Murin échocardiographie fœtale

Résumé

Mort foetale et périnatale est une caractéristique commune lors de l'étude des altérations génétiques qui affectent le développement cardiaque. L'imagerie ultrasonore haute fréquence a permis d'améliorer la résolution 2-D et peut fournir d'excellents renseignements sur le développement cardiaque précoce et est une méthode idéale pour détecter l'impact sur la structure et la fonction cardiaques avant son décès.

Résumé

Les souris transgéniques présentant des anomalies dans le développement et la fonction cardiaques constituent un outil puissant pour la compréhension des mécanismes moléculaires qui sous-tendent à la fois la fonction normale cardio-vasculaires et les bases physiopathologiques de la maladie cardio-vasculaire humaine. Mort foetale et périnatale est une caractéristique commune lors de l'étude des altérations génétiques affectant le développement cardiaque ^1-3. Afin d'étudier le rôle des altérations génétiques ou pharmacologiques dans le développement précoce de la fonction cardiaque, échographie du fœtus vivant est devenu un outil important pour la reconnaissance précoce des anomalies et suivi longitudinal. Échographie non invasive est une méthode idéale pour la détection et l'étude des malformations congénitales et l'impact sur ​​la fonction cardiaque avant son décès ^4. Il permet la détection précoce des anomalies chez le fœtus vivant et la progression de la maladie peut être suivie in utero à des études longitudinales ^5,6.Jusqu'à récemment, l'imagerie du cœur de foetus de souris souvent en cause des méthodes invasives. Le fœtus devait être sacrifié pour effectuer la microscopie par résonance magnétique et microscopie électronique ou chirurgicalement livré pour la microscopie transillumination. Une application de sondes à haute fréquence avec classique 2-D et pulsé Doppler imagerie a été montré pour fournir des mesures de la contraction cardiaque et la fréquence cardiaque au cours du développement embryonnaire avec des bases de données normales changements développementaux sont maintenant disponibles ^6-10. M imagerie en mode dispose en outre d'importantes données fonctionnelles, bien que, les plans d'imagerie appropriées sont souvent difficiles à obtenir. L'imagerie ultrasonore haute fréquence du fœtus s'est améliorée 2-D et la résolution peuvent fournir d'excellents renseignements sur le développement précoce des structures cardiaques ^11.

Protocole

1. Préparation de souris pour l'imagerie

1. Avant l'examen d'imagerie, anesthésier le barrage (2-3% d'isoflurane) dans la chambre d'admission. Sortir l'animal de la chambre d'admission et immédiatement placer le museau à l'intérieur d'un cône de nez relié au système d'anesthésie. Enlever la fourrure du niveau de la poitrine à la mi membres inférieurs (voir figure 1) avec une tondeuse cheveux. Enlever les poils du corps restant de crème dépilatoire. Crème dépilatoire peut également être utilisé sans tondeuses à cheveux, et doit être soigneusement rincé de la peau après utilisation pour éviter les irritations.
2. Placez la souris anesthésiée dans une position couchée sur un coussin chauffant intégré avec dérivations ECG afin de maintenir la température du corps (figure 1). Appliquer le gel d'électrode sur les quatre pattes et collez-les à des électrodes ECG.
3. Obtenir un niveau de sédation état ​​stable tout au long de la procédure (1,0% à 1,5% d'isoflurane mélangé avec 100% d'O _2). Le niveau d'anesthésie peut être ajusté à maintenir une fréquence cardiaque cible de 450 ± 50 battements par minute (bpm). Une attention particulière devrait être accordée à minimiser la dose de la durée de la sédation et de l'isoflurane à moins d'une heure.
4. Insérez doucement une sonde rectale (après graissage) pour surveiller la température du corps par l'intermédiaire du coussin chauffant. Il est important de maintenir la température du corps dans une fourchette étroite (37,0 ° C ± 0,5 ° C). Contrôlée anesthésie et de la température corporelle constante est essentielle pour la stabilité hémodynamique de la mère et le fœtus.

