación de imágenes, la presa se devuelve a la caja apropiada y controlada de acuerdo con la norma institucional post-procedimiento de protocolo.Analgesia siguiendo este procedimiento de imagen no es necesario. La plena reanudación de la actividad normal se puede prever un plazo de cinco minutos.
4. Resultados representativos de Ecocardiografía Fetal
El desarrollo de sondas de alta frecuencia (por encima de 8 MHz), han permitido que los equipos ecocardiográficos comercial para tener una resolución axial de aproximadamente 0,2 mm con una resolución lateral de 0,3 mm cuando la imagen se amplia y adquirida a una profundidad de 1 cm. La mayoría de los transductores desarrollados recientemente son lineales que tienen la ventaja de evitar artefactos cerca de campo. Alta frecuencia (30-50 MHz) sondas mecánicas se han desarrollado recientemente que son adecuados para el pecho murino y la frecuencia cardíaca, lo que permite una resolución axial de aproximadamente 50 micras, con una profundidad de 5-12 mm. Más recientemente, estas sondas de alta frecuencia mecánicos han añadido capacidades de Doppler del color que permite una evaluación completa de la función ventricular y valvular y la identificación de scaza lesiones en el corazón fetal. Los métodos descritos aquí se realizan en un sistema VisualSonics Vevo 770 y se puede aplicar a casi todos los sistemas equivalentes. Disponible en el mercado actual de ultra-alta frecuencia de ultrasonido sistema puede operar a 40 Hz con profundidad de imagen máxima de 7 a 14 mm, con un máximo de 60 mm lateral y de 50 a 100 mm resolución axial (Vevo770, VisualSonics, Inc.). Esto se compara con 60 Hz y 20 mm de profundidad de imagen, con axial de 50 mm a 100 y 200 a 500 mm de resolución lateral con el sistema de ultrasonido Acuson Sequoia clínica.
Dado el pequeño tamaño del corazón fetal de ratón, estudios ecocardiográficos fetales en ratones están técnicamente difícil. A diferencia de la ecocardiografía en ratones adultos, el ecografista debe utilizar aviones no convencionales de formación de imágenes por ultrasonido definidos por los ejes del cuerpo del feto. Tortuosidad del útero también afecta a la orientación del feto y debe ser tomado en consideración. Además, la limitación inherente en la profundidad de penetración de ultrun ultrasonido de alta-frecuencia puede hacer que sea difícil de imagen en todas las muestras de embarazos con un gran número de fetos.
Una estrategia de formación de imágenes por ultrasonido permite la detección de alto rendimiento para los defectos cardiovasculares congénitos y extracardíacas 7. Más allá del estudio de las alteraciones genéticas, esta técnica se puede utilizar para detectar defectos en farmacológica y estudios de toxicología. Esta metodología también se puede utilizar como una herramienta de orientación para los procedimientos de intervención, tales como inyecciones o en la medición de las presiones ventriculares 13.
La naturaleza no invasiva de la ecografía fetal es ventajoso, no sólo debido a que permite la función cardiovascular se evaluaron en condiciones fisiológicas, sino también porque este proporciona información crítica fenotípica en tiempo real. Examen longitudinal de corazones embrionarios, aunque técnicamente es posible, sigue siendo un reto por varias razones. Examen de serie del mismo feto y identification del feto mismo en cada examen es un reto en la ausencia de un defecto estructural evidente. Movimiento del útero y el feto puede cambiar completamente la orientación de la muestra y por lo tanto hacer el seguimiento longitudinal y mediciones de seguimiento difíciles 14.
Aunque la ecocardiografía es una técnica de gran alcance para la identificación de anomalías cardíacas, el diagnóstico específico de los defectos cardíacos estructurales requiere fenotipo más detallado por necropsia e histopatología 15. Correlación genotipo y de un feto específica requiere fetos cosecha por histerotomía, preferiblemente inmediatamente después de un estudio de eco y mientras la presa sigue siendo anestesiado para minimizar los cambios de orientación y ubicación del embrión.
Los valores normales de dimensiones de la cámara y la función se ha informado de embriones de ratones y de los usuarios de esta técnica se recomienda revisar las referencias citadas para estos valores 6-10. Valoraciónde la morfología valvular está limitado por resolución de la imagen, sin embargo, las mediciones de las dimensiones anulares y las mediciones de velocidad a través de los grandes vasos es factible incluso tan pronto como ED 9,5. Se debe tener cuidado para obtener una alineación adecuada con el flujo sanguíneo y el transductor 10, 16.
Cabe destacar que las dimensiones cardíacas variar de acuerdo con ratones cepas, género y edad, y cambiar rápidamente en diferentes puntos de tiempo embrionarias y ritmos cardíacos. Es importante verificar que los grupos de ratones se emparejan para estos parámetros. Imágenes fetal varía según la cepa de ratón también. Por ejemplo, el CD-1 embarazada presa rutinariamente contiene más embriones en comparación con la cepa C57/BL6 y por lo tanto puede ser más difícil de visualizar todos los especímenes. Por estas razones, el uso de edad y controles de la misma cepa para cada experimento se debe utilizar en lugar de los valores de referencia. Además, las mediciones de parámetros individuales tales como ventricular izquierda diastólica final dimensión y posteriorespesor de pared puede variar en ratones normales de hasta 25% 8.