Considérations techniques

L'acquisition de l'échocardiographie fœtale peut être difficile. Les données obtenues à partir de ces études peuvent confondu en raison de la réponse au stress à la fois la mère et le fœtus. Idéalement, la température des animaux doit être maintenu à l'aide d'une plate-forme d'imagerie chauffée, circulant coussin chauffant, chauffage, lampes ou des couvertures chauffantes autorégulée. En outre, l'utilisation systématique d'un gel acoustique chauffé est recommandé. Alsi la préoccupation principale en ce qui concerne le contrôle de la température corporelle est d'éviter l'hypothermie, apparition d'une hyperthermie devrait être une préoccupation d'égalité. Appareil de chauffage sans surveillance comme un coussin chauffant simple ou la présence de proximité à l'éclairage halogène peut entraîner une élévation rapide et dangereuse de la température corporelle. Depuis importantes fluctuations de température du corps dans les deux sens met l'animal à risque, tous les efforts devraient être faits pour maintenir la température normale du corps.

L'échographiste l'acquisition des images doit éviter de placer une pression excessive sur la cavité avec le transducteur, étant donné le poids du transducteur seul peut donner lieu à une fonction cardiaque altérée. La durée d'acquisition des images doit également être maintenue à un minimum (idéalement moins d'une heure) afin de réduire les changements physiologiques et hémodynamiques résultant de sédation prolongée. En outre, la durée et l'exposition à l'isoflurane pour chaque étude doit être maintenue à un minimuà cause des effets tératogènes de ¹² m isoflurane.

2. L'identification des embryons

1. Imaging est démarré en utilisant la vessie de la mère comme un point de repère, avec des foetus sur les cornes utérines gauche et droite étiquetés comme L1, 2,3, etc (côté gauche) et R1, 2,3, etc (à droite) (voir figure 1C). Notation de l'emplacement fœtus est utile pour la récupération des échantillons après l'imagerie.
2. Les échantillons situés trop profondément dans l'abdomen sont scannés afin de documenter leur présence, mais sont exclus de l'analyse des données en raison de faible résolution. La possibilité de numériser des embryons adjacentes peuvent aider les fœtus de suivi (figure 2A).
3. Plans de balayage sont modifiées par modification de l'orientation de la souris par rapport au plan de balayage. Les images sont obtenues en 2 plans orthogonaux pour chaque fœtus (figure 2). Un effort est fait pour obtenir des vues transversales, rapprochant les plans frontal, sagittal ou s, maisarfois est limitée à des plans obliques par la position de l'utérus dans l'abdomen. La rotation de la tête de lecture permettra également la modification de l'orientation sans déplacer le barrage.

Considérations techniques

Même si le fonctionnement de poche de la sonde est faisable en échocardiographie souris adulte, le fonctionnement de poche dans l'imagerie fœtale n'est pas recommandé. Identification des fœtus est compliquée par la nature variable de l'emplacement de l'utérus, la tortuosité, et le mouvement. Afin de minimiser les difficultés de localisation du fœtus, l'utilisation de transducteur stationnaire (figure 1) avec un minimum de mouvements au-delà du plan horizontal du barrage est essentielle.

3. L'évaluation de la structure et de la fonction

1. Numérisation des images en mode b sont utilisés pour identifier les structures de base cardiaques tels que les oreillettes, le septum interventriculaire, cavités ventriculaires, et les voies d'évacuation gauche et droite (figure 2).
2. M-mode images sont obtenus à partir de la vue et l'axe court est utilisé pour mesurer l'épaisseur de paroi ventriculaire et dimensions de la chambre (figure 3). Si l'alignement correct ne peut être obtenu en raison de mensonge fœtale, les mesures de b en mode images peuvent être utilisées pour quantifier% de matière grasse fractionnée (FS). Changements temporels entre LV en fin de systole dimension (LVESD) et VG en fin de diastole dimension (LVEDD) tout au long du cycle cardiaque sont utilisées pour le calcul de la fraction de raccourcissement (FS), comme suit:
   % FS = [(LVEDD - LVESD) / LVEDD] x 100
3. Les ventricules gauche et droit sont identifiés par balayage de la tête à la queue. Les côtés gauche et droit doivent être annotées. Courants d'écoulement visible générée par le sang du foetus échogène facilite un positionnement précis du volume d'échantillonnage Doppler à l'intérieur de l'orifice mitral. Gauche vitesse du flux entrant ventriculaire est obtenu à partir des valves mitrales dans apicale quatre cavités et des vues LV grand axe (figure 4, C). Mesures d'écoulement aortique peut être utilisé pour mesurer systotemps d'éjection public (Figure 4, D). La fréquence cardiaque peut être calculé à partir de la mesure de débit d'un cycle au cycle suivant de flux (figure 4, C et D). Des précautions doivent être prises pour aligner la circulation sanguine et le faisceau Doppler afin de minimiser l'angle Doppler. Valeurs prises au-delà d'un angle de 60 degrés sont inexactes et doivent être évités.
4. Numérisation des images en mode b sont utilisés pour identifier structurelles communes des anomalies congénitales comme les anomalies septales ventriculaires (figure 5). Le volume d'échantillonnage Doppler dans les ventricules peut être utilisé pour identifier les flux à travers le septum ventriculaire. D'autres paramètres qui sont facilement contrôlés incluent la taille du fœtus, la fréquence cardiaque, la vitesse d'écoulement, épanchement péricardique, anasarque et. Le diagnostic définitif de certaines malformations cardiaques nécessite une évaluation additionnelle par autopsie et l'histopathologie.

Considérations techniques

Identification des cham gauche et à droitebres peut être difficile en imagerie cardiaque fœtale en raison des dimensions similaires de cavités ventriculaires au cours du développement. Une stratégie consiste à établir une orientation droite et à gauche du foetus en temps réel en déplaçant la plate-forme de formation d'image dans le plan horizontal. Identification du museau, les bourgeons des membres et du rachis aidera à identifier l'orientation let / droite du foetus. Si possible, le suivi de la piste d'évacuation à l'arc ou la visualisation de la bifurcation de l'artère principale pulmonaire permettra l'identification de la voie d'éjection ventriculaire gauche ou droite, respectivement voie efférente. Pour chaque fœtus étudiés, il est important de noter le déterminé orientation gauche-droite sur les images enregistrées.

Surveillance des animaux de post-imagerie et des Soins

Après l'achèvement de formation d'image, le barrage est renvoyée au carter approprié et contrôlé selon la norme institutionnelle post-procédure de protocole.Analgésie après cette procédure d'imagerie n'est pas nécessaire. Reprise totale de l'activité normale peut être prévu dans les cinq minutes.

4. Les résultats représentatifs de l'échocardiographie fœtale

Le développement de sondes de haute fréquence (supérieure à 8 MHz), ont permis à l'équipement commercial de l'échocardiographie d'avoir une résolution axiale de l'ordre de 0,2 mm avec une résolution latérale de 0,3 mm lorsque l'image est agrandie et acquis à une profondeur de 1 cm. La plupart des capteurs développés récemment sont linéaires qui ont l'avantage d'éviter les artefacts de terrain à proximité. Haute fréquence (30-50 MHz) mécaniques sondes ont été récemment développés qui sont appropriés à la poitrine murin et le rythme cardiaque, ce qui permet une résolution axiale d'environ 50 um à une profondeur de 5-12 mm. Plus récemment, ces sondes de haute fréquence mécaniques ont ajouté des capacités Doppler couleur permettant une évaluation complète de la fonction valvulaire du ventricule et de l'identification et de schasse lésions dans le coeur du foetus. Les méthodes décrites ici sont effectuées sur un système VisualSonics Vevo 770 et peut être appliqué à presque tous les systèmes équivalents. Courant disponible dans le commerce à ultra-haute fréquence ultrasonore système peut fonctionner à 40 Hz avec une profondeur maximale d'imagerie de 7 à 14 mm, avec un maximum de 60 mm et latéral de 50 à 100 mm axial résolution (Vevo770, VisualSonics, Inc.) Cela se compare à 60 Hz et 20 mm de profondeur d'imagerie, avec 50 à 100 mm et axiale de 200 à 500 mm résolution latérale avec le système à ultrasons clinique Acuson Sequoia.