Figura 1. Descripción general de configuración utilizando VisualSonics Vevo sistema 770. (A) VisualSonics sistema ferroviario integrado con unidad de monitorización fisiológica. (B) El ratón se posiciona correctamente y moderación en el tablero de la calefacción. Los cuatro miembros son grabadas en los electrodos de ECG. (C) Esquema de ratón embarazadas y el diseño de embriones. El número de embriones dentro de cada cuerno del útero puede variar significativamente, además de la orientación del feto. (D) Una presa posicionado en la plataforma de formación de imágenes con flechas señalando los planos de manipulación (eje X y eje Y-) para mover la presa para la imagen. El eje Z se refiere al movimiento del transductor hacia arriba y hacia abajo (como se indica por la flecha en el panel B). B, vejiga, L, izquierda, R, right.
Figura 2. Representante modo b-imágenes. Esta cifra contiene representativas modo b-imágenes del día embrionario 14,5 feto. (A) Visualización de dos fetos vecinos. Las cajas indican la ubicación del corazón fetal. (B) referencias anatómicas en el feto para guiar la orientación. Día embrionario 14,5 corazón en una vista de cuatro cámaras (C), de eje corto de los ventrículos izquierdo y derecho (D), el tracto de salida del ventrículo derecho y la arteria pulmonar (AP) (E), y el tacto de salida del ventrículo izquierdo (TSVI) y la aorta (F).
Figura 3. Representante evaluación de la función ventricular. Esta figura contiene representanteimágenes de ecocardiografía 2D de la vista de eje largo del corazón en el día embrionario 14,5 (A), y una vista de cuatro cámaras (B). (C) M-modo de rastreo con líneas que indican el diámetro del ventrículo izquierdo y derecho interno en diástole (R / DDVI) y sístole (R / LVIDs) desde el plano de cuatro cámaras de imagen. Septum interventricular (IVS) también se visualiza.
Figura 4. Representante evaluación Doppler. Esta figura contiene imágenes representativas de la ecocardiografía 2D del día embrionario 14,5 corazón en una apical de cuatro cámaras (A). La aurícula izquierda y la cavidad ventricular izquierda se han esbozado. (B) Colocación Representante de Pulso volumen de muestra Doppler para la grabación de flujo mitral. (C) de flujo de entrada mitral patrones Doppler de la que VelocIT diastólica precozy (denotado "E") y la contracción auricular (denotado "A") se puede medir velocidades. (D) Representante aórtica Doppler de onda. Aórtica Doppler chorro se puede utilizar para medir el tiempo de eyección (ET). La frecuencia cardiaca (HR) se puede calcular a partir de la medición de flujo de un ciclo al siguiente ciclo de flujo. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 5. Representante detección del defecto ventricular septal. Esta figura contiene representativas modo b-imágenes del día embrionario 14,5 corazón en una apical de cuatro cámaras (A) con las cavidades ventriculares derecha e izquierda descritos en (B). Obsérvese la presencia del tabique interventricular. (C) Sección transversal de corazón formado la imagen se tiñeron con hematoxilina y eosina.(D) B-modo de imagen de día embrionario 14,5 corazón con un defecto ventricular sépalo (VSD) indicada por la flecha. (E) cavidades ventriculares derecha e izquierda se indican con la colocación superpuesta de volumen de muestra de pulso Doppler de onda para la grabación de flujo a través de la septum interventricular. (F) Sección transversal tiñeron con hematoxilina y eosina de corazón formado la imagen después de recuperación de muestras. (G) Superpuesta colocación de pulso volumen de muestra Doppler de onda para la grabación de flujo a través del tabique interventricular. (H) Representante Doppler rastreo a partir de (G) demostrando el flujo desde la izquierda al ventrículo derecho. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
La capacidad de realizar mediciones en serie y para detectar los fetos mutantes con defectos cardíacos pone de manifiesto la utilidad de la ecocardiografía para investigar el desarrollo cardiovascular normal y anormal. Análisis de la estructura y la función cardíaca in vivo se ha convertido en una parte integral en la descripción de las modificaciones genéticas y no genéticas para el desarrollo normal del feto. La disponibilidad de 2D guiada por Doppler hace que sea posible controlar la frecuencia cardi...
No hay conflictos de interés declarado.
GHK es apoyado por el NIH / NHLBI K08-HL098565 y el Instituto de Investigación Cardiovascular de la Universidad de Chicago. Todos los métodos experimentales descritos son aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de la Universidad de Chicago.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Vevo 770 Imaging System | VisualSonics | (Toronto, Canadá) | |
RMV707B.15-45 MHz transductor | |||
Tec 3 vaporizador isoflurano | |||
Isoflurano (2-cloro-2-(difluorometoxi) -1,1,1-trifluoro-etano) |
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