Compte tenu de la petite taille du cœur du fœtus de souris, des études échocardiographiques fœtales chez la souris sont techniquement difficiles. Contrairement à l'échocardiographie chez des souris adultes, l'échographiste doit utiliser des avions non conventionnelles d'imagerie par ultrasons définis par les axes du corps du fœtus. Tortuosité de l'utérus affecte également l'orientation du foetus et doit être pris en considération. En outre, la limitation inhérente à la profondeur de pénétration de l'ultrune haute fréquence à ultrasons peut rendre difficile à l'image de tous les échantillons dans les grossesses avec un grand nombre de foetus.

Une stratégie de l'échographie permet le criblage à haut débit pour les anomalies congénitales cardiovasculaires et extracardiaque ^7. Au-delà de l'étude des altérations génétiques, cette technique peut être utilisée pour dépister les défauts pharmacologiques et toxicologiques. Cette méthodologie peut également être utilisé comme un outil d'orientation pour les procédures interventionnelles telles que des injections ou de mesure de ¹³ pressions ventriculaires.

Le caractère non invasif de l'échographie fœtale est avantageux, non seulement parce qu'elle permet la fonction cardiovasculaire être évaluée dans des conditions physiologiques, mais aussi parce que cela fournit des informations critiques en temps réel phénotypique. Examen longitudinal des cœurs embryonnaires, bien que techniquement possible, reste difficile pour plusieurs raisons. Examen en série de la même fœtus et identification du fœtus même à chaque examen est difficile en l'absence d'un défaut évident de structure. Mouvement de l'utérus et le fœtus peut changer complètement l'orientation de l'échantillon et ainsi faire un suivi longitudinal et de suivi des mesures difficiles ^14.

Bien que l'échographie est une technique puissante pour l'identification des anomalies cardiaques, le diagnostic spécifique de malformations cardiaques structurelles nécessite phénotypage plus en détail par autopsie et l'histopathologie ^15. Corrélation génotype du fœtus et une récolte spécifique nécessite fœtus par hystérotomie, de préférence immédiatement après une étude écho et tandis que le barrage est encore anesthésié afin de minimiser les changements d'orientation et l'emplacement embryon.

Les valeurs normales pour dimensions de la chambre et de la fonction ont été rapportés chez les souris embryonnaires et les utilisateurs de cette technique sont invités à consulter les références citées pour ces valeurs ^6-10. Évaluationde la morphologie valvulaire est limitée par la résolution d'image, mais les mesures de dimensions annulaires et les mesures de vitesse par les gros vaisseaux est possible, même le plus tôt ED 9,5. Des précautions doivent être prises pour obtenir un alignement adéquat avec le flux sanguin et le transducteur ^{10, 16.}

Il convient de souligner que les dimensions cardiaques varient selon les souches des souris, le sexe et l'âge, et rapidement changer à différents points dans le temps embryonnaires et la fréquence cardiaque. Il est important de vérifier que des groupes de souris sont appariés pour ces paramètres. L'imagerie fœtale varie selon la souche de souris aussi. Par exemple, le CD-1 enceinte barrage contient habituellement plus d'embryons par rapport à la souche C57/BL6 et peut donc être plus difficile de visualiser tous les spécimens. Pour ces raisons, l'utilisation de l'âge et de la souche témoins appariés pour chaque expérience doit être utilisé à la place de valeurs de référence. En outre, des mesures de paramètres individuels tels que télédiastolique ventriculaire gauche et postérieur dimensionépaisseur de la paroi peut varier chez les souris normales jusqu'à 25% ^8.

Figure 1. Vue d'ensemble de mise en place à l'aide VisualSonics Vevo 770 système. (A) du système ferroviaire intégré VisualSonics avec unité de surveillance physiologique. (B) La souris est positionné correctement et de retenue sur la plaque chauffante. Les quatre membres sont collées dans les électrodes ECG. (C) Schéma de souris enceinte et la disposition des embryons. Le nombre d'embryons à l'intérieur de chaque corne utérine peuvent varier considérablement, en plus de l'orientation du foetus. (D) un barrage placé sur la plate-forme de formation d'image avec des flèches en notant les plans de manipulation (axe X et axe Y) de se déplacer le barrage pour l'imagerie. L'axe Z désigne le déplacement du transducteur vers le haut et vers le bas (comme indiqué par la flèche dans le panneau B). B, de la vessie, L, gauche, R, right.

Figure 2. Représentant b images en mode. Ce chiffre contient représentatives b images en mode de jour 14,5 foetus embryonnaire. (A) Visualisation de deux fœtus voisins. Boîtes indiquer l'emplacement du cœur fœtal. (B) points de repère anatomiques chez un foetus de guider l'orientation. Embryonnaire jour 14,5 coeur d'une à quatre chambres vue (C), petit axe vue des ventricules gauche et droit (D), le droit de chasse du ventricule et l'artère pulmonaire (AP) (E), et à gauche le tact d'éjection du ventricule (LVOT) et l'aorte (F).

Figure 3. Représentant l'évaluation de la fonction ventriculaire. Ce chiffre contient représentantimages de l'échographie 2D de la vue grand axe du cœur au jour embryonnaire 14,5 (A), et une vue à quatre cavités (B). (C) M-mode de traçage avec des lignes indiquant diamètre ventriculaire gauche et la droite interne à la diastole (R / LVIDd) et la systole (R / LVIDs) par rapport au plan d'image chambre de quatre. Septum interventriculaire (SIV) est également visualisée.

Figure 4. Représentant doppler. Ce chiffre contient des images représentatives de l'échocardiographie 2D de la journée 14,5 coeur embryonnaire dans un apicale quatre cavités (A). L'oreillette gauche et de la cavité ventriculaire gauche ont été décrites. Représentant de placement (B) de Pulse vague volume d'échantillon Doppler pour l'enregistrement du flux mitral. (C) mitrale afflux modes Doppler des vitesses, à partir de laquelle protodiastoliquey (notée «E») et de la contraction auriculaire (notée «A») les vitesses peuvent être mesurées. (D) représentant aortique Doppler d'onde. Doppler aortique jet peut être utilisé pour mesurer le temps d'éjection (HE). Fréquence cardiaque (FC) peut être calculée à partir de la mesure de débit d'un cycle au cycle suivant de flux. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 5. Détection représentatif de communication interventriculaire. Ce chiffre contient représentatives b images en mode de jour 14,5 coeur embryonnaire dans un apicale quatre cavités (A) avec les cavités ventriculaires droite et gauche décrits en (B). A noter la présence du septum interventriculaire. (C) Coupe transversale de cœur imagé colorées à l'hématoxyline et à l'éosine.(D) image en mode B de la journée 14,5 coeur embryonnaire avec une malformation du ventricule sépales (VSD) indiqué par la flèche. (E) des cavités ventriculaires droite et gauche sont décrits avec le placement de superposition onde de pouls volume d'échantillon Doppler pour l'enregistrement du flux à travers la septum interventriculaire. (F) Coupe transversale colorées à l'hématoxyline et à l'éosine de cœur imagé après le prélèvement des échantillons. (G) superposé placement d'onde de pouls volume d'échantillon Doppler pour l'enregistrement du flux à travers le septum interventriculaire. (H) représentant Doppler traçage de (G) démontrant flux de la gauche vers le ventricule droit. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Discussion

La possibilité d'effectuer des mesures en série et de détecter les fœtus mutants atteints de malformations cardiaques souligne l'utilité de l'échocardiographie pour étudier le développement normal et anormal cardiovasculaire. Analyse de la structure et la fonction cardiaques in vivo est devenue une partie intégrante de la description des modifications génétiques et non génétiques pour le développement normal du fœtus. La disponibilité de 2D guidée par Doppler permet de surveiller le...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 770 Imaging System	VisualSonics		(Toronto, Canada)
Transducteur RMV707B.15-45 MHz
Tec 3 Vaporisateur isoflurane
Isoflurane (2-chloro-2-(difluorométhoxy) -1,1,1-trifluoro-éthane